人α1,2岩藻糖苷转移酶基因在猪动脉内皮细胞的表达

目的通过基因工程技术使人α1,2岩藻糖苷转移酶(HT)基因在猪动脉内皮细胞(PAEC)表达,削减异种抗原αGal的表达。方法构建pcDNA3HTcDNA重组质粒,体外培养PAEC,脂质体转染法将pcDNA3HTcDNA转染PAEC,新霉素(G418)筛选具有抗性的细胞克隆,对其用PCR检测重组质粒的整合,流式细胞术(FCM)检测转染细胞H抗原和异种抗原αGal的表达。分别以未转染的PAEC和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为对照。结果重组质粒转染PAEC经筛选得到抗性细胞克隆,PCR扩增出人HT基因片段,FCM检测转染细胞H抗原表达升高,αGal表达明显降低。结论成功构建了pcD NA3HTcDNA重组质粒,并使人HT基因在PAEC表达,抑制了αGal的合成。     

胃癌下调全长基因GDDR的克隆及与胃癌关系的研究

目的　从成功建立的用于筛选胃癌下调新基因的抑制消减杂交cDNA文库中克隆全长新基因 ;检测其在胃癌及正常胃黏膜组织中的表达 ,分析其在胃癌发生发展中的作用。方法　随机挑选阳性克隆测序筛选基因片段 ,cDNA末端快速扩增得到其全长。在 2 5例胃癌与正常胃黏膜RNA进行半定量RT PCR。生物信息分析基因结构、染色体定位 ,并行其推导蛋白性质与功能的研究。结果　筛选到一 331bp的基因片段 ,经cDNA末端快速扩增 ,得到了长度 75 0bp的全长新基因。命名为GDDR ,被国际GenBank收录 ,收录号 :AF4 94 5 0 9。RT PCR表明它在胃癌中明显下调 (GDDR/ β 肌动蛋白 13 5± 5 1与 1 0 4± 0 2 0 ,P <0 0 1)。染色体定位 2 p13,由 5个外显子组成。与CA11在染色体上的距离仅差 2 2kbp ,即均位于 2 p13。其编码蛋白前有一跨膜肽区 ,与胃癌候选抑癌基因CA11编码蛋白为同源蛋白 ,均为新的BRICHO家族成员。结论　得到一胃癌下调全长新基因GDDR ,它可能为BRICHO家族中又一胃癌相关基因。     

乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立及培育

目的：建立可表达乙型肝炎病毒X蛋白的HBx基因（adr亚型）转基因小鼠模型，以研究x基因的功能。方法：采用基因重组技术构建含有CMV启动子和HBx基因（adr亚型）开放阅读框（ORF）的真核表达载体pcDNA3-HBx。该载体经Sal I限制性内切酶线性化后，琼脂糖电泳回收目的的片段，用原核显微注射法将其注射入雄原核，制备转基因小鼠。复合PCR法在基因组水平筛选HBx基因转基因小鼠founder；免疫组织化学法在蛋白水平检测X蛋白在这些小鼠中的表达情况。结果：成功构建了HBx基因真核表达载体pcDNA3-HBx。经原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后，出生并存活了11只新生鼠，经PCR检测后获得5只founder转基因小鼠，命名为C57－TgN(HBx)SMMU。免疫组织化学检测发现5只PCR阳性小鼠的肝细胞质中均有X蛋白的表达。将这5只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配，进行传代培育，复合PCR法筛选阳性转基因小鼠，目前已传至F4代。结论：本研究成功地产生了稳定遗传HBx基因并表达X蛋白的转基因小鼠C57－TgN（HBx)SMMU，它将有利于体内研究HBx基因在肝细胞癌发生中的作用。     

PAX-2基因的克隆化和在原核细胞中的表达

①目的　以RT PCR技术克隆PAX 2全长开放读框 ,构建重组原核表达载体 ,制备重组人PAX 2蛋白 ,为肾肿瘤免疫治疗打下基础。②方法　从肾癌手术标本中分离mRNA ,RT PCR扩增筛选PAX 2全长开放读框 ,扩增产物经过限制性酶切分析及DNA测序后 ,克隆入高效原核表达质粒 pTrcHis,构建重组载体 ,转化工程菌株JM10 9,经IPTG诱导表达及 6×His配体亲和层析制备原核表达重组人PAX 2蛋白。③结果　RT PCR扩增获得约 1.2kb大小的产物 ,经限制性酶切分析和DNA测序 ,证实为人PAX 2基因的完整开放读框。④结论　肿瘤组织总RNA经RT PCR一步法能够对PAX 2基因的开放读框进行完整有效的筛选。经重组技术及高效原核系统制备重组人PAX 2蛋白的效率和纯度满意。体外制备的重组人PAX 2蛋白对肾肿瘤特异性抗原的瘤苗制备和免疫治疗具有重要价值。     

