人ICOS-Linker-Ig真核表达载体构建及二级结构分析

目的构建人重组ICOS-Linker-Ig真核表达载体并预测其二级结构及Linker的合理性。方法扩增人ICOS胞外域及IgG Fe段，设计一段柔性Linker将二者连接。经测序分析得到融合基因序列。应用核酸和蛋白质序列分析软件EditSeq^TM对融合基因及Linker部位翻译后二级结构水平的一些生物学特性，诸如柔性、抗原性、亲水性及表位等加以预测分析。结果ICOS-Linker-Ig融合基因的氨基酸序列经软件分析，并分别与ICOS和IgG单独分析结果比较，发现在二级结构水平未出现新的抗原性，同时Linker部位具有很低的抗原性，亲水性无改变，Linker部位呈中性且柔性良好，不影响两端蛋白质二级结构和融合蛋白空间构象。ICOS和Ig具有各自原来的表位特征，无新表位出现。结论本研究构建的ICOS-Linker-Ig能够保留ICOS和Ig各自生物活性和功能，计算机分析表明翻译后不影响蛋白质空间结构的形成，适合融合蛋白功能的发挥。     

人血清白蛋白与促红细胞生成素融合蛋白的构建及表达

目的 构建重组人血清白蛋白促红细胞生成素融合蛋白(HAS-EPO)表达载体,用CHO细胞表达该重组蛋白.方法 PCR扩增出人血清白蛋白基因(HAS)和促红细胞生成素基因(EPO);合成编码多肽GS (GGGGS)3的DNA片段作为接头(Linker),采用重叠PCR的方法将Linker与EPO基因拼接成LEPO基因.H...     

HBVS-ecdCD40L融合基因构建及相应融合蛋白的二级结构预测

目的构建HBVS—ecdCD40L融合基因,并利用软件对其相应融合蛋白的二级结构进行预测。方法利用分子生物学技术将HBVS基因与人CD40L胞外段基因进行融合,构建融合基因及其真核表达载体,并利用蛋白质分析软件对相应融合蛋白二级结构水平的一些生物学特性进行预测。结果融合基因序列与设计一致,其相应氨基酸序列经软件分析,并与HBsAg和CD40L胞外段氨基酸序列分析结果比较,发现在二级结构上几乎无变化,亲水性和抗原性等生物学活性几乎未受影响。结论HBVS-ecdCD40L融合基因构建成功,软件分析表明融合过程未影响HBsAg和人CD40L胞外段的生物学活性,为进一步研究奠定基础。     

ScFv及重组TNF-α双功能抗体融合蛋白的表达及其软件预测

目的:利用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质,以及探讨分泌型抗成骨肉瘤单链双功能抗体基因的表达.方法:采用PCR方法将人工合成的抗体分泌信号肽序列加在抗成骨肉瘤ScFv基因5'端,其3'与人的肿瘤坏死因子TNF-α基因连接构成分泌型单链双功能抗体ScFv-TNF-α基因,将该基因克隆至逆转录病毒表达载体PLxSN,重组质粒pL(ScFv-TNF-α)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人成骨肉瘤细胞命名为OSC/ScFv-TNF-α, 以PCR, RT-PCR以及Western Blot对ScFv-TNF-α基因修饰的OSC9901细胞进行鉴定. 在构建融合蛋白之后,运用DNA分析软件(DNAssist)和蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)分析融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质.结果:经酶切分析鉴定,成功地构建了融合基因表达载体pL(ScFv-TNF-α)SN,以及Western Blot分析证明ScFv-TNF-α基因融合蛋白的表达. 运用DNAssist核酸序列分析软件分析ScFv-TNF-αDNA序列翻译并获得了氨基酸序列,运用蛋白质分析软件(ANTHEPROT V5)分析融合蛋白的二级结构及其理化性质.结论:利用生物信息学网络资源进行分析预测融合蛋白的性质,为进一步探讨单链双功能抗体基因融合蛋白提供依据.     

人幽门螺杆菌UreB与Omp11双价疫苗载体的构建与鉴定

目的:构建含人幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)郑州分离株MEL HP27 ureB-omp11融合基因的重组表达载体.方法:利用分子克隆技术,扩增Hp UreB、Omp11编码基因及融合基因ureB-omp11,将融合基因ureB-omp11与载体pET30a( )进行酶切、连接,然后转化并筛选含有目的基因的重组载体.结果:酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp ureB-omp11融合基因,由2 280 bp组成.与GenBank报道的相比,核苷酸序列同源性为99.39%,氨基酸序列同源性为99.47%.结论:成功构建了MEL Hp27融合蛋白UreB-Omp11的双价疫苗重组载体,为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了良好的基础.     

