CD4+CD25+Treg细胞调节T细胞作用机制的实验研究

目的 :通过检测Treg细胞表达介导抑制性共刺激分子CTLA4和分泌抑制性细胞因子 ,并设置Treg细胞与效应性T细胞共培养和分隔培养实验模型 ,分析Treg细胞对效应性T细胞形成抑制作用的可能机制及各机制的主次要关系。方法 :对比分析Treg细胞与效应性T细胞膜分子CTLA4、CD2 8表达和细胞因子IL 10、TGF β1 分泌水平 ;以TransWellMillicell PCF分隔培养槽分隔培养Treg细胞与不同淋巴细胞组成的反应体系 ,采用向共培养及分隔培养体系加入与不加入IL 10、TGF β1 抗体的阻断方法 ,检测Treg细胞对不同组混合淋巴细胞反应的抑制效率。结果 :Treg细胞分泌IL 10和TGF β1 的浓度水平明显高于效应性T细胞 ,Treg细胞培养上清中IL 10和TGF β1 水平分别达到(380 0± 36 3)pg ml和 (790 0± 5 6 8)pg ml,Treg细胞分泌IL 10和TGF β1 的浓度水平与效应性T细胞比较 ,均有显著性差异 (P <0 0 1)。共刺激分子CTLA4、CD2 8在Treg细胞和效应性T细胞膜表面的表达水平存在明显差异 ,Treg细胞以表达CTLA4为主。Treg细胞对共培养体系混合淋巴细胞反应的抑制效率明显高于分隔培养 ,通过分泌IL 10对效应性T细胞的抑制作用亦明显强于通过TGF β1 。结论 :细胞接触机制是Treg细胞抑制效应性T细胞的主要作用机制 ,而细胞因子机制中     

CD4+CD25+调节性T细胞与肿瘤的研究进展

CD4 CD25 调节性T细胞(Treg)是健康个体T细胞库的组成成分之一,具有独特的生物学功能,能够分泌IL-4、IL-10,转化生长因子-β(TGF-β),表达IL-2Ra(CD25)、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)分子,对效应性T细胞具有抑制作用,是调节性T细胞的重要亚群,参与肿瘤的生长,自身免疫性疾病的发生及耐受移植排斥.现将该类细胞抑制作用机制的研究现况及其与肿瘤关系的研究进展作一综述.     

左归丸对小鼠CD4~+CD25~+调节性T细胞的影响

目的:观察左归丸制剂对小鼠脾细胞中Treg亚群及其相关细胞因子表达的影响。方法:BALB/c小鼠给予不同剂量左归丸处理后,利用流式细胞术检测小鼠脾细胞中Treg亚群(CD4+/CD25+)的变化;采用RT-PCR法检测小鼠脾细胞中IL-10、TGF-β、IFN-γ及Foxp3的表达水平;采用ELISA法检测小鼠外周血中IFN-γ的分泌水平。结果:小剂量左归丸对小鼠脾脏Treg亚群及相关细胞因子的表达没有显著影响;中剂量左归丸可明显上调小鼠脾脏Treg亚群比例(P<0.05),提高Treg特异性胞内信号Foxp3及相关细胞因子IL-10、TGF-β的转录水平,同时抑制IFN-γ的表达;大剂量左归丸可显著降低Treg细胞亚群比例,对Foxp3I、L-10、TGF-β、IFN-γ的表达均有明显的抑制作用(P<0.05)。随着中、大剂量左归丸处理小鼠IFN-γ的转录下调,血清中IFN-γ的水平也明显下降(P<0.05)。结论:左归丸可上调Treg细胞及相关细胞因子的表达水平,抑制IFN-γ的表达,但这种免疫效应有剂量限制性,大剂量应用时显示抑制作用,提示左归丸对Treg亚群有剂量依赖性的双向调节作用。     

悬浮红细胞对CD4+CD25+Treg细胞分化的影响

目的 体外观察悬浮红细胞对异体T淋巴细胞向CD4+ CD25+ Treg细胞分化的影响.方法 采用Ficoll密度梯度离心法和免疫磁珠法从人外周血中分离纯化出CD3+T淋巴细胞,给予CD3/CD28抗体刺激,并分别与异体非去白悬浮红细胞或去白悬浮红细胞混合培养72 h.采用流式细胞仪检测各组培养体系中CD4+ CD25+Treg细胞的比例.采用实时荧光定量PCR检测各组Foxp3 mRNA的表达情况.采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测各组细胞上清中促炎细胞因子[白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)和干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)]和抗炎细胞因子[白细胞介素10(interleukin-10,IL-40)和转化生长因子β(transforming growth factor beta,TGF-β)]的水平.结果 与阴性对照组(细胞培养液组)比较,非去白悬浮红细胞和去白悬浮红细胞组CD4+ CD25+ Treg细胞比例明显增加,功能基因Foxp3 mRNA表达也明显增高;1L-2和IFN-γ促炎细胞因子分泌减少,IL-10和TGF-β抗炎细胞因子分泌增多(P＜0.01).而与去白悬浮红细胞比较,非去白悬浮红细胞作用更加明显(P＜0.05).结论 悬浮红细胞可能通过调节促炎/抗炎细胞因子平衡诱导异体T淋巴细胞向CD4+ CD25+ Treg分化,而悬浮红细胞内残留的白细胞可能在其中起了关键作用.     

左归丸对小鼠CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的影响

目的：观察左归丸制剂对小鼠脾细胞中Treg亚群及其相关细胞因子表达的影响。方法：Balb/c小鼠给予不同剂量左归丸处理后，利用流式细胞术检测小鼠脾细胞中Treg亚群（CD4^＋／CD25^＋）的变化；采用RT-PCR法检测小鼠脾细胞中IL-10、TGF-β、IFN-γ及Foxp3的表达水平；采用ELISA法检测小鼠外周血中IFN-γ的分泌水平。结果：小剂量左归丸对小鼠脾脏Treg亚群及相关细胞因子的表达没有显著影响；中剂量左归丸可明显上调小鼠脾脏Treg亚群比例（P〈0．05），提高Treg特异性胞内信号Foxp3及相关细胞因子IL-10、TGF-β的转录水平，同时抑制，IFN-γ的表达；大剂量左归丸可显著降低Treg细胞亚群比例，对Foxp3、IL-10、TGF-β、IFN-γ的表达均有明显的抑制作用（P〈0．05）。随着中、大剂量左归丸处理小鼠IFN-γ的转录下调，血清中IFN-γ的水平也明显下降（P〈0.05）。结论：左归丸可上调Treg细胞及相关细胞因子的表达水平，抑制IFN-γ的表达，但这种免疫效应有剂量限制性，大剂量应用时显示抑制作用，提示左归丸对Treg亚群有剂量依赖性的双向调节作用。     

CD4~+CD25~+Treg细胞表面CTLA-4及血清IL-10、TGF-β1在类风湿关节炎中的表达及意义

目的通过类风湿关节炎(RA)患者和健康对照组外周血Treg细胞表面CTLA-4的表达水平的比较,以及与细胞因子IL-10、TGF-β1、临床疾病活动度评分DAS28的相关性分析,探讨CTLA-4在类风湿关节炎发病机制中的可能作用。方法选择符合1987年美国风湿病学会制定的RA诊断标准的30名RA患者作为实验组,选择30名健康人为对照组。用流式法测外周血Treg细胞表面CTLA-4的表达水平,用ELISA法测血清IL-10、TGF-β1的水平。结果⑴RA患者外周血Treg细胞表面CTLA-4的表达及血清IL-10、TGF-β1的表达水平要低于健康对照组(P0.01);⑵RA静止组、RA活动组、健康对照组三组间比较,外周血Treg细胞表面CTLA-4的表达及血清IL-10、TGF-β1的表达水平差异有统计学意义(P0.01);⑶相关性分析结果显示RA组中外周血Treg细胞表面CTLA-4的表达与血清IL-10、TGF-β1的表达水平均呈正相关关系,与DAS28呈负相关关系。结论 Treg细胞表面CTLA-4的低表达可能参与了RA的发病,并与RA的疾病活动度有一定关系。     

供体抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞对B淋巴细胞反应的影响

目的 研究供体抗原特异性CD4 CD25 调节性T细胞对受体B细胞反应的影响.方法 用尼龙毛柱法分离B细胞,用MACS磁珠分选法从Lewis大鼠脾脏淋巴细胞中分离CD4 CD25 Treg细胞,然后将分离纯化的Lewis大鼠Treg细胞负载F344大鼠抗原,以RT-PCR检测分选细胞中Foxp3基因表达水平.然后以MTT法证实获得对供体抗原的特异性.将受体Treg细胞与B淋巴细胞组成共培养反应体系,然后向共培养体系中加或不加入Anti-TGF-β1、Anti-CTLA4的阻断方法,培养5天后用ELISA发检测不同组上清中的IgA和IgG分泌水平.结果 负载供体抗原后,CD4 CD25 调节性T细胞对供体抗原的抑制率(IR)为80.5%.Treg与B细胞共培养组与阳性对照组相比较,上清中的IgG和IgA水平明显降低(P＜0.01),分别达到了(2.4±0.7)μg/ml和(6.0±1.0)μg/ml.在体系中加入Anti-TGF-β1后上清中的IgG和IgA的分泌水平分别达到(3.3±0.5)μg/ml和(7.1±0.9)μg/ml;加入Anti-CTLA4后上清中的IgG和IgA的分泌水平分别达到(3.4±0.5)μg/ml和(7.3±0.9)μg/ml;两种阻断剂同时加入后上清中的IgG和IgA的分泌水平分别达到(3.7±0.6)μg/ml和(7.5±0.7)μg/ml,三组分泌水平都较共培养组明显升高(P＜0.05),但仍明显低于阳性对照组的水平((P＜0.05).结论 负载供体抗原的CD4 CD25 Treg能够有效抑制供体抗原刺激下的B淋巴细胞反应,在这一过程中TGF-β1和CTLA4都发挥了一定作用.     

乳腺癌手术患者 CD8＋CD28-抑制性T 细胞的表达及其临床意义

目的：：探讨 CD8＋CD28-抑制性 T 细胞在乳腺癌手术患者外周血中的含量及其 TGF-β1和IL-10的表达及临床意义。方法：以健康人及良性乳腺增生患者为对照,选取60例乳腺癌患者,其中手术患者43例,采用流式细胞术检测手术前后静脉血 CD8＋CD28-抑制性 T 细胞及其表达的细胞因子转化生长因子β1（TGF-β1）及白介素10（IL-10）的百分含量;并将三者与肿瘤分期进行相关性分析。结果：乳腺癌患者与健康人及良性乳腺增生患者比较,CD8＋CD28-抑制性 T 细胞、TGF-β1及 IL-10均明显升高（P 0.05）。手术后,乳腺癌患者 CD8＋CD28-抑制性 T 细胞、TGF-β1及 IL-10均较术前明显下降（P 0.7,P 〈0.05）。结论：CD8＋CD28-抑制性 T 细胞、TGF-β1及 IL-10均升高可能是乳腺癌重要的发病机制之一,且与肿瘤分期密切相关,具有重要临床意义。     