shRNA沉默ANGPTL4表达对大肠癌HT-29细胞的迁移能力的影响

目的探讨ANGPTL4基因沉默对人大肠癌细胞迁移能力的影响。方法用半定量RT-PCR检测ANGPTL4在大肠癌细胞株中的表达情况;通过体外稳定转染,用半定量RT-PCR和直接法ELISA检测shRNA沉默ANGPTL4后HT29细胞的mRNA和蛋白在转染后表达变化,并利用稳转HT29细胞株通过Transwell细胞迁移实验和细胞免疫荧光实验观察ANGPTL4沉默后对肿瘤细胞迁移能力和细胞形态的影响。结果 ANGPTL4在大多数大肠癌细胞株中表达;转染shRNA ANGPTL4后HT29细胞中ANGPTL4基因在mRNA和蛋白表达水平相对于对照组明显下调,与对照组相比具有有统计学意义(P<0.01);shRNA沉默ANGPTL4表达的HT29细胞与对照组细胞相比,细胞迁移能力降低,可能与ANGPTL4影响细胞伪足的形成有关。结论 ANGPTL4在多数大肠癌细胞株中表达;沉默ANGPTL4基因表达能够抑制大肠癌细胞株HT29的迁移能力和伪足形成。     

毛乳头细胞凝聚性生长差异表达基因的筛选及HSPC016全长克隆的生物信息学分析

目的　筛选与毛乳头细胞 (DPC)凝聚性生长相关的基因表达 ,全长克隆凝聚性生长相关基因HSPC0 16并进行生物信息学分析。方法　应用抑制性消减杂交技术 ,构建DPC凝聚性生长与非凝聚性生长的cDNA消减文库 ,克隆鉴定凝聚性生长特异表达基因。应用RACE技术 ,克隆DPC凝聚性状态下HSPC0 16全长表达序列 ,使用生物信息学手段分析其染色体定位、蛋白序列、结构域及功能。结果　成功构建了DPC凝聚性生长差异表达cDNA文库 ,筛选出DPC与细胞同源凝集、生长调控、分化发育及信号转导相关的基因 ,其中包括HSPC0 16。HSPC0 16全长cDNA为 4 0 0bp ,染色体定位于 3q2 1 31;HSPC0 16蛋白为 6 4aa,结构域属于PD0 5 3992家族 ,与T2FA基因功能域同源。结论DPC凝聚性生长的差异表达cDNA文库为进一步筛选并克隆DPC凝聚性生长相关基因奠定了基础 ,也为宏观分析多基因协同参与DPC生长调控和功能发挥提供了依据。HSPC0 16的生物信息学分析显示此基因与DPC基因转录调节有关     

当归苯丙氨酸解氨酶基因原核表达载体的构建

目的构建当归苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因原核表达载体,为重组蛋白的异源表达奠定基础。方法以PAL基因的全长c DNA序列为模板,PCR扩增得到PAL基因的开放阅读框序列,利用双酶切、酶连技术构建原核表达载体pGEX-4T-3-PAL,转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,筛选阳性克隆菌株。结果利用传统的酶切和连接的方法成功构建了PAL基因的原核表达载体,并筛选得到阳性大肠杆菌表达菌。结论初步证明传统的酶切和连接技术能够运用于PAL基因原核表达载体的构建,获得的原核表达菌株用于下一步PAL蛋白的表达研究。     

BCR/ABL癌蛋白片段的表达、纯化及其抗血清的制备

目的　克隆并表达 bcr/ abl融合基因片段 ,并制备其抗血清 .方法　 PCR扩增包含蛋白融合点的 bcr/ abl癌基因片段 ,序列测定后克隆入带有 His标签的原核表达载体 p ET-16 b,转化宿主菌 BL2 1,IPTG诱导表达 ,SDS- PAGE分析表达结果 ,Ni- NTA树脂亲和纯化 ,皮下多点注射免疫小鼠 ,EL ISA确认抗血清的滴度 .结果　 PCR扩增得到大小约 5 2 3bp的目的片段 ,序列测定表明与发表序列完全一致 ;得到了一种新的癌基因 bcr/ abl片段的原核表达载体 p ET- 16 b- bcr/abl,在 BL 2 1中表达可见于 Mr 2 1× 10 3处有一蛋白新生带 ,表达的 BCR/ ABL蛋白免疫小鼠后 ,EL ESA确认抗血清的滴度 >1∶ 2 0 0 0 .结论　成功的克隆、表达了 bcr/ abl融合基因片段 ,并制备了相应的抗血清 .     

远红荧光蛋白HcRed基因的原核和真核表达及鉴定

目的：分别构建携带HcRed基因的PET28a（＋）原核和PIRES真核载体,并分别在大肠埃希菌和鼠树突状细胞系（DC2．4）中表达、鉴定,为后续基因及蛋白的转染提供基础。方法：参照基因库中HcRed1基因序列,设计HcRedCDS全长引物,以含有HcRed的质粒为模板,通过PCR获得目的基因,并分别连接于PET28a（＋）原核载体和PIRES真核载体。经PCR、酶切鉴定后,原核载体转化大肠埃希菌,经IPTG诱导表达;真核载体用脂质体转染DC2．4,G418筛选出克隆后,应用RT．PCR和流式细胞仪进行检测。结果：扩增出687bp的HcRedCDS区序列,构建了原核和真核表达载体PET28a（＋）／HcRed和PIRES／HcRed,分别于大肠埃希菌和DC2．4细胞系中成功表达。结论：成功构建HcRed基因的原核、真核表达载体,并分别在工程菌和细胞系中成功表达,为后续基因及融合蛋白的筛选、示踪和体内观测奠定了基础。     

血管生成抑素endostatin的表达、纯化及活性研究

目的：将从人胎肝组织克隆的血管生成抑素endostatin基因进行原核表达、纯化,检测重组endostatin的生物学活性。方法：利用原核表达载体pBV220在大肠杆菌DH5α中表达endostatin,利用肝素Sepharose亲和层析及SephacrylS-200分子筛纯化;通过体外内皮细胞（ECV304）增殖实验及体内鸡胚尿囊膜（CAM）新生血管实验检测其抑制活性。结果：Endo-statin在DH5α中的表达率为28.5%,纯化后纯度可达90.5%.En dostatin可明显抑制体外培养的内皮细胞增殖.IC50为72ug/ml;20时使细胞于48h发生明显凋亡;200ug/ml的endostatin可使CAM新生血管化率下降30%.结论:研究结果表明endostatin对内皮细胞具有明显抑制作用.提示其在肿瘤及新生血管性疾病的治疗中有潜在的应用前景。     

The effect of brain-derived neurotrophic factor on angiogenesis

To investigate the in vitro and in vivo proangiogenic effects of brain-derived neurotrophic factor （BDNF）, human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） were isolated and cultured in primary culture. The effect of BDNF on the proliferation of HUVECs was examined by MTT assay. The effects of BDNF on HUVEC migration and tube formation were studied by modified Boyden cham- ber assay and tube formation assay, respectively. Matrigel plug assay and chorioallantoic membrane assay were used to evaluate the effects of BDNF on angiogenesis in vivo. Our results showed that BDNF substantially stimulated the migration and tube formation of HUVECs in vitro, although it did not induce HUVEC proliferation. BDNF also induced angiogenesis both in matrigel plug of mouse model and in chick chorioallantoic membrane. In conclusion, BDNF can promote angiogenesis both in vitro and in vivo, and may be a proangiogenic factor.     

K_6SiNiW_(11)O_(39)对碱性成纤维细胞生长因子诱导的血管生成的影响

目的:研究K6SiNiW11O39(SiWNi)对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的血管生成的影响。方法:应用血管内皮细胞增殖、浸润、迁移、管形成以及鸡胚尿囊膜血管形成等体内外生物学实验观察SiWNi对bFGF诱导的血管生成的影响。结果:SiWNi能够剂量相关性的抑制bFGF诱导的ECV-304细胞增殖;在SiWNi与bFGF(100μg/L)摩尔比为1∶1的观察点,SiWNi能够明显抑制bFGF诱导的ECV-304细胞的浸润、迁移、管形成以及鸡胚尿囊膜血管形成。结论:SiWNi对bFGF诱导的血管生成有明显抑制作用。     

