首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
相似文献
 共查询到10条相似文献,搜索用时 31 毫秒
1.
结核分枝杆菌候选抗原基因克隆与表达质粒构建   总被引:2,自引:1,他引:1  
目的 克隆并构建编码结核分枝杆菌(MTB)ESAT6,Ag85B和MPT64分泌蛋白的重组表达质粒。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中分别扩增出ESAT6,Ag85B和MPT64基因(288bp,978bp and 687bp),并克隆到T载体,然后用双内切酶消化后,与同样酶消化的pGEX-4T-2连接,转化大肠杆菌E.coli Dh5α,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符,测序结果与献报道一致,证实符合表达框架。结论 成功地克隆并构建了ESAT6,Ag85B和MPT64基因的重组表达质粒pGEX-ESAT6,pGEX-Ag85B和pGEX-MPT64。  相似文献   

2.
江山  朱道银  蒋英  骆旭东  陈全 《医学争鸣》2003,24(21):1973-1975
目的:构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体.方法:采用gene SOE-ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3行PCR扩增融合,经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3.1( )中构建真核表达质粒pCDAg85B-A,酶切、DNA测序鉴定,用脂质体法将pCDAg85B-A转染COS-7细胞,采用RT-PCR,ELISA方法检测其表达.结果:Ag85B-Ag85A融合基因定向克隆人pcDNA3.1( ),双向测序表明碱基无突变,Ag85B-Ag85A融合基因在真核细胞中能表达.结论:成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体,为结核病基因疫苗的研究奠定基础.  相似文献   

3.
结核分枝杆菌16KD蛋白的基因克隆及表达与纯化   总被引:1,自引:0,他引:1  
杨军兰  杨侠 《实用医技杂志》2008,15(29):4001-4003
目的:通过构建结核分枝杆菌(MTB)16KD蛋白的表达载体,在大肠杆菌(E.coli)中表达MTB16KD蛋白,并获得大量纯化的16KD蛋白。方法:采用聚合酶链反应(PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出16KD蛋白的编码基因,用限制性内切酶消化后插入载体pGEX-4T-2中,测序结果证实后,将重组质粒转化E.coli DH5α,经IPTG诱导表达GST-16融合蛋白。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析融合蛋白的相对分子质量及表达形式。Western blot鉴定16KD蛋白活性。经GST亲和层析柱过柱,得到纯化的16KD蛋白。结果:构建了具有正确基因序列的表达载体,在E.coli DH5α中诱导表达的融合蛋白GST-16占菌体总蛋白的42%。Wstern Blot结果证明:融合蛋白GST-16能与抗结核分枝杆菌的抗体发生特异性结合。紫外分光光度仪测量纯化16KD蛋白的浓度为688mg/L。结论:结核分枝杆菌16KD蛋白在E.coli DH5α能高效表达,该蛋白具有特异的免疫学活性。  相似文献   

4.
分枝杆菌融合表达ICL-GFP穿梭质粒的构建及鉴定   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的:构建融合表达ICL-GFP的E.coli-分枝杆菌穿梭载体,在耻垢分枝杆菌(MS)中融合表达结核分枝杆菌(MTB)潜伏感染相关蛋白异柠檬酸裂合酶(ICL)及绿色荧光蛋白(GFP),为抗MTB ICL的表达及抗MTB潜伏感染的药物筛选奠定基础. 方法:采用PCR法从MTB H37Rv基因组DNA中扩增出icl基因,克隆入pcDNA3.1( ), 构建重组质粒pcDNA-icl. 用PCR法自pUV15中扩增出gfp基因,克隆入pcDNA-icl中icl基因片段的下游,构建重组质粒pCDIG. 鉴定无误后,将icl-gfp融合基因从pCDIG中亚克隆入pUV15,构建融合表达ICL-GFP的穿梭质粒pUVIG. 将pUVIG电转化MS,经潮霉素B筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定. 培养MS的阳性转化子,在荧光显微镜下观察GFP的表达,Western-blot法检测ICL的表达并检测ICL-GFP融合蛋白的ICL活性. 结果:所克隆的icl序列出现一个碱基突变,为无义突变. gfp序列完全正确. 重组质粒pUVIG能在E.coli-MS间进行穿梭,并在MS中表达ICL-GFP融合蛋白. 该融合蛋白同时具有GFP的自发荧光功能和ICL的酶活性. 结论:成功构建能在MS中表达ICL-GFP融合蛋白的E.coli-分枝杆菌穿梭质粒.  相似文献   

5.
目的构建结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因,并对其在体外真核细胞中进行表达。方法用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中分别扩增Ag85B、Esat6、HspX基因,插入到pUC19-T载体,序列测定正确后,将融合基因再次克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)。重组质粒经酶切鉴定并测序正确后,用MegaTran1.0转染293T细胞,并用Western-Blot检测目的蛋白的表达。结果 Western-blot检测到分子量大小约65 kDa的目的蛋白。结论成功地构建了结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的真核表达载体,且该重组载体可在体外真核细胞中获得特异性的表达。  相似文献   