CD137信号下调乳腺癌患者外周血Treg细胞的免疫抑制功能

目的探讨CD137信号对CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（Treg）的生物学效应及机制。方法采用激发型抗人CD137单抗加入PHA刺激的乳腺癌患者外周血T细胞培养体系及Treg细胞培养体系中,利用细胞计数及^3H-TdR掺入法分析T细胞的增殖,流式细胞术分析细胞膜分子和Foxp3表达,ELISA分析细胞因子的分泌。结果CD137分子表达于乳腺癌患者外周血CD4^＋CD25^＋Treg细胞膜;抗人CD137单抗加入PHA活化的乳腺癌患者T细胞培养体系后,T细胞增殖明显增加,Foxp3^＋Treg细胞比例明显下降;激发CD137信号可下调CD4^＋CD25^＋Treg细胞的Foxp3表达,抑制Treg细胞产生TGF-β1和IL-10,以及下调Treg细胞对PHA刺激的CD4^＋CD25^-T细胞增殖的抑制效应。结论CD137信号可抑制Treg细胞的免疫抑制功能,CD137可能是对Treg细胞进行免疫干预的重要靶点。     

Graves′病患者CD4+ CD25+调节性T细胞功能初探

目的：探讨调节性T细胞( Treg)在Graves’病( GD)发生中所起的作用。方法流式细胞术检测20例GD患者( GD组)和10例健康对照者(健康对照组)外周血Treg数量。3 H掺入试验测定Treg与效应T细胞( Teff)共培养环境中的Treg对其增殖抑制作用,ELISA法测定白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-2(IL-2)等细胞因子的浓度。结果Treg所占CD4+细胞的比例在GD组与健康对照组中差异无统计学意义。 GD组的Treg抑制功能与健康对照组相比显著降低。两组之间的细胞因子浓度有一定的差异,GD组IL-10水平显著低于健康对照组,IL-2和白细胞介素-17(IL-17)水平显著高于健康对照组。结论 GD患者的Treg有功能缺陷,与甲状腺自身免疫性疾病的发病有一定的关系。 Treg在GD中的诊断价值以及病理生理机制值得进一步探讨。     

调节性T细胞和共刺激通路阻断剂抑制大鼠肝移植急性排斥反应的研究

目的探讨CD4^＋CD25^＋调节性T细胞、共刺激通路阻断剂CD154单抗及两者联合应用在抑制大鼠肝移植急性排斥反应中的作用。方法48例原位肝移植大鼠（DA→Lewis）分为A组：对照组;B组：术前7d回输经DA大鼠脾细胞体外激活的Lewis大鼠CD4^＋CD25^＋细胞;C组1术后第1、2d腹腔注射CD154单抗（15m/kg）;D组：联合应用CD4^＋CD25^＋细胞和CD154单抗。术后7d各组处死6只受体,观察移植肝病理变化,检测移植肝内T细胞亚群和细胞因子白细胞介素之（IL-2）、IL4、IL-10和转化生长因子B1（TGFβ1）表达情况;分离脾淋巴细胞与供体行单向混合淋巴细胞反应观察刺激指数。余大鼠观察生存情况。结果D组平均存活时间（52．00±10．64）d明显长于其他各组（P〈0．01）;移植肝内淋巴细胞浸润数量（2．47±0．61）×10^6和CD8^＋细胞百分比（14．2±3．0）％明显低于B、C组（P〈0．05、P〈0．01）,而CD4^＋CD25^＋细胞比例（16．4±4．3）％高于B、C组（P〈0．05,P〈0．01）。移植物内IL-2mRNA表达A组最高,D组最弱;IL4mRNA各组均弱表达;IL-10mRNAB、D组高表达,A、C组未表达;TGFβ1mRNAB、D组表达明显强于A、C组。单向混合淋巴细胞反应D组刺激指数最低（P〈0．05）。结论CD4^＋CD25^＋调节性T细胞和共刺激通路阻断剂CD154单抗均能抑制大鼠肝移植急性排斥反应;联合应用CD154单抗明显增强CD4^＋CD25^＋调节性T细胞对急性排斥反应的抑制作用。     

Changes of CD4^＋CD25^＋ Regulatory T Cells in Patients with Acute Coronary Syndrome and the Effects of Atorvastatin