幽门螺杆菌双价亚单位分子内佐剂疫苗的构建表达与纯化

目的 克隆表达幽门螺杆菌外膜蛋白烷基过氧化氢还原酶ahpC、ureB414功能片段基因,与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位构建融合基因ahpC-ureB414-ltB(aul).方法 采用重叠延伸PCR的方法,以AhpC做为融合蛋白前端,与UreB414功能片段及黏膜佐剂ltB依次串联,在片段间引入5个氨基酸的柔性Linker GGGGS进行连接;将融合基因构建在原核表达载体pET-22b( )中,经酶切及测序鉴定后转化宿主菌E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白ahpC-UreB414.ltB(AUL).融合蛋白经AKTA-explore纯化仪纯化融合蛋白.结果 PCR扩增出1 350 bp的目的 基因片段aul,工程菌pET22b-aul/BL21经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,相对分子质量约为50×103,与预期值一致,目的 蛋白约占菌体总蛋白的28.7%,重组蛋白用Ni2 -NTA树脂提纯.纯化后的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带,图像软件分析表明纯度可达85%以上.Western blot显示重组蛋白质具有良好的免疫反应性.结论 成功构建、表达融合蛋白rAUL,纯化后的融合蛋白保持各亚单位组分及佐剂的独立免疫反应性.     

基因治疗在脊柱外科的应用

自从 1990年美国国立卫生研究院 (ＮＩＨ)首次成功地进行腺苷脱胺酶缺乏症的基因治疗以来 ,基因治疗已成为当前生物医学中进展最快的领域之一 ,其基本原理是把编码目的基因的核酸序列 (ＲＮＡ或ＤＮＡ)通过基因转移的技术插入适当的受体细胞内 ,使被转移的细胞成为特定蛋白的加工厂 ,表达其蛋白质产物 ,改变该细胞本身的代谢并影响其邻近细胞 ,发挥生物学活性 ,从而纠正或补偿因基因缺陷或异常所引起的疾患。随着对人类基因结构及其功能研究的深入 ,基因治疗的研究也日益深入和广泛 ,基因治疗的含义已经不是严格的指用一个正常基因移植取代…     

人EGF受体干扰序列-IL18融合基因构建及其表达产物结构预测

目的：构建带有EGF受体干扰序列的人IL-18融合基因并预测其表达产物的二级结构。方法：利用分子生物学技术，将人IL-18的成熟肤序列cDNA与EGF受体干扰序列cDNA融合，构建重组体EGF-IL18。应用蛋白质分析软件对融合基因翻译后在二级结构水平上的一些生物学特性加以预测。结果：测序表明融合基因序列与设计一致。其相应的氨基酸序列经软件分析，并与人IL-18的成熟肤单独的分析结果相比较，发现在二级结构水平几乎没有变化，融合过程未影响IL-18的活性。结论：该融合基因可进一步用于导向多肽EGF-IL18的基因工程。     

HBe (385-420) -ecdCD40L真核表达载体的构建及其融合蛋白生物活性预测

目的:构建HBe( 385-420) -ecdCD40L融合基因真核表达载体,探讨其所翻译的融合蛋白设计的合理性.方法:采用分子生物学技术将HBe( 385-420)基因与CD40L胞外段(ecd)基因进行融合,构建融合基因的真核表达载体;应用生物信息学初步分析融合蛋白的物理化学性质、柔性、抗原性、亲水性、表位以及二级结构等.结果:成功构建真核表达载体.通过分析,HBe (385-420)、ecdCD40L两个基因连接之后亲水性和疏水性未受影响,融合蛋白未出现新的抗原性及表位,连接链( Linker)不影响蛋白质的二级结构及融合蛋白的空间构象.结论从生物软件分析结果可知重组体设计较合理,融合蛋白保留了HBe( 385-420)和CD40L胞外段的生物学活性,为进一步研究该基因奠定了基础.     

全长cDNA文库及构建方法与应用进展

互补DNA (complementary DNA,cDNA)文库是指生物不同生长发育时期,特定组织或器官所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA与载体连接后形成的克隆的集合,cDNA文库是在基因组水平上研究某一生物特定器官、组织和发育时期基因表达的前提和基础[1].全长cDNA文库是生物体内完整的mRNA分子反转录而获得的DNA分子群集,是mRNA分子群的一个完整的拷贝.全长cDNