腺病毒携带的LacZ基因静脉注射后在大鼠体内的表达

目的 :探讨周围静脉注射的腺病毒载体介导的外源基因在体内不同组织的表达。方法 :将重组LacZ腺病毒经尾静脉注射导入Wistar大鼠体内 ,以X -gal染色法明确腺病毒载体介导的标识基因 (LacZ)在大鼠体内的表达部位和时间。结果 :β- gal表达具有剂量依赖性 ,而且存在器官、组织和细胞三种水平的表达差异。剂量较小时 ,肺、肾、肝、脾优先表达 ,而心肌在 1× 1 0 1 1 pfu/kg剂量组才有少量表达 ,大血管和脑组织始终未见表达。注射后 1～ 2周 ,大鼠的肾、肺、肝、脾、肾上腺高表达 β -半乳糖苷酶 ,3～ 4周表达量减少 ,5周基本消失。 结论 :腺病毒介导的外源基因经静脉途径转移 ,可能是肾、肺、肝的部分疾病基因治疗的有效基因转移途径 ,而对心脑血管疾病不适合。     

经鼠中心静脉途径注射重组腺病毒的基因转染效率及靶向性

目的：探讨经中心静脉途径注射外源基因在大鼠体内不同组织的表达及靶向性。 方法:将重组腺病毒AdLacZ经中心静脉途径导入SD大鼠体内,以X-gal染色法检测腺病毒介导的标识基因（LacZ）在大鼠体内的表达部位和时间。结果:注射AdLacZ（1×109pfu/mL）后1d,大鼠肺、肝、肾、脾组织即有少量表达。3d后大鼠肺、肝、肾、脾组织LacZ基因表达明显,7d时达高峰,14d开始下降,28d基本消失。肺组织,第3,7,14,21d,LacZ基因明显高于其他组织（P<0.05）,脑组织始终未见表达。结论:腺病毒携带的外源基因,经中心静脉途径给药,可能是肺、肝、肾等疾病基因治疗的有效途径,尤其适用于肺部疾病的基因治疗。     

腺病毒介导基因转染活体眼组织的研究

目的 :了解活体内不同途径应用腺病毒转染外源基因在眼组织的分布情况 .方法 :将含有 β 半乳糖苷酶 (beta galactosidase,β gal)报告基因的腺病毒 ,在 1× 10 9～ 1× 10 11nfu·L-1的滴度下 ,分别采用玻璃体腔内注射、前房注射、表面点药及球旁注射到大鼠眼内 ,3d ,1,2 ,3和 4wk后用 β gal染色法观察 β gal基因在眼组织内的分布情况 .结果 :各病毒滴度组均可有效地转染外源基因 ,且未观察到细胞病理改变 .玻璃体腔内注射的大鼠眼球组织包括角膜、虹膜、睫状体、视网膜均有β gal基因表达 ,前房注射组角膜、虹膜、睫状体有表达 ,表面点药组仅有角膜上皮细胞表达 ,球旁注射组眼外肌有表达 .注射 3d后开始出现 β gal基因阳性表达 ,持续达 4wk以上 .结论 :腺病毒能有效、稳定地转染外源基因到活体眼组织的角膜、虹膜、睫状体、视网膜     

脂肪组织的干细胞作为神经系统基因治疗载体的研究

目的观察大鼠脂肪组织源性基质细胞表达外源基因的能力和脑内移植后的分布，以获取基因治疗自体移植的载体细胞。方法腺病毒载体Ad5βgal介导法将LacZ转入培养的大鼠脂肪组织源性基质细胞。Hoechst33258标记细胞，立体定向移植到大鼠的纹状体，脑组织切片，在荧光显微镜下检查存活的细胞。结果脂肪组织源性基质细胞能够在体内和体外稳定表达LacZ基因，细胞移植到脑内可以移行，移植细胞没有过渡增生和肿瘤形成，对宿主脑组织无破坏。结论脂肪组织源性基质细胞可以稳定表达夕J源基因，与脑组织有很好的相容性，是中枢神经系统基因治疗的良好载体。     

3腺病毒介导的LacZ基因在B16小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的　观察腺病毒介导的LacZ基因转移在B1 6细胞的转导效率。方法　腺病毒介导的LacZ基因转导B1 6细胞。结果　当MOI为 50～ 1 0 0 ,即可获得较高的转导效率 ,达 90 %± 1 %。结论　腺病毒介导的基因转移在B1 6细胞能获得较高的转导效率和目的基因的有效表达。提示腺病毒载体作为一种高效的基因转移载体 ,在肿瘤的基因治疗中有着良好的应用前景     