The function of CD4＋CD25＋ regulatory T lymphocytes （Treg） in patients with acute coronary syndrome （ACS） and the effects of atorvastatin were investigated. Forty-eight patients with ACS were randomly divided into two groups： group C receiving conventional therapy （n=24）, and group C＋A receiving conventional therapy＋atorvastatin （10 mg/day, n=24）. T lymphocytes from ACS patients （before and 2 weeks after the treatment） or 18 healthy subjects were separated and the flow cytometry was used to measure the percentage of Treg. The inhibitory ability of Treg on effector T cells was determined by mixed lymphocyte reaction （MLR）. ELISA was used to measure the serum levels of cytokines （IL-10, TGF-β1 and IFN-γ） before and after treatment. The results showed that as compared with normal control group, Treg percentage was decreased significantly （P〈0.01）, the inhibitory ability of Treg on the T lymphocytes proliferation was reduced （P〈0.01）, IFN-γ levels were increased and IL-10 and TGF-β1 levels were lowered in ACS patients. After treatment with atorvastatin, Treg percentage and the inhibitory ability of Treg on T lymphocytes proliferation were significantly increased in ACS patients. Serum IFN-γ was decreased significantly, while IL-10 and TGF-β1 were elevated significantly as compared with the non-atorvastatin group. The number of Treg was positively correlated with serum TGF-β1, but negatively with serum IFN-γ and CRP. It was concluded that ACS was associated with decreased number and defected function of Treg, which may play an important role in initiating immune-inflammatory response in ACS. The inhibitory effects of atorvastatin on inflammation in ACS may be due to its beneficial effects on Treg and restoration of immune homeostasis.     

供体抗原特异性CD4+CD25+Treg细胞对肾移植大鼠免疫状态的影响

目的 研究供体抗原特异性CD4 CD25 调节性T细胞(Treg)对肾移植后大鼠免疫状态的影响.方法 常规分离Lewis和F344大鼠脾脏淋巴细胞,然后将Lewis大鼠淋巴细胞负载F344大鼠抗原,然后从负载抗原后的Lewis大鼠淋巴细胞悬液中用MACS磁珠分选法分离纯化供体抗原特异性CD4 CD25 Treg细胞,并用流式检测分选Treg细胞纯度以及RT-PCR检测分选细胞的Foxp3基因表达.以F344、Lewis大鼠分别为供、受体建立同种异体肾移植动物模型,将供体抗原特异性Treg细胞经尾静脉注射入受者体内(治疗组,n=8),选取未注射组为对照组(n=8).于术前1d,术后15d检测移植后4组大鼠血清IL-10、IgG,并于术后15d MTT法检测受体脾细胞对供体抗原刺激的反应.结果 所分选之CD4 CD25 Treg细胞成功获得供体抗原特异性,对供体抗原的抑制率(IR)为85.4%,并检测到Foxp3表达.移植前治疗组和对照组大鼠血清中均无法检测到IL-10浓度.术后15d治疗组血清IL-10与对照组比较,明显增高(P＜0.01).对照组在术后15d血清IgG浓度已经显著升高,较术前差异有统计学意义(P＜0.05).而治疗组术后15d血清IgG浓度与术前相比有所降低,与术前相比差异无统计学意义(P》0.05),但与对照组相比较均差异有统计学意义(P＜0.05).治疗组对供体脾细胞的刺激反应也明显低于Ⅰ组(P＜0.01).结论 供体抗原特异性CD4 CD25 Treg细胞能显著促进体内IL-10的产生以及抑制免疫球蛋白IgG的产生,并且可特异性抑制受体对供体抗原的免疫反应.     