6.
目的: 构建融合表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)分泌蛋白Ag85B-ESAT6真核表达载体,研究该重组载体在体外的表达和在小鼠体内诱生体液免疫应答的能力. 方法: 设计含不同酶切位点的Ag85B和ESAT6引物,采用PCR的方法从MTB毒株H37Rv-DNA中分别扩增出相应大小的DNA片段,将片段分别与pGEM-T-easy载体连接后测序. 将测序正确的Ag85B和ESAT6按照不同的酶切位点克隆入真核表达载体pcDNA3,挑选出阳性克隆,分别命名为AZ-pcDNA3-EF和EZ-pcDNA3-AF,将重组质粒电转CHO细胞,RT-PCR检测融合蛋白mRNA的表达,间接免疫荧光测定CHO细胞内融合蛋白的表达;用重组质粒免疫BALB/c小鼠,ELISA测定特异性抗体的滴度. 结果: PCR获得的Ag85B和ESAT6序列与GenBank报道的一致. RT-PCR可检测融合基因转录出mRNA,转染重组质粒的CHO细胞内有较强的免疫荧光,AZ-pcDNA3-EF质粒免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶ 1000,EZ-pcDNA3-AF质粒免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶ 1500. 结论: Ag85B和ESAT6融合基因真核表达载体构建成功,有望为结核病的预防提供有效的基因疫苗.  相似文献   

7.
结核分枝杆菌Ag85A真核表达质粒的构建与鉴定   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:构建结核分枝杆菌Ag85A重组真核表达质粒,为DNA疫苗的研究提供靶基因。方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出结核杆菌Ag85A分泌性蛋白的基因,应用T-A克隆技术,直接与pUCan-T载体连接,转化大肠杆菌JMl09(E.coli JMl09),蓝白筛选,阳性克隆经酶切鉴定和DNA测序证实基因碱基无误后,用NheⅠ和XbaⅠ双酶消化,回收的小片段与用NheⅠ和XbaⅠ消化的真核表达质粒pCI-neo连接,转化E.coli JMl09,筛选阳性克隆酶切鉴定。结果:经酶切鉴定,证实结核分枝杆菌重组真核表达质粒pCI-Ag85A构建正确。结论:结核分枝杆菌真核表达质粒pCI-Ag85A构建成功,为进一步研究其作为一种结核病DNA密菌在预防和治疗结核病中的作用奠定了基础。  相似文献   

8.
结核分枝杆菌furA基因片段的克隆、表达和分离纯化   总被引:3,自引:2,他引:1  
高雪  薛莹  姜泓  柏银兰  师长宏  张海  李元  徐志凯 《医学争鸣》2004,25(18):1637-1640
目的: 获得结核分枝杆菌furA基因片段并高效表达、纯化. 方法: 用PCR技术从MTB毒株H37Rv-DNA中扩增出相应大小的DNA片段,将片段与pGEM-T-easy 载体连接后测序. 将测序正确的furA按照BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆入原核表达载体pRSET-A,将连接产物转化入E.coli BL21,挑出阳性克隆,IPTG诱导表达重组的(His)6融合蛋白. 对重组融合蛋白通过镍柱进行纯化. 结果: PCR获得的furA序列与Genbank报道的一致(为453 bp). 重组载体在E.coli BL21中以可溶形式高效表达,融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析,在Mr为23.0×103处有特异的蛋白条带,目的蛋白表达量占菌体总蛋白量的10%,重组蛋白经镍柱进行纯化后,得到了高纯度的FurA融合蛋白. 结论: 成功克隆结核分枝杆菌furA基因片段,并在E.coli BL21中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度FurA融合蛋白.  相似文献   

9.
分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗的构建和表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的构建分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗。方法PCR扩增结核分枝杆菌热休克蛋白60(hsp60)的调控序列和合成T4转录终止序列,分别定向克隆入pBCG2000载体的多克隆位点的上下游,得到E.coli-Mycobacterium穿梭载体质粒pBCG3000。PCR分别扩增出结核分枝杆菌分泌性抗原Ag85B的全编码序列及ESAT-6基因,然后将两基因融合插入pBCG3000载体的hsp60启动子下游得到pBCG3000-85B-ESAT-6分泌性表达质粒。用电穿孔法将pBCG3000-85B-ESAT-6质粒转化BCG细胞,得到重组卡介苗。重组卡介苗经热诱导后,SDS-PAGE电泳和Westernblotting鉴定融合蛋白85B-ESAT-6的表达及其免疫学活性。结果通过PCR、酶切以及测序鉴定,pBCG3000-85B-ESAT-6表达质粒构建完全正确,SDS-PAGE电泳未能直接观察到表达的融合蛋白条带,用ESAT-6蛋白的多抗血清通过Westernblotting证实了该蛋白主要分泌性表达于胞外并具有免疫学活性。结论分泌性表达融合蛋白85B-ESAT-6重组卡介苗构建成功。  相似文献   

10.
目的 构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白 ESAT- 6的重组卡介苗。方法 分别以卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌 H37Rv株基因组 DNA为模板 ,通过 PCR扩增得到约 117bp的 BCGα抗原 (α- Ag)信号肽序列和 2 85 bp的结核杆菌 esat- 6基因序列。将 esat- 6基因与大肠杆菌 -卡介苗穿梭质粒载体 p MV2 6 1重组 ,得到重组质粒 p ME。再将 BCGα- Ag信号肽序列克隆至 p ME中 ,得到重组质粒 p SME。结果 质粒 p SME用双酶切和 PCR扩增鉴定证实 ,克隆基因 α- Ag信号肽序列和 esat- 6正确插入载体 p MV2 6 1。结论 重组质粒 p SME可望在 BCG中分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白 ESAT- 6 ,该质粒的构建成功为改造卡介苗、发展新型结核病疫苗奠定了基础  相似文献   

设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号