新基因TMBP-1的全长cDNA克隆

目的：克隆胸腺细胞发育相关新基因。方法：本研究建立了抑制性差减杂交技术（SSH）、构建了胸腺基质细胞系cDNA差减杂交文库。应用cDNA末端快速扩增方法（RACE）进一步克隆新基因的cDNA全长序列。结果：筛选两个不同胸腺基质细胞系的差异表达基因,获得了新基因cDNA片段C91,应用RACE成功克隆新基因TMBP－1cDNA全长序列。它拥有一个969bp的开放读码框架,编码323个氨基酸。同源序列 比较发现,它编码一个未知功能的膜结合蛋白。Northem杂交分析显示,mRNA转录本长度为1．5kb;在两种胸腺基质细胞系中均有表达。新基因的cDNA全长序列。已被GenBank所接受。结论：抑制性差减杂交技术是克隆新基因片的有效方法;成功克隆新基因TMBP－1的cDNA全长序列。     

小鼠血管抑素基因的克隆及真核表达载体构建

目的：克隆小鼠血管抑素(Angiostatin)cDNA，构建其真核表达载体pCMV-Angiostatin重组质粒，为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法：根据Genebank中小鼠血管抑素基因序列，用RT-PCR方法从鼠肝脏中扩增出Angiostatin cDNA，连接pMD18T载体测序，经测序证实后，通过中间栽体pKS，构建pCMV-Angiostatin重组质粒。结果：测序表明扩增的Angiostatin cDNA序列与报道基本一致，Angiostatin cDNA正确插入表达载体。结论：成功地克隆小鼠Angiostatin基因并完成其真核表达载体的构建。     

Robo4在实体肿瘤血管新生中的表达及其意义

 目的 了解引导神经发育的Robo4基因在实体肿瘤血管新生中的表达,证实Robo4是肿瘤血管新生特异性标志物（tumor endothelial marker, TEM）。方法 采用RT-PCR技术检测多种不同细胞中Robo4 mRNA的表达情况;采用原位杂交和免疫组化染色检测多种肿瘤组织及其对应正常组织的相邻组织切片中Robo4和CD31在微血管的表达情况。结果RT-PCR显示在包括肿瘤细胞和正常细胞的9种受检细胞株中,Robo4 mRNA特异性表达于血管内皮细胞HUVEC和HMVEC中;Robo4在各种正常组织的微血管中表达极其微弱,而在肿瘤组织的微血管上显著表达;CD31在正常和肿瘤组织的微血管上均显著表达。结论Robo4仅特异性表达于肿瘤血管新生的部位,是肿瘤血管新生标志物。     

人TRAIL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人TRAIL基因，构建其原核表达载体。方法 采用RT-PCR（方法从人宫颈癌细胞系HeLa的总RNA中扩增TRAIL基因114～281片段的cDNA，并将目的片段克隆至原核表达载体pET32a（＋）。结果 克隆到人TRAIL基因114～281片段的cDNA，DNA测序结果与GenBank基因库报导的完全一致，经SDS～PAGE电泳。可见29kD大小的融合蛋白质表达。结论 人TRAIL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达。为进行研究sTRAIL的作用机制提供了实验依据。     

血管新生性治疗中基因转移系统及其应用的研究进展

近年来，缺血性心血管疾病的血管新生性治疗的研究进展迅猛，本文就血管新生性治疗中基因转移载体的选择及其应用途径两方面作一综述。     

腺病毒介导的TIMP-4基因转染抑制血管损伤后新生内膜形成

目的 :应用腺病毒介导的转基因方式转染人组织型金属蛋白酶抑制剂 4 (TIMP 4 )基因 ,以观察TIMP 4对球囊损伤后新生内膜形成的影响。方法 :体外培养血管平滑肌细胞 (VSMC)并转染含有TIMP 4基因的重组复制缺陷型腺病毒载体 (AdTIMP 4 ) ,采用单层培养细胞刮片法 ,观察TIMP 4对细胞迁移的影响 ;以大鼠颈总动脉球囊损伤模型为研究对象 ,损伤后即刻经血管外膜分别转入盐水、空载腺病毒载体和含有TIMP 4基因的腺病毒载体 ,观察细胞迁移和新生内膜形成情况。结果 :培养的VSMC转染AdTIMP 4后 ,细胞迁移明显受到抑制 ,与对照组相比抑制率为 6 3.9% (P <0 .0 1) ;在大鼠颈总动脉球囊损伤模型中 ,转基因后 4d时生理盐水组、空载腺病毒组和转染AdTIMP 4组内弹力板内的细胞数依次为 (32 .5± 4 .8)个细胞、(33.8± 7.0 )个细胞和 (8.2± 2 .4 )个细胞 ,转染TIMP 4可以显著抑制血管损伤后细胞向内膜的迁移 ;血管损伤后 2 8d时 ,转染TIMP 4组新生内膜面积与中膜面积比值与对照组相比降低了 6 6 .5 % (P <0 .0 1) ,空载腺病毒组与生理盐水组之间差异无显著性。结论 :TIMP 4可以抑制培养的VSMC的迁移 ,局部干预可以明显抑制大鼠颈总动脉球囊损伤后细胞的迁移和血管新生内膜的形成。     

脂质体介导endostatin基因转染抑制脉络膜新生血管的实验研究

目的探讨脂质体介导endostatin基因体内转染对脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)模型的抑制效应.方法激光光凝方式建立brown norway 大鼠CNV模型,随机分为endostatin组,空质粒组,对照组;脂质体介导法分别导入重组endostatin基因真核表达载体pSecTagA-hEndostatin或空载质粒pSecTagA.原位杂交、免疫组化和ELISA法检测endostatin基因mRNA转录及其蛋白表达;脉络膜血管平铺、FFA、CD105免疫组化观察对CNV的抑制效应.结果 Endostatin基因可有效转染视网膜、RPE及脉络膜并得到表达.转基因后7、14 d眼组织匀浆endostatin蛋白表达量为(50.14±3.43)ng /眼和(31.5±2.21)ng/眼;Endostatin组CNV面积、荧光渗漏程度、CD105阳性细胞表达量与空质粒组及对照组差别显著.结论脂质体介导endostatin基因体内转染可以有效抑制CNV的形成.     

心肌成纤维细胞诱导体外血管新生的实验研究

目的探讨心肌成纤维细胞在血管新生中的作用。方法分离培养乳鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CF),并收集其条件培养液(cardiacfibroblastconditionedmedium,CF CM)作为ECV304[人脐静脉内皮细胞株(humanumbilicalveinendothelialcellstrain)]细胞的培养液,用3H TdR掺入法检测CF CM对ECV304细胞增殖活性的影响;采用体外血管新生三维模型,检测其是否能诱导ECV304细胞向凝胶内侵入。结果乳鼠心肌成纤维细胞的条件培养液明显促进ECV304细胞增殖(P<0.01),诱导ECV304细胞向凝胶内侵入迁移生长,形成树枝样发芽结构。结论心肌成纤维细胞的条件培养液可促进ECV304细胞增殖和迁移,即有促血管新生作用。     

小鼠轮状病毒EW株VP7基因的克隆及其在重组腺病毒中的表达

目的：构建表达小鼠轮状病毒(EDIM)EW株VP7基因的重组腺病毒，以在小鼠模型上研究轮状病毒的免疫保护机制。方法：用RT-PCR方法扩增EDIM VP7全长cDNA并进行基因序列分析，将所得的VP7基因片段插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV，获得重组质粒pShuttleCMV-EVP7，将该质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183获得重组腺病毒质粒pAdCMV-EVP7，将该质粒线性化后转染293细胞包装重组腺病毒rvAdEVP7。以rvAdEVP7感染293细胞，并分别应用电子显微镜、PCR、RT-PCR和Western blot等方法观察rvAdEVP7的形态、VP7基因整合、遗传稳定性、VP7基因在细胞内转录及表达等有关生物学特性。结果：获得了小鼠轮状病毒的全长cDNA，重组腺病毒rvAdEVP7具有典型的腺病毒形态，PCR、RT-PCR和Western blot等分子生物学方法分析显示：rvAdEVP7中确有特异性的VP7基因稳定整合；有较好的遗传稳定性；感染293细胞后能有效转录；可表达轮状病毒主要结构蛋白VP7。结论：成功构建含VP7基因的重组腺病毒rvAdEVP7，为进一步研究轮状病毒的免疫保护机制打下了基础。     

一个新的高血压病相关基因的克隆和表达

目的寻找和克隆新的高血压病相关基因，探讨高血压病的发病机制。方法应用差异显示筛选的方法，对正常（ＷＫＹ）大鼠和自发性高血压病大鼠（ＳＨＲ）血管平滑肌细胞进行ＲＮＡｍａｐｐｉｎｇ分析，选择下调的ｃＤＮＡ进行克隆。结果获得一个新的ｃＤＮＡ，其长度为４１６０ｂｐ，可编码５５１个氨基酸，蛋白质分子量为６２６４４。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析证明，这一基因不仅存在于血管平滑肌细胞中，而且也广泛分布在大鼠心、肾、脑、肺和肝组织中。这一基因在ＳＨＲ大鼠的心、肾、脑、肝中低表达，在ＷＫＹ大鼠高表达；血管紧张素ＩＩ、内皮素－１、ＩＬ－１等致血管平滑肌细胞增殖和高血压的因素可以抑制这一基因的表达，其作用可为相应的拮抗剂所阻断；心钠素、降钙素基因相关肽、肾上腺髓质降压素等抑制血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖和降低高血压的因素可以上调这一基因的表达。结论获得了一种新的与血管平滑肌细胞增殖或高血压相关的基因，它可能拮抗ＶＳＭＣ增殖，在高血压的发生中起重要作用。     

人黑皮素4受体F261S突变基因的克隆和功能验证

目的　研究黑皮素 4受体(MC_4R)基因的新突变F261S是否造成了MC4R蛋白功能改变。方法　用携带F261S纯合突变的先证者及正常人的基因组DNA,PCR扩增突变型及野生型MC4R基因全长,克隆到topo -TA真核表达质粒载体,测序鉴定后转染人胚肾 293细胞。用浓度为 1×10-11 ~1×10-5 mmol/L的α -黑色素细胞刺激素(α- MSH)与表达的MC4R蛋白结合后,用双荧光素酶报告基因测试系统检测胞内cAMP,萤火虫荧光 /海洋腔肠荧光二者强度之比体现了cAMP浓度。结果　α- MSH浓度在 1×10-9 ~1×10-8 mmol/L时野生型胞内双荧光强度比值显著高于突变型细胞(P<0 .05),在 1×10-7 ~1×10-5 mmol/L时差异更为显著 (P<0 .01)。结论　F261S突变使MC_4R介导的信号转导能力下降,此突变与中国人早发性肥胖有关。     

肿瘤血管生成与抗肿瘤血管生成基因治疗的进展

肿瘤血管生成是肿瘤生长转移的关键步骤，是促血管生成因子和抑制因子作用失衡的结果。以肿瘤血管生成为靶点的抗血管生成治疗作为肿瘤治疗新视野，已发展为重要的抗癌策略。基因治疗则使抗血管生成治疗更具有靶向性，使这一治疗策略产生新的飞跃。作者就该领域研究进展作一综述。     

血管形成素1基因对兔缺血心肌中血管的新生作用

目的 探讨血管形成素1基因重组腺病毒载体构建及其促进心肌缺血区血管生长的作用。方法以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人脾组织获取血管形成素1(Ang-1)全长cDNA,经SalI酶切并克隆到E1、E3缺失的Ad5腺病毒载体(PAxCAwt)中。应用Cosmid-TPC磷酸钙共沉淀法共转染293细胞,制备了纯化的Ang-1重组腺病毒颗粒。将获得的Ang-1重组腺病毒直接注射转染36只新西兰白兔的冠状动脉结扎后缺血的心肌内,应用RT-PCR方法测定其在转染心肌中的表达,并用免疫组织化学及冠状动脉造影方法观察缺血心肌内血管生长及侧支循环形成的情况。结果实验所克隆的Ang-1cDNA片段为含有信号肽结构的长度为1515bp的全长cDNA,与文献报道一致。Ang-1重组腺病毒直接注射转染兔缺血心肌后能有效表达,28d后新生毛细血管密度及侧支循环形成明显高于对照组。结论腺病毒介导的血管形成素-1基因能有效地促进兔心肌缺血区血管新生及侧支循环形成。     

一种新的芳烃双加氧酶基因的克隆和功能研究

芳烃双加氧酶是多环芳烃在细菌中降解的起始关键酶.本研究通过基因组步移法从地杆菌(Terrabacter sp.)中克隆出一种新的双加氧酶基因.采用pET17b载体表达该基因,在共表达电子传递链蛋白的条件下检测获得双加氧酶活性.通过高效液相色谱和气相色谱-质谱分析发现该基因产物可以催化菲、芘和荧蒽生成相应的顺式双羟基产物,表明该基因为一种新型高分子多环芳烃降解基因.     