下调Foxp3基因表达对人调节性T细胞功能的影响

目的 利用RNA干扰技术下调Foxp3表达,观察其对人CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)表型及功能的影响.方法 利用Foxp3 siRNA转染人CD4+CD25+Treg,荧光显微镜和流式细胞仪(FACS)检测转染效率,实时定量PCR和Western印迹分别鉴定Foxp3基因及Treg功能相关基因表达、Foxp3蛋白表达,细胞增殖实验检测Treg抑制功能,FACS测Treg表型标记,ELISA检测细胞因子表达.结果 Foxp3 siRNA转染人CD4+CD25+Treg效率为68%,与对照组相比,转染后的细胞Foxp3基因下调了61.4%(P<0.01),Foxp3蛋白表达较低,Treg功能相关基因和主要表型标记也较对照组有改变,差异有统计学意义.功能试验提示无论是在异种还是同种抗原刺激的淋巴细胞反应中,Foxp3 siRNA转染的Treg与对照组相比,对效应性T细胞的抑制作用较弱(异种抗原组83%比48%,P<0.05;同种抗原组65%比28%,P<0.01),且主要抑制性和效应性细胞因子的表达下降,差异有统计学意义.结论 Foxp3是人天然Treg 维持其抑制性功能的核心细胞内标志.

Abstract：

Objective To employ the technology of interfering RNA (RNAi) to identify the role of Foxp3 in the in vitro suppressive effect of human regulatory T cell (Treg) on effector T cells. MethodsExpanded human Treg were transfected with siRNA targeting Foxp3 genes. The transfection efficiency, the level of corresponding gene and its protein expression were measured by fluorescent microscopy, fluorescence-activated cell sorting (FACS), real-time PCR and Western blot respectively. The phenotypes of Treg were analyzed by FACS. The siRNA transfected Treg was then co-cultured with porcine PBMC or human PBMC-stimulated autologous CD4+CD25- T cells. Their proliferations were examined by WST-1. Treg and autologous CD4+CD25- T cell-related suppressive cytokines were assessed by ELISA. ResultsA 68% transfection efficiency in expanded Treg was achieved for Foxp3 siRNA. Real-time PCR revealed a 61.4% mRNA knockdown induced by siRNA targeting Foxp3 genes in Treg versus the control (P<0.01). Some Treg-associated surface markers were significantly altered versus the control. And the production of suppressive cytokines was lowered. These changes were correlated with the diminished Treg activity in suppressing the proliferation of effector CD4+CD25-T cells. There was 83% suppression by non-transfected Treg vs 48% suppression by Foxp3 siRNA transfected Treg in xeno-immune response (P<0.05);and 65% suppression by non-transfected Treg vs 48% suppression by Foxp3 siRNA transfected Treg in allo-immune response (P<0.01). Conclusion Foxp3 is a key intracellular marker for maintaining the phenotypes and functions of Treg.     

Involvement of CD4^＋CD25^＋ regulatory T cells in the pathogenesis of polycythaemia vera

Background Regulatory T cells （mreg） have been shown to play an important role in the regulation of hematopoietic activity. However, there is no information about the effect of Treg cells in the pathogenesis of polycythaemia vera （PV）. Methods In this study, we investigated the percentage and function of Treg cells in the peripheral blood of 21 PV patients and 25 healthy donors, mreg cells were identified and characterized as CD4^＋CD25^＋FOXP3^＋ by flow cytometry. The suppressive activity of CD4^＋CD25^＋ Treg cells was assessed by the proliferation and cytokine secretion of the co-cultured CD4^＋CD25^- fractions. Results The results showed that the percentage of Treg cells in the peripheral blood of PV patients significantly increased compared to healthy controls （（10.93±4.02）% vs （5.86±1.99）%, P 〈0.05）. Moreover, the mRNA and protein expression of FOXP3 was higher in CD4^＋CD25^＋ Treg cells. Coordinately, when co-cultured with the activated CD4^＋CD25^- cells, the CD4^＋CD25^＋ Treg cells showed enhanced suppressive function in PV. Yet, the underlying mechanism for the increased frequency and function of CD4^＋CD25^＋ Treg cells is still to be clarified. Conclusion Treg cells expansion might account for the abnormal T cell immunity in PV patients and thus contribute to the pathogenesis of PV.     

细胞因子及胸腺微环境影响Treg细胞增殖机制研究

目的通过体外培养体系添加细胞因子和在体细胞因子胸腺注射的方法,探索扩增低比例低增殖活性的Treg细胞的有效体内外方法.方法采用不同浓度细胞因子IL-10和TGF-β1作为诱导剂,分析二因子体外诱导Treg细胞增殖的有效性及最适浓度,同时以二因子胸腺注射的方法,分析在成年鼠体内诱导Treg细胞增殖的可能性.结果 150 ng/ml IL-10浓度能够明显诱导Treg细胞增殖,经48、96、144 h诱导后,其增殖比例分别达到10%、18%和20%,而TGF-β1的使用浓度需达到300 ng/ml;IL-10胸腺注射后同样可提高Treg细胞的比例[第7天(5.50±1.38)%,P<0.05;第10天(6.65±2.54)%,P<0.01];TGF-β1诱导后第5天的比例为(5.19±1.69)%,较对照组也有明显升高(P<0.05).结论体外培养体系添加诱导因子增殖的方法是扩增低比例低增殖活性Treg细胞的首选方法,IL-10体内外诱导Treg细胞增殖的效能均强于TGF-β1.     

CD4~+CD25~+调节性T细胞对哮喘大鼠免疫功能影响

目的:观察CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)对CD4+CD25-T细胞增殖和Th1/Th2细胞因子分泌的影响,探讨其在哮喘气道炎症中的作用机制。方法:将哮喘大鼠CD4+CD25-T细胞分别与卵白蛋白(OVA)免疫耐受大鼠CD4+CD25+Treg细胞和哮喘大鼠CD4+CD25+Treg细胞联合培养,3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法测量细胞增殖情况,ELISA检测细胞IL-4、IL-5和IFN-γ含量。结果:OVA耐受大鼠CD4+CD25+Treg细胞能抑制CD4+CD25-T细胞增殖和Th2细胞因子分泌(P<0.05);哮喘大鼠CD4+CD25+Treg细胞可明显抑制IFN-γ的分泌(P<0.05)。结论:OVA免疫耐受大鼠CD4+CD25+Treg细胞可能通过抑制哮喘大鼠CD4+CD25-T细胞增殖和影响Th1/Th2平衡发挥作用,哮喘大鼠CD4+CD25+Treg细胞存在功能异常,可能与哮喘的发病有关。     

人天然CD4+CD25+调节性T细胞的体外扩增培养及鉴定

目的：建立有效的体外培养扩增人天然CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的体系,并检测扩 增细胞的表型及体外免疫抑制功能,为Treg应用于临床免疫治疗提供实验基础。方法：免疫磁珠分离(MACS)方法从 人外周血单个核细胞中分离CD4+CD25+Treg,加入抗CD3/CD28包被磁珠刺激扩增;用台盼蓝染色法测定新鲜分选 的和扩增的Treg的数量和活性,用流式细胞法检测新鲜的和扩增的Treg主要表型标志和纯度,用混合淋巴细胞反应 (mixed lymphocyte reaction,MLR)法检测扩增的Treg对羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酶(CFSE)标记的自体和异体的 CD4+CD25–T细胞增殖的抑制作用。结果：扩增3周后Treg数目约为新鲜分选细胞数的2 000倍(由5.23×105±1.52×105扩增 至1.02×109±0.20×109),活性>97%。扩增3周后的Treg与新鲜分选细胞保持了相似的表型特征：CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺三阳细 胞约占(94.22±2.12)%,与新鲜分选细胞相似。扩增3周后的Treg对自体和异体的CD4+CD25–T细胞的增殖均有明显的抑 制作用,抑制率随着效靶比浓度的增高而增高(P<0.01),而且其各浓度梯度对自体和异体CD4⁺CD25^–T细胞的抑制率 无明显差异(P>0.05)。结论：创建的分离和体外扩增人CD4⁺CD25⁺Treg的方法,可以大量扩增出高纯度且保留其免疫 抑制功能的Treg,解决了Treg数目少的问题,有利于进一步的免疫研究和治疗。