小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在前列腺癌细胞中的表达

目的:构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体,并检测其在前列腺癌细胞株(PC-3)中的表达。方法:将目的基因m4-1BBL全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),获得m4-1BBL定向插入重组子pcDNA3.1(+)m4-1BBL,采用限制性内切酶和测序鉴定是否成功构建。用脂质体法将重组质粒转入PC-3细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测m4-1BBL在PC-3中的表达。结果:酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有小鼠4-1BBL全长cDNA编码序列,转染实验表明m4-1BBL基因能在PC-3细胞中表达。结论:小鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在PC-3细胞中的表达均获成功,为进一步研究莫定了基础。     

大鼠4-1BBLcDNA的克隆、分析及染色体定位

目的克隆、分析并染色体定位肿瘤坏死因子配体超家族（Tumor Necrosis Factor Superfamily，TNFSF）成员4-1BBL分子。方法在对小鼠、人4-1BBLmRNA进行生物信息学分析的基础上，采用PCR扩增、T载体克隆测序等实验技术，并用软件对基因进行了拼接、序列分析及同源性比较，同时通过荧光原位杂交（FISH）技术对该基因进行了染色体定位。结果首次获得了具有完整开放阅读框的大鼠eDNA，GenBank登录号为No．AY259541，通过同源性比较分析，证明该基因与小鼠高度同源，编码区的核苷酸序列与小鼠、人的同源性分别为88％、37％。推导出的大鼠4-1BBL蛋白质由308个氨基酸分子组成，分子量为33469d，胞外区有三个潜在的N糖基化位点：AA138，AA160和AA292，是典型的Ⅱ型糖蛋白，与小鼠、人在氨基酸水平的同源性分别为83％、31％，其中胞质区为76％、32％，跨膜区为45％、40％，胞外区为87％、28％。该基因定位于大鼠染色体9q1（Gen Bank UniGene登录号为No．Rn．46783）。结论大鼠4-1BBL胞内区的“SDAA”可能发挥着TNF家族中具有逆信号的其他成员的胞内区酪氨酸激酶Ⅰ磷酸化位点“SXXS”的作用。大鼠4-1BBLcDNA的成功克隆与定位为探讨4-1BBL在免疫共刺激中的作用机制以及TNF分子的进化研究打下了基础。     

人β-防御素4基因在COS-7细胞中的转染表达

目的探讨人β-防御素4（HBD4）基因在真核细胞COS-7中表达的可能性。方法用脂质体转染法将实验室已构建的重组真核表达载体pcDNA3.1＋/HBD4导入COS-7细胞,采用RT-PCR、Western-blot法检测HBD4的mRNA和蛋白表达水平,并对表达的HBD4进行抗菌活性的初步研究。结果 pcDNA3.1＋/HBD4转染的COS-7细胞中检测到HBD4mRNA表达。Western blot分析显示,在pcDNA3.1＋/HBD4转染的COS-7细胞及细胞培养液中检测到了HBD4蛋白的表达。Kirby-Bauer纸片扩散法证实表达的HBD4蛋白对大肠杆菌ATCC25922具有较强的杀伤作用。结论在COS-7细胞中成功表达具有抗菌活性的HBD4多肽。     

小鼠共刺激分子B7-1的分子克隆、测序与真核表达载体的构建

目的：克隆小鼠共刺激分子B7－1基因，测序并构建其真核表达载体。方法：从小鼠脾组织中提取总RNA，用RT－PCR方法将B7－1的DNA扩增出，克隆到真核表达载体pcDNA3中，测定其cDNA序列。结果：测序结果表明我们克隆的B7－1基因序列与GenBank中序列有1个碱基不同，所编码的氨基酸发生突变。结论：已成功构建小鼠B7－1的真核表达载体，为进一步应用B7－1进行肿瘤基因治疗打下基础。     