百日咳毒素亚基基因的克隆与表达及其重组亚基的免疫学特性

目的从百日咳包特杆菌ＣＳ株中克隆百日咳毒素（ＰＴ）及其各亚基的基因,并探讨在昆虫细胞中表达百日咳毒素亚基基因片段的可能性及表达产物的生物学特性。方法采用ＰＣＲ技术进行克隆,并通过限制性内切酶和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ进行分析鉴定。利用重组杆状病毒技术,在昆虫细胞Ｓｆ９中表达各亚基基因,并通过免疫荧光实验进行分析鉴定,通过ＥＬＩＳＡ实验进行重组蛋白的免疫学特性评价。结果获得百日咳毒素及其各亚基的基因,并在昆虫细胞中表达了重组亚基。经体外聚合后的各重组亚基混合物与抗天然完整ＰＴ免疫血清的反应性和诱生特异性抗ＰＴ抗体的能力都明显高于各重组亚基单体混合物,含有Ｓ１重组亚基混合物诱生特异性抗ＰＴ抗体水平又明显高于不含Ｓ１重组亚基混合物的水平。说明百日咳毒素亚基单体仅具有很弱的诱生特异性抗ＰＴ抗体的能力,且抗完整ＰＴ的抗血清对百日咳毒素亚基单体也缺乏很好的识别作用。结论百日咳毒素诱导产生特异性抗体的能力依赖于聚合体的空间构型,而且其主要抗原决定簇位于聚合体的Ｓ１亚基上。     

细粒棘球蚴热休克蛋白70基因的克隆和序列分析

目的 获得细粒棘球蚴（E.granulosus）热休克蛋白（Heat Shock Protein70,HSP70）基因,进行DNA测序、序列特性分析及同源性分析,为研究包虫病重组疫苗候选基因奠定基础。方法 从细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,RT－PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆侏HSP70基因,将其重组到pGEM－T载体后进行序列测定和分析。结果 成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆侏HSP70基因,测序表明该片段由402bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为96％,推导编码氨基酸序列同源性为81％。结论 经DNA测序证实,扩增出的片段确为HSP70,该片段阅读框完整,可作为重组抗原的候选基因。     

丙型肝炎病毒1bDY株ns5a基因的克隆及其所表达融合蛋白的免疫原性分析

目的:克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)1b型地方株DY株ns5a基因,为进一步研究和应用该基因及其表达产物奠定基础。方法:采用基因重组技术完成实验。设计特异的引物,采用巢式PCR法,从含HCV 1b DY株全长cDNA的质粒HCV17中扩增出目的片段,约480bp;将其插入克隆载体pMD18-Tvector中,再与原核表达载体pET-28a重组;经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21菌株,在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS5A蛋白表达水平。结果:含有HCV 1b DY株ns5a基因的重组体构建成功,并得以表达蛋白,并且NS5A蛋白具有与HCV患者阳性血清中的多克隆的结合活性,具有很好的免疫原性。结论:运用原核细胞基因工程技术成功构建和表达了HCV 1b DY株ns5a基因,为进一步研究HCVns5a的基因型及探讨该基因编码的NS5A蛋白的性质和生物学活性创造条件。     

宫颈癌相关新基因的筛选、克隆及鉴定

目的:筛选、克隆及鉴定宫颈癌相关基因———BLCAP。方法:利用基因芯片技术对1例原发性宫颈癌患者的癌组织及其癌旁正常组织进行分析;将在宫颈癌组织中表达显著降低的BLCAP基因克隆到pET-28(a)表达载体上,以构建原核表达重组质粒pET-28(a)-BLCAP,通过PCR、限制性内切酶酶切和DNA测序等技术鉴定阳性重组子。结果:通过基因芯片分析发现存在表达差异的原癌和抑癌基因共11条,其中表达降低最明显的是BLCAP基因。构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,即BLCAP基因共264 bp,基因序列无改变,基因插入后阅读框(ORF)正确。结论:筛选出了在宫颈癌中表达显著降低的BLCAP基因并成功构建了pET-28(a)-BLCAP原核表达质粒,为表达BLCAP目的蛋白及研究该蛋白的性质奠定了基础。