褪黑素对卵巢癌SKOV3细胞侵袭、迁移和血管生成的影响

研究褪黑素对卵巢癌SKOV3细胞侵袭、迁移和血管生成的影响。MTT实验、划痕实验和Transwell侵袭实验分别观察褪黑素对SKOV3细胞增殖、侵袭和迁移的影响。诱导HUVECs成管,观察褪黑素对其影响。Western blot法检测SKOV3细胞内血管内皮生长因子(VEGF)、钙黏附蛋白E(E-cadherin)、基质金属蛋白酶9(MMP9)和波形蛋白(Vimentin)的表达。建立卵巢癌移植瘤模型,免疫组化检测CD31的表达。结果显示,褪黑素能抑制卵巢癌SKOV3细胞的侵袭和迁移,并且明显下调MMP-9、Vimentin和VEGF蛋白的表达,上调E-cadherin的表达。此外,褪黑素抑制了HUVECs的小管生成,体内CD31的免疫组化结果也显示褪黑素能够抑制微血管密度。结果提示,褪黑素能抑制卵巢癌细胞的侵袭、迁移和血管生成。     

可注射型富血小板纤维蛋白促进人脐静脉内皮细胞成血管能力的体外实验研究

目的 探究可注射型富血小板纤维蛋白(injectable platelet-rich fibrin, iPRF)对体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)成血管分化能力的影响。方法 CCK-8实验检测HUVECs增殖能力并筛选最佳浓度的可注射型富血小板纤维蛋白提取液(injectable platelet-rich fibrin extract, iPRFe);划痕实验和小管形成实验分别检测HUVECs迁移能力和成血管分化能力;实时定量PCR检测成血管相关基因的mRNA表达。结果 0.4 mg/mL浓度的iPRFe促进HUVECs增殖效果最佳;iPRFe对HUVECs迁移和小管形成有显著的促进作用,还能明显提高血管生成素(angiogenin, ANG)、C-X-C基序趋化因子受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4, CXCR4)、血小板衍生生长因子受体A(platelet-derived growth factor receptor A, PDGFRA)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达水平。结论 iPRF可以促进HUVECs增殖、迁移和成血管能力,有望成为用于牙髓再生的新材料。     

芹菜素对A375黑色素瘤生长、迁移和血管生成的影响及其作用机制

目的  探讨芹菜素对A375黑色素瘤增殖、迁移和血管生成的影响及其作用机制。方法  采用四唑氮化合物（MTS）法检测芹菜素对人黑色素瘤A375细胞增殖的影响;裸鼠皮下移植瘤模型考察芹菜素对体内黑色素瘤生长的影响;划痕实验检测芹菜素对细胞体外迁移的影响;小管形成实验检测芹菜素对人黑色素瘤血管生成的影响;Western blot检测芹菜素对A375细胞中调控增殖及血管生成相关蛋白表达的影响,如血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、磷酸化P38（p-P38）、总蛋白P38（t-P38）、磷酸化Erk（p-Erk）、总蛋白Erk（t-Erk）。结果  体外芹菜素处理A375细胞后,肿瘤细胞的体外增殖及体内生长较空白对照组明显受抑制;肿瘤细胞的迁移能力较溶剂对照组明显减弱;小管形成实验中,芹菜素能够抑制肿瘤细胞诱导的血管生成;分子机制研究发现,芹菜素能抑制血管生成相关蛋白VEGF及MMP-9的表达,同时芹菜素也能抑制调控肿瘤细胞增殖相关蛋白,如p-P38及p-Erk的表达。结论  芹菜素能抑制A375黑色素瘤生长、迁移及血管生成,其机制可能与抑制调控肿瘤细胞增殖及血管生成相关蛋白的表达有关。

     

EphA1/EphrinA反馈环调控内皮祖细胞促肝细胞癌血管生成潜能

目的：研究体内外调控内皮祖细胞系EPCsEphA1/SiRNA-Tet中EphA1/EphrinA1信号通路对其细胞生物学行为及活体内促肝细胞癌血管生成潜能的影响。方法：体内外用不同浓度强力霉素调控EPCsEphA1/SiRNA-Tet中EphA1基因的表达,分为调控组Dox（+）（培养液中分别含强力霉素1、10和100 μg/mL）和非调控组Dox（-）;用Western blot法检测对EphA1/EphrinA1信号通路的影响;CCK8法、细胞划痕实验及细胞侵袭实验检测对细胞增殖、运动及侵袭能力的影响;绘制肝癌裸鼠移植瘤生长曲线结合瘤体免疫组织化学染色分析调控EPCsEphA1/SiRNA-Tet中EphA1基因的表达对其促血管生成潜能的影响。结果：体外实验中用10 μg/mL强力霉素能最大程度抑制EphA1/EphrinA1信号通路活性,EphA1及其配体EphrinA1蛋白表达分别为0.293±0.029、0.603±0.038,与Dox（-）组的0.943±0.041、0.960±0.062比,差异均有统计学意义（t=12.940,4.864;P＜0.001,0.008）。细胞生物学行为分析显示调控EphA1基因表达对EPCsEphA1/SiRNA-Tet增殖能力并无影响;10 μg/mL强力霉素调控时能最有效地抑制EPCsEphA1/SiRNA-Tet运动及侵袭能力,与Dox（-）组比差异均有统计学意义（t=4.435,2.467;P=0.002,0.039）。体外100 μg/mL强力霉素可最大程度诱导活体内EPCsEphA1/SiRNA-Tet中EphA1基因表达下调,在第6周移植瘤体积为（543.8±24.6）mm3,比Dox（-）组体积（924.5±81.8）mm3明显减少（t=4.909,P=0.001）。免疫组织化学染色显示100 μg/mL强力霉素调控组微血管为（21.6±3.6）个,明显少于Dox（-）组的（37.0±4.1）个（t=2.823,P=0.024）。结论：不同浓度强力霉素可在体内外精确调控内皮祖细胞中EphA1/EphrinA1信号轴的活性,进而达到调控内皮祖细胞促肝癌血管生成潜能的目的。     

FAP对体外内皮细胞增殖及其小管形成的影响

目的探讨成纤维细胞激活蛋白(fibroblast activation protein,FAP)在体外对内皮细胞的增殖和小管形成的影响。方法应用不同浓度FAP(0、300、600、1 200 pmol/L)处理人脐静脉内皮细胞EA.hy926,采用MTT检测内皮细胞增殖,划痕愈合实验分析细胞迁移并使用三维胶模型研究内皮细胞的小管形成。结果与正常对照组相比,FAP可以诱导内皮细胞迁移和增殖(P<0.05),并促进内皮细胞小管形成(P<0.01),其中600 pmol/L浓度的FAP处理组作用较其他组明显增强(P<0.01)。结论 FAP在体外可促进人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和小管形成。此发现为进一步研究FAP在血管生成中的机制提供了理论基础。     

SGI-1776 钝化Pim-1 对卵巢癌细胞增殖和侵袭的抑制作用及其机制

目的：检测SGI-1776 对卵巢癌HO-8910 细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用及其可能机制。方法：体外培 养卵巢癌HO-8910 细胞;M法和克隆形成法检测SGI-1776 对HO-8910 细胞的增殖抑制作用;PI 染色流式细胞术(ow cytometry,FCM) 检测SGI-1776 对HO-8910 细胞周期分布的影响;Transwell 法检测SGI-1776 对HO-8910 细胞迁移 及侵袭的抑制作用;ELISA,Western 印迹,siRNA/cDNA 转染检测SGI-1776 对HO-8910 细胞增殖、迁移、侵袭抑制 作用的可能分子机制。结果：SGI-1776 在体外对HO-8910 细胞增殖、迁移、侵袭呈现出浓度依赖性的抑制作用,阻 滞细胞周期于G1 期。随Pim-1 激酶活性降低,Pim-1 蛋白表达下调,同时Pim-1 下游蛋白CDK6,pCDK6,CDK4, pCDK4,CDK2 和pCDK2 表达下调,而P21 和P27 蛋白表达上调。用siRNA 干扰沉默Pim-1 基因,则SGI-1776 对 HO-8910 细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用明显加强;用Pim-1-cDNA 转染HO-8910 细胞,则能部分抵消SGI-1776 对细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用。结论：SGI-1776 通过钝化Pim-1 而发挥其抑制卵巢癌HO-8910 细胞增殖、迁 移和侵袭的作用,提示Pim-1 是卵巢癌治疗的新的分子靶。     

蛋白激酶B siRNA转染胃癌SGC-7901细胞对其侵袭能力的影响

目的研究蛋白激酶B（protein kinase B,PKB）小干扰RNA（siRNA）转染人胃癌SGC-7901细胞,探讨转染后抑制癌细胞转移侵袭的可行性．方法应用基因转染技术将蛋白激酶基因片段转染至胃癌SGC-7901细胞中,采用Millicell小室、集落形成实验、流式细胞术等方法观察蛋白激酶B siRNA转染后对转染组细胞侵袭力的影响．结果与对照组比较转染组的胃癌SGC-7901细胞克隆增殖速度和侵袭能力明显减弱（P〈0．01）,提示转染组siRNA能特异性抑制蛋白激酶B基因的活化,即蛋白激酶B基因的siRNA片断可抑制胃癌SGC-7901细胞的克隆增殖和癌细胞转移侵袭．结论应用RNAi使蛋白激酶B基因沉默能有效抑制人胃癌SGC-7901细胞的克隆生长,并在一定程度上阻止了癌细胞的侵袭和转移,其作用机理值得进一步的深入研究．