BMP2基因转染犬牙髓成纤维细胞与异种烧结骨复合组织工程的实验研究

目的 构建骨形成蛋白2(bone morphogenetic proteins 2,BMP2)绿色荧光融合蛋白pEGFP-N1-BMP2真核表达质粒,用其在体外转染犬牙髓细胞(dog dental pulp cells,DDPCs),利用构建的种子细胞BMP2-DDPCs与异种烧结骨(xenogeneic bone ceramice,XBC)复合,检测BMP2-DDPCs增殖活性,扫描电镜观察BMP2-DDPCs在异种烧结骨中的生长情况,评价异种烧结骨作为支架材料的可行性,为将人BMP2基因转染的牙髓成纤维细胞与异种烧结骨复合进行牙体修复的研究奠定基础.方法 构建pEGFP-N1-BMP2真核表达质粒,采用阳离子脂质体转染法将BMP2基因转染体外培养的犬牙髓细胞,将构建的种子细胞BMP2-DDPCs与异种烧结骨复合,MTT法检测BMP2-DDPCs增殖活性以及应用扫描电镜观察BMP2-DDPCs在异种烧结骨中的生长情况.结果 成功构建pEGFP-N1-BMP2真核表达质粒,并成功转染犬牙髓细胞.BMP2-DDPCs复合异种烧结骨组的细胞增殖活性与单层贴壁培养BMP2-DDPCs组的细胞增殖情况差异无统计学意义(P＞0.05).说明异种烧结骨上黏附的牙髓细胞增殖情况良好.扫描电镜观察异种烧结骨上BMP2-DDPCs黏附、生长的情况,可见支架材料的孔径为100～600μm,材料表面粗糙,利于细胞的黏附生长;孔隙中可见大量BMP2-DDPCs贴附于材料上,生长旺盛、伸展良好.结论 BMP2-DDPCs可在异种烧结骨表面及孔隙中生长、增殖,异种烧结骨可以作为牙组织工程的支架材料.     

pEGFP-N1-BMP2真核表达载体的构建及其经超声微泡介导转染HPDLFs后的表达

目的 构建pEGFP-N1-BMP2真核表达质粒,并检测其经超声微泡转基因技术转染人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)后的瞬时表达情况.方法 从人胎盘滋养层细胞系中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得目的 基因人骨形成蛋白-2(hBMP2)基因片段,连接pMD19-T载体并测序正确后与真核荧光表达载体pEGFP-N1连接,酶切鉴定后利用超声微泡转基因技术转染入HPDLFs中,通过荧光显微镜和RT-PCR检测目的 基因在HPDLFs中的表达.结果 成功克隆人BMP2基因,重组质粒pEGFP-N1-BMP2经PCR及双酶切鉴定均证实hBMP2基因已与pEGFP-N1正确重组.pEGFP-N1-BMP2经超声微泡转染HPDLFs后,通过绿色荧光观察和RT-PCR检测证实hBMP2能够在体外培养的HPDLFs内有效的转录和瞬时表达.结论 成功构建pEGFP-N1-BMP2真核表达载体,通过超声微泡转基因技术成功转染入HPDLFs并得到有效表达,为进一步研究该质粒与超声微泡转基因技术在牙周再生基因治疗中的应用提供实验基础.     

重组BMP7真核表达载体的构建及其对关节软骨细胞的转染

目的：构建pcDNA3.1-BMP7真核表达载体,并探讨转染关节软骨细胞的脂质体和DNA的最佳比例及BMP7基因表达。方法：构建pcDNA3.1-BMP7真核表达载体。用脂质体将pcDNA3.1-BMP7包裹形成DNA脂质体复合物,转染家兔关节软骨细胞,G₄₁₈筛选。转染过程中确定脂质体浓度、脂质体与pcDNA3.1-BMP7质粒的比例。原位杂交、PCR、Western blotting测定BMP7表达。结果：构建了pcDNA3.1-BMP7真核表达载体,脂质体与 pcDNA3.1-BMP7质粒最佳转染浓度为3 mL培养液中加10 μL脂质体和4 μg pcDNA3.1-BMP7质粒(2.5∶1);以400 mg·L^-1 G₄₁₈的正常培养液筛选28 d,BMP7为阳性表达。结论：在脂质体介导下,pcDNA3.1-BMP7转染家兔关节软骨细胞获得成功,且BMP7在该细胞中稳定表达。     

BMP7基因克隆及其在兔关节软骨细胞中的表达

目的：克隆骨形态发生蛋白BMP7基因并检测其在体外培养的兔关节软骨细胞中的表达。方法：从体外培养的幼兔膝关节软骨细胞中提取总RNA;按GenBank BMP7基因序列化学合成2条引物,采用RT-PCR方法得到BMP7基因;将BMP7基因片段插入到真核表达载体pcDNA 3.1中,构建pcDNA3.1-BMP7真核表达载体质粒;利用双酶切、PCR及核苷酸序列分析鉴定BMP7目的基因;将重组pcDNA3.1-BMP7真核表达载体质粒转染家兔关节软骨细胞,分别采用原位杂交、PCR、Western blotting法测定BMP-7表达。结果：克隆得到的BMP7基因核苷酸序列长约1 300 bp,构建的重组pcDNA 3.1-BMP7真核表达载体质粒目的基因BMP-7序列与GenBank报道的BMP-7基因（No. BC008584)一致,转染了BMP7基因的体外培养的成年家兔膝关节软骨细胞表达了BMP7蛋白。结论：成功构建表达BMP7蛋白的转基因关节软骨细胞,其可用于细胞移植治疗或作为种子细胞构建组织工程软骨修复关节软骨缺损。     

携带IRES的BMP2绿色荧光蛋白表达载体的构建和表达

目的:构建携带有BMP2基因的pIRES2绿色荧光蛋白表达载体,为BMP2在体内外表达及蛋白定位提供标记.方法:酶切pCDAN3.1-BMP2质粒,获得BMP2cDNA片段并亚克隆至pUC18载体上,随后用SalⅠ单酶切pUC18-BMP2,再次获得BMP2cDNA,同时用SalⅠ将载体pIRES2-EGFP线性化后去磷酸化修饰.连接二者构建重组质粒.酶切筛选阳性克隆并鉴定插入的方向.重组质粒转染细胞,用激光共聚焦显微镜、RT-PCR及流式细胞仪检测基因在细胞内的定位、表达及转染效率;结果:重组载体经酶切和测序证明构建正确,并在细胞中表达.结论:成功构建了pIRES2-BMP2-EGFP表达载体,为研究BMP2的细胞内定位提供了一个重要而方便的工具.     

重组人骨形成蛋白2在皮肤成纤维细胞中的表达

目的构建人骨形成蛋白2(BMP2)的真核表达载体以探讨成纤维细胞表达BMP2的情况.方法构建携带人BMP2基因的真核表达载体pRK5-hBMP2,并将其转染CHO细胞、NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞后,采用RT-PCR方法检测人BMP2在mRNA水平上的表达.结果RT-PCR显示转染后的CHO细胞、NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞可以有效地转录BMP2 mRNA.结论含有人BMP2 cDNA的重组质粒pRK5-hBMP2转染正常人皮肤成纤维细胞后可以有效地表达BMP2.     

pEGFP-N1-PP1α真核表达载体的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达

目的 构建人PP1α基因真核表达载体, 并观察其在人骨肉瘤细胞株(U-2OS)中的表达,为进一步研究PP1对骨肉瘤细胞凋亡影响提供基础.方法 提取U-2OS细胞中总RNA,RT-PCR扩增PP1α并克隆至pEGFP-N1载体,鉴定出阳性克隆送测序, 以重组质粒转染U-2OS细胞,通过Western blot检测转染细胞中PP1α的表达.结果 成功扩增PP1α基因大小片段,重组质粒pEGFP-N1-PP1α的酶切鉴定及测序结果均证明PP1α基因成功克隆到真核表达载体中,Western blot结果证实转染重组质粒后的U-2OS细胞PP1α蛋白表达水平增强.结论 实验将pEGFP-N1-PP1α质粒转染到U-2OS细胞,可以在U-2OS细胞中获得PP1α蛋白增强表达.     

重组人骨形成蛋白2在皮肤成纤维细胞中的表达

目的 构建人骨形成蛋白2(BMP2)的真核表达载体以探讨成纤维细胞表达BMP2的情况。方法 构建携带人BMP2基因的真核表达载体pRK5-hBMP2，并将其转染CHO细胞、NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞后，采用RT-PCR方法检测人BMP2在mRNA水平上的表达。结果 RT-PCR显示转染后的CHO细胞、NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞可以有效地转录BMP2 mRNA。结论 含有人BMP2 cDNA的重组质粒pRK5-hBMP2转染正常人皮肤成纤维细胞后可以有效地表达BMP2。     

双表达骨形态发生蛋白9、7重组腺病毒载体的构建及其对间充质干细胞C3H10的成骨作用

目的 构建双表达骨形态发生蛋白(BMP)9、7腺病毒重组体并进行初步成骨鉴定.方法 自单一表达的BMP9或BMP7 AdEasy质粒上扩增BMP9和BMP7基因序列,先后定向亚克隆至同一穿梭质粒pASG2,获得双表达穿梭质pASG2-BMP9、7.酶切、PCR鉴定及测序正确后与骨架质粒pAdEasy-1同源重组获得双表达BMP9、BMP7腺病毒质粒,转染至HEK293细胞中包装和扩增得到高滴度双表达BMP9、BMP7腺病毒,体外转染C3H10细胞,碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色检测其早晚期成骨作用.结果 成功构建双表达BMP9、BMP7的腺病毒,RT-PCR证实双表达腺病毒在C3H10细胞中表达,其转染的C3H10细胞早期碱性磷酸酶染色及晚期钙茜素红染色活性较单一表达的BMP7或BMP9腺病毒组增强.结论 成功构建双表达BMP9、BMP7的重组腺病毒载体,其重组体具有定向诱导C3H10细胞成骨分化的能力.     

金属硫蛋白2A重组质粒的构建及其在血管内皮细胞中的表达

目的 建立人血管内皮细胞金属硫蛋白2A(MT2A)上调表达细胞模型.方法 构建重组质粒pEGFP-N1-MT2A,转染至人脐静脉内皮细胞(HUVECs),荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR及蛋白印迹法测定细胞MT2A表达水平.结果 测序证实pEGFP-N1-MT2A重组质粒构建正确,转染至HUVECs后,通过RT-PCR蛋白印迹实验证实细胞MT2A表达水平升高.结论 成功构建了重组质粒pEGFP-N1-MT2A,转染至HUVECs可使MT2A表达水平升高.