4-1BB/4-1BBL在自身免疫性心肌炎小鼠心肌中的表达及意义

目的:探讨4-1BB/4-1BBL在实验性自身免疫性心肌炎(EAM)小鼠心肌组织中的表达及意义。方法:将提纯的猪心肌肌球蛋白和完全弗氏佐剂等体积混合成乳浊液在1 d、8 d免疫具有遗传易感性的BALB/c小鼠,建立EAM模型。对照组小鼠仅用完全弗氏佐剂皮下注射。分别于初次免疫后21 d、80 d进行心肌炎症评分及血清cTnI测定,采用免疫荧光及RT-PCR技术检测4-1BB/4-1BBL在小鼠心肌组织中的表达。结果:在急性期21 d,模型组小鼠心肌组织见不同程度的急性炎性细胞浸润和心肌细胞变性坏死、cTnI水平高于对照组(P<0.05);80d模型组小鼠心肌组织炎症减弱伴有纤维化出现、cTnI较前期降低;免疫荧光见4-1BBL在模型组心肌中表达明显,在对照组小鼠心肌中少量表达(P<0.05);21 d模型组小鼠心肌组织中4-1BB/4-1BBL基因表达水平均高于对照组(P<0.01),80 d时表达仍然升高(P<0.01)。结论:4-1BB/4-1BBL在EAM小鼠心肌中的表达是上调的,4-1BB/4-1BBL通路参与了自身免疫性心肌炎的发生发展过程。     

真核表达质粒pDisplay-hGITRaa1-165构建及其在COS-7细胞中的表达

目的:构建含有人GITR胞外段的真核表达质粒pDisplay-hGITRaa1-165,并检测其在真核细胞内的表达。方法:将带有信号肽的GITR基因片段克隆至真核表达载体pDisplay,经酶切鉴定及测序分析,脂质体介导法转染COS-7细胞,通过蛋白质印迹法检测其在COS-7细胞内的表达水平。结果:所构建的真核表达质粒pDisplay-hGI-TRaa1-165转染COS-7细胞后,在其培养上清中检测到目的蛋白的表达。结论:成功表达pDisplay-hGITRaa1-165蛋白,为GITR的生物学功能研究奠定了基础。     

激发型4-1BBL抗体促进原代急性髓细胞白血病细胞的增殖和MMP-9分泌

目的:研究共刺激分子4-1BBL分子逆向信号对原代急性髓细胞白血病细胞的促增殖作用及其生物学效应?方法:用流式细胞术(FCM)检测4-1BBL分子在26例初诊急性髓细胞白血病(AML)患者白血病细胞表面的表达,分离AML患者的白血病细胞并加入激发型4-1BBL抗体(1F1单抗)共培养,同时设置IgG1同型对照组,Alamar Blue法检测4-1BBL单抗1F1促AML原代细胞的增殖?收集培养细胞的上清液,用ELISA方法检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的水平?结果:FCM测得初诊AML患者的白血病细胞上存在4-1BBL分子的表达,26例AML患者中4-1BBL分子的阳性表达率为46.15%;1F1单抗能明显促进4-1BBL+ -AML细胞的生长,4-1BBL+ -AML组刺激指数明显高于4-1BBL- -AML组(P < 0.01)?1F1与4-1BBL+ -AML细胞共培养48 h后,用ELISA法检测其上清液中MMP-9含量显著高于IgG1同型对照组[(965.06 ± 229.94) vs (596.49 ± 129.28) pg/ml,P < 0.01],而4-1BBL- -AML组的MMP-9与IgG1组无显著差异(P > 0.05)?结论:部分AML患者的白血病细胞可以表达4-1BBL分子,1F1单抗与AML细胞上4-1BBL分子交联后,可以促进AML细胞的生长,同时促进MMP-9的分泌?     

急性白血病细胞B7-1及MHC分子的表达

目的：探讨共刺激分子B7-1(CD80)及MHC分子在急性白血病(acute leukemia，AL)中的表达，方法：应用一组mAb，采用免疫荧光法对AL52例瘤细胞及34例正常人骨髓单个核细胞（BMMC)表面B7-1及主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子的表达进行了检测．结果：所有患瘤细胞及正常人BMMC上MHCI类分子表达强阳性，MHCⅡ类分子表达920k，阳性，而B7-1表达差异较大，急性单核细胞白血病(M5)表达阳性率最高(8／11)，而急性粒细胞白血病(M1，M2，M3)均无表达．结论：B7-1缺陷是白血病细胞逃避宿主免疫监视的重要原因，转染B7-1基因的瘤苗可能是免疫基因治疗的有效途径。     

B7-1基因转染小鼠EL-4淋巴瘤细胞体外诱导免疫小鼠脾细胞产生的白细胞介素-2

目的　研究B7 1基因转染小鼠EL 4淋巴瘤体外诱导免疫小鼠脾细胞产生的白细胞介素 2。方法　以CTLL 2细胞检测EL 4B7 1 免疫小鼠的脾细胞与瘤细胞共育的MLTC培养上清中的IL 2活性。结果　EL 4B7 1 免疫小鼠的SPL经瘤细胞在体外刺激可诱生出明显的IL 2活性 ,而EL 4免疫小鼠的SPL则无此作用 ,两者具有较明显的差异 (P <0 0 1)。结论　B7 1基因转染小鼠EL 4淋巴瘤可在体外诱导免疫小鼠脾细胞产生较高水平的白细胞介素 2。     

小鼠胰岛素样生长因子-1基因体外克隆及表达的研究

目的 探讨小鼠胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因提取、鉴定及重组质粒转染COS-7细胞表达.方法 通过RT-PCR获取小鼠骨骼肌IGF-1的cDNA,将该基因亚克隆入重组质粒p1 (pcDNA3.1-Nestin-EGFP)中,构建重组质粒p2 (pcDNA3.1-Nestin-EGFP- IGF-1),脂质体转染COS-7细胞,ELISA检测细胞培养基中IGF-1蛋白量.结果 克隆IGF-1基因cDNA与GenBank中该基因序列一致,重组质粒转染COS-7细胞培养基中均含有IGF-1蛋白.结论 IGF-1基因成功构建到重组质粒p2中,且能在COS-7细胞中过表达.     

大鼠GAP-43基因的克隆及其在COS-7细胞的表达

目的: 克隆大鼠GAP-43基因,构建其真核表达载体,并观察其在哺乳动物细胞COS-7中的表达。方法: 采用RT-PCR方法,以大鼠少突胶质前体细胞RNA为模板,扩增GAP-43基因,定向克隆到pEGFP-N3载体中。以LipofectamineTM 2000试剂转染pEGFP-N3-GAP-43表达载体至COS-7细胞中进行瞬时真核表达。以免疫荧光方法鉴定GAP-43的表达。结果: 从大鼠少突胶质前体细胞中克隆到序列正确的GAP-43全长编码序列。所构建的GAP-43质粒在COS-7细胞中获得高效表达。结论: 大鼠GAP-43基因的克隆、真核表达载体的构建及在COS-7中的表达获得成功,为进一步研究其功能,尤其是探讨其在少突胶质细胞发育中的作用奠定了基础。     

激发型鼠抗人4-1BBL单克隆抗体的研制

目的鼠抗人4—1BBL单克隆抗体的制备及其生物学特性研究。方法以高表达人4—1BBL分子的基因N-程细胞株L929／4—1BBL为免疫原免疫BALB／c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,经过选择性克隆化培养及流式细胞术分析,筛选分泌特异性抗A4—1BBL单抗的杂交瘤细胞株;采用快速定性试纸法鉴定单抗亚类、间接免疫荧光法检测单抗对肿瘤细胞株的识别谱。进而,将所获抗人4-1BBL单抗体外刺激白血病细胞株U937,通过细胞计数法分析单抗对U937生长的影响。结果获得一株持续、稳定分泌鼠抗人4—1BBL单抗的杂交瘤细胞株,并将其分泌的单抗命名为39A8。单抗39A8可有效识别不同肿瘤细胞株表达的4—1BBL,经细胞计数分析,39A8对U937细胞的生长具有明显的促增殖作用。结论单抗39A8是可激发4-1BBL逆向信号的单克隆抗体,是研究4—1BBL分子及其功能的重要工具。     

人KiSS-1基因克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆转移抑制基因KiSS-1的不含信号肽的表达序列,构建人KiSS-1基因的真核表达载体.方法:从人正常胰腺组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达质粒pcDNA3/KiSS-1.结果:经PCR、酶切鉴定和基因序列测定,证实重组入载体pcDNA3的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列.结论:重组质粒pcDNA3/KiSS-1的成功构建,为该基因相应蛋白质的表达和其抗体的制备研究提供基础.     

人谷氧还蛋白1基因克隆及真核表达载体的构建

目的 从ECV304细胞中克隆谷氧还蛋白1(glutaredoxin1,Grx1)的cDNA序列并构建真核表达载体pcD-NA3.1( )-Grxl.方法 利用Trizol一步法从ECV304细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术从中获得Grx1的cD-NA,将质粒pcDNA3.1( )进行双酶切、CIP处理并回收纯化,与纯化后的Grx1cDNA连接构成重组表达载体pcD-NA3.1( )-Grx1,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆鉴定并进行测序分析.结果 经RT-PCR和测序鉴定,成功地克隆了人Grx1cDNA.结论 从ECV304细胞中获得Grx1的cDNA,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1( )-Grx1,对Grx1在体外表达、进一步研究其在氧化应激中的作用及其作用机制具有重要意义.     

人CTLA-4Ig融合基因减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体的构建及表达

目的构建能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,探讨其在哺乳动物细胞中的表达并对表达产物进行鉴定。方法用touchdown PCR法扩增CTLA-4 Ig融合基因,将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3.1( ),构建pcDNA3.1( )-CTLA-4 Ig,用电穿孔仪转入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207。将表达质粒转染COS-7细胞,SDS-PAGE、W estern b lot检测转染细胞裂解上清中目的蛋白的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。在pcDNA3.1( )-CTLA-4 Ig质粒转染后48 h细胞裂解上清中,检测到CTLA-4 Ig融合蛋白的表达,该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合。结论成功构建了能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,并在哺乳动物细胞中成功表达有生物学活性的重组人CTLA-4 Ig蛋白。     

4-1BBL分子在人恶性血液病细胞系的表达

目的:研究共刺激分子4-1BBL分子在人恶性血液病细胞系的表达及其生物学意义。方法:流式细胞仪检测4-1BBL分子在不同的人恶性血液病细胞系的表达;用可介导4-1BBL逆向信号的鼠抗人4-1BBL单抗(mAb1F1)作用于8个不同的人恶性血液病细胞系,细胞计数法和3H-TdR掺入法评价细胞系的体外生长和增殖。结果:FACS结果显示4-1BBL分子在人恶性血液病细胞系上有不同程度的表达,其中髓性白血病细胞系U937、HL60及B淋巴瘤细胞系Raji、Daudi上呈现较高水平的表达。细胞计数和3H-TdR掺入实验结果表明mAb1F1对髓性白血病细胞系U937和HL60,具有较强的促增殖效应。结论:共刺激分子4-1BBL分子在髓性白血病细胞系和B淋巴瘤细胞系上表达率较高;4-1BBL分子可通过介导逆向信号促进髓性白血病细胞系U937和HL60的生长和增殖。     

人4-1BBL转基因细胞株的构建及其生物学功能的研究

目的为探讨人4-1BBL分子的生物学功能，构建人4-1BBI。转基因细胞株。方法利用RT-PCR方法克隆人4-1BBI。全长基因，继而重组入逆转录病毒表达载体pEGZ．Term。重组逆转录病毒载体pEGZ．Term／4-1BBI。与两个辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T，用含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞，筛选获得Zeocin抗性的转基因细胞。^3H-TdR掺入实验分析4-1BBL转基因细胞对T细胞增殖的影响，ELISA法分析细胞因子的分泌。结果流式细胞仪表型分析结果表明，L929／4．1BBL转基因细胞稳定表达人4-1BBL分子。体外实验表明，L929／4-1BBL细胞能够促进T细胞活化、增殖及IL-2、IL-6和IFN-γ的分泌。结论该研究成功克隆了人4-1BBL基因，构建了能稳定表达4-1BBL分子的转基因细胞株L929／4-1BBL，该株转基因细胞能提供有效的4-1BBL共刺激信号，促进T细胞活化、增殖及细胞因子的分泌。     

大鼠谷氨酰胺合成酶基因的克隆及其在Hela-G细胞中的表达

目的 克隆大鼠谷氨酰胺合成酶(GS)基因,构建其真核表达载体,并观察其在Hela-G细胞中的表达. 方法 采用RT-PCR方法,以大鼠大脑皮层总RNA为模板,扩增GS基因,定向克隆到pEGFP-N3载体中.以LipofectamineTM2000试剂转染pEGFP-N3-GS表达载体至Hela-G细胞中进行瞬时真核表达.以免疫细胞化学方法鉴定GS的表达.结果 从大鼠大脑皮层组织中克隆到序列正确的GS全长编码序列.所构建的pEGFP-N3-GS质粒在Hela-G细胞中获得高效表达.结论 大鼠GS基因的克隆、真核表达载体的构建及在Hela-G中的表达获得成功.