CTLA4Ig基因表达对鼠皮肤移植免疫抑制作用的研究

目的　探讨静脉注射CTLA4Ig腺病毒后在大鼠体内的表达和对同种异体移植皮肤存活的影响 ,以及该载体应用的安全性 ,为该基因治疗方法在抑制器官移植排斥反应的临床应用奠定基础。方法　供体SD大鼠皮肤移植前 1周 ,用腺病毒作载体将CTLA4Ig导入Wistar大鼠体内 ,用蛋白质斑点印迹实验检测血清中CTLA4Ig的表达 ,用腺病毒荧光抗体检测腺病毒在脏器的分布。同时还观测了各脏器的病理改变及移植物生存时间。结果　CTLA4Ig腺病毒在肝、脾、心、肺、肾均有明显分布 ,但实质细胞均未见严重损伤性改变。CTLA4Ig基因能在血清中的表达高峰时间一般在 7d左右 ,移植皮肤的生存显著长于对照组 (P <0 .0 5 )。结论　从静脉注射导入的CTLA4Ig基因能在大鼠体内表达并对同种移植的排斥反应有明显的抑制作用。     

肝脏靶向表达大鼠白介素-10基因对猪血清诱导的大鼠肝纤维化的抑制

目的 探讨肝脏靶向表达rIL-10基因对猪血清诱导的大鼠肝纤维化的抑制作用.方法 rIL-10基因通过尾静脉快速大容量注射法转移至大鼠体内,RT-PCR法检测大鼠肝、肾、脾和肺组织rIL-10 mRNA的表达及S-P免疫组化法检测rIL-10蛋白在肝脏中表达.30只体质量100～120 g清洁级雄性SD大鼠按随机数字表...     

携带lacz报告基因的腺病毒载体在大鼠滑膜组织中的表达

目的：观察lacz报告基因重组腺病毒对滑膜组织的转染能力及表达持续时间。方法：55只雄性Wistar大鼠随机分为11组，每组5只。将100μl lacz报告基因的腺病毒载体(pAxCAI lacz)进行保关节腔注射，注射后分别于第1、2、3天及第1、2、3、4、5、6、7、8周时处死1组大鼠，采用x—gal染色的方法观察腺病毒在滑膜组织中的表达情况，计算机图像分析定量描述其表达的时相性改变。结果：x—gal染色显示，腺病毒转染滑膜组织后，报告基因在滑膜衬里层及滑膜下层的组织细胞中表达，表达的高峰出现在转染后3—7d，持续表达时间一直维持到转染后7周。结论：腺病毒载体可以高效实现体内基因的转移和表达，是一种可用于关节滑膜组织体内转基因治疗的基因载体。     

腺病毒介导的β—半乳糖苷酶在小鼠气道上皮的转基因表达

目的：以β－半乳糖苷酶基因为标志基因研究重组复制缺陷腺病毒在 小鼠肺内气道上皮细胞中的转基因表达。方法：带有LacZ表达基因的重组复制缺陷腺病毒（AdCMVLacZ）,经鼻腔吸入法和气管内注射法两种途径分别感染小鼠肺组织,此后在不同时间取小鼠肺组织经多聚甲醛固定后,以X-gal染色。石蜡包埋切片后用核固红复染。结果：β－半乳糖苷酶经重组复制缺陷腺病毒AdCMVLacZ感染小鼠气道和肺泡上皮细胞,并高效表达目的基因,表达时间可长达31天,重复感染后仍可表达13天。结论：重组复制缺陷腺病毒可携带外源性基因在小鼠气道上皮细胞内进行高效、稳定和较为长期的转基因表达。     

将含有报告基因LacZ的重组腺病毒载体从大鼠鼻腔转移至脑的实验研究

目的 探讨将携带有报告基因的腺病毒载体由鼻腔转移至脑途径的可行性.方法 将携带半乳糖苷酶报告基因(LacZ)的5型重组腺病毒载体(Ad5 CMV LacZ)注入SD大鼠鼻腔黏膜,分别在注射3 d、7 d、14 d、21 d及28 d切取大鼠鼻腔黏膜以及与嗅觉信息传导途径相关的脑组织,进行冰冻切片和β-半乳糖苷酶(β-gal)免疫组织化学反应显色,判断该载体是否转染和表达蛋白质产物.结果 β-gal免疫组化染色反应显示,该病毒载体从第3天起即可在鼻腔黏膜与嗅球内的细胞转染和表达,在第7天至第21天病毒载体逐渐向颅内深部的室管膜下区、杏仁核及齿状回细胞转移和表达,持续性表达蛋白质产物达28 d之久.结论 经鼻腔黏膜注入腺病毒载体不仅可将外源性基因转移到脑实质内,还可确保外源性基因转染和表达成功.     

人B7-1基因的cDNA克隆及其重组腺病毒载体制备

目的：构建并制备含人B7-1基因的重组腺病毒（Ad-B7-1)载体,为后续的肿瘤基因治疗研究提供实验基础。方法：应用逆转录-套式PCR方法从人骨髓细胞中克隆B7-1的cDNA后,将其克隆至小片段腺病毒载体pCI′中,后与pHBG10在293细胞内重组包装产生腺病毒,感染SGC7901细胞。结果：成功克隆了人B7-1的cDNA并构建Ad-B7-1载体,且经过酶切鉴定和测序验证,感染Ad-B7-1的细胞经PCR鉴定,表明B7-1基因已整合入细胞基因组。结论：本实验构建的腺病毒载体可有效地转B7-1基因进入肿瘤细胞,该结果为下一步应用于体内肿瘤基因治疗研究提供了实验基础。     

成年大鼠侧脑室注射与脑实质注射腺病毒表达载体转染脑细胞的比较研究

目的比较观察脑室注射和脑实质注射腺病毒表达载体转染脑细胞的范围及表达产物的程度。方法分别将Ad5CMV LacZ表达载体（20μl,病毒滴度为1．01×10^5pfu／ml）注入成年SD大鼠右侧脑室、尾壳核、内侧隔核-斜角带复合体和背侧海马,在注射后3～28d将大鼠脑制作成为切片,进行X-gal组织化学反应,观察被转染和表达的细胞形态和数目。结果在侧脑室内注射后3d,右侧侧脑室室管膜细胞及其下层开始有病毒载体转染和表达,继之向对侧侧脑室、第三脑室和第四脑室转染和表达产物,脊髓中央管壁偶尔有被转染和表达的细胞;而将等体积和等滴度的AdSCMV LacZ载体注入尾壳核、内侧隔核-斜角带复合体和背侧海马,则均出现直径约2～5mm的转染范围,表达产物的细胞离注射原位最远处约为5—6mm,细胞表达产物很局限并相对集中;而侧脑室注射病毒载体可以随脑脊液流动而使转染范围广,但被转染细胞主要集中在室管膜及其下层,离脑室壁最远处也只在0．5—2mm范围内。结论侧脑室注射病毒表达载体便于基因治疗弥漫性脑疾病;而脑实质注射病毒表达载体则利于基因治疗局部性脑疾病。     

Gene transfer and expression in rat anastomotic artery in vivo using adenoviral vector

Objective To observe the efficiency and time course of gene expression and the safety of a denoviral vector mediated gene transfer in vivo.Methods After soaking soluble stents in a high concentration of glucose solution contain ing Adv(5)-CMV (cytomegalovirus) (control group) or Adv(5)-CMV/LacZ (treatment group) for 30 minutes, the stents were inserted into the lumina of cut rat caro tid arteries and end-to-end anastomoses of the cut carotid were performed with standard microvascular surgical techniques. On days 2, 7, 14, 28, 60 and 90 af ter gene transfer, anastomotic arteries of the two groups were observed. On da ys 7 and 14, the ascending aortas, hearts, brains, livers, lungs, spleens and ki dneys of the treatment group were observed. All samples were analyzed for the presence of β-galactosidase activity and histochemical staining.Results β-galactosidase activity was not detected in the carotid arteries of the contr ol group and organs not directly exposed to adenoviral vector of the treatment g roup. The amount of β-galactosidase activity(×10(-3) U/g tissue) in t he treatment group on the 2nd, 7th, 14th, 28th, 60th and 90th day after gene tra nsfer was 3.87, 11.38, 9.8, 6.43, 3.18 and 2.43, respectively. Microscopi c examination of sections from vessels of the control group and from the aortas, hearts, brains, livers, lungs, spleens or kidneys of the treatment group reveal ed no X-gal staining. Microscopic examination of carotid arteries of the treat ment group revealed blue-staining in all anastomotic arteries and in all layers of the arterial wall observed on days 7 and 14 after gene transfer.Conclusion Adenoviral vector can effectively infect blood vessels in vivo. After adenovira l vector mediated direct gene transfer into anastomotic rat carotid arteries, re combinant gene expression began on day 2, peaked between days 7 and 14, prominen tly declined after day 28, and persisted at low levels more than three months. A recombinant gene could be delivered to a specific site by direct gene transfer in vivo by adenoviral vector infection.     

Adenovirus induced acute hepatitis in non-human primates after liver-directed gene therapy

Objective To define the mechanism of acute hepatitis in non-human primates after liver directed gene therapy.Methods Differences in immune response exhibited by 8 rhesus monkeys receiving adenovirus (Ad) or lipofectamine-mediated gene transfer by various routes, the time course, and the nature of the specific immune responses to both adenoviral vectors and transgene products were studied using HE staining (H&amp;E) and immunohistochemical staining. Results The monkeys developed mild to moderate acute hepatitis 1 to 3 weeks after intravenous or intrabiliary injection of first generation replication-defective adenoviruses carrying the Escherichia coli lacZ gene.This was accompanied by adenovirus-mediated T-cell proliferation and neutralizing antibodies to the adenovirus.Increased numbers of CD3(+), CD4(+) and CD8(+) T-lymphocytes were detected in the diseased livers, while B-lymphocytes were absent.Hepatocytes demonstrated increased expression of β2-microglobulins (β2-MG) and HLA-DR antigens in the plasma membranes.The development of acute hepatitis and the accompanying immune abnormalities were delayed in immunosuppressed monkeys until after the discontinuation of immunosuppressive therapy.The monkeys infused with Ad.CMVluc showed more significant and longer durations of hepatitis than the monkeys infused with adenoviruses carrying the lacZ gene.Lipofectamine-mediated gene transfer was inefficient.There was neither lacZ expression nor significant immune response in the liver of monkeys infused with lipofectamine via the portal vein or the common bile duct. Conclusion Immune response to the hepatocytes in liver directed gene therapy is MHC class I restricted and T-cell mediated.Both adenoviral vectors and foreign genes are related to the liver damage.Mild to moderate hepatic inflammation seen with the E-1 deleted vector is reversible.Immunosuppression regimens may prolong transgene expression and delay the development of acute adenoviral hepatitis.     

含CD基因的腺病毒载体制备及体外抑瘤效果观察

目的：制备含胞嘧啶转氨酶（CD）基因的重组腺病毒（Ad-CD)并进行体外肿瘤的自杀基因治疗。方法：构建含CD或LacZ基因的重组腺病毒载体。在293细胞内重组包装后,体外感染小鼠结肠癌细胞株C26,并给予不同浓度的前药氟胞嘧啶（5-FC）进行肿瘤杀伤效果观察。结果：重组腺病毒载体构建成功。用制备的Ad-CD液感染C26细胞,并予以不同浓度5-FC后,肿瘤细胞生长受不同程度抑制,而对照组细胞和原位转LacZ基因的C26细胞的生长未出现明显的变化。结论：应用腺病毒载体转CD基因进行体外肿瘤治疗效果明显,为自杀基因应用于体内结肠癌的基因治疗研究奠定基础。     

外源性Rb基因转染对头颈肿瘤的抑制作用

目的　探讨外源性 Rb基因对头颈肿瘤的抑制作用。方法　运用携带 Rb基因的复制缺陷型腺病毒转染口腔鳞癌细胞株 0 12 ,观察其体内和体外的抑癌效果。结果　腺病毒表达载体可有效地将外源性 Rb基因转染 0 12细胞并使其表达。体内、体外抑瘤实验表明 :导入 Ad- Rb基因的肿瘤细胞 ,其细胞生长曲线明显受抑制 ,Ad- Rb基因治疗组裸鼠肿瘤生长最为缓慢 ,与 DL312和 PBS对照组比较有显著性差异 (P<0 .0 5 )。结论　腺病毒介导的外源性 Rb基因可有效地转染入口腔鳞癌细胞株 ,并抑制其生长。     

外源基因在体内表达实验研究

目的：探讨Ｗｉｓｔａｒ大鼠舌肌是否具有摄取外源ＤＮＡ并表达其携带基因的能力。方法：将质粒ｐＳＶ４０－β－ｇａｌ扩增、纯化后溶于３０％ 蔗糖溶液中,取５０ μｇ 质粒ＤＮＡ 直接注射于Ｗｉｓｔａｒ大鼠舌肌中。１ 周后用Ｘ－ｇａｌ组织化学染色分析质粒ＤＮＡ 在体内表达。结果：在Ｗｉｓｔａｒ大鼠舌肌中检查出报导基因产物β－ 半乳糖苷酶的表达。结论：Ｗｉｓｔａｒ 大鼠舌肌具有摄取外源ＤＮＡ并表达其携带的基因的能力,是一个理想的用来体内分析外源基因表达、调控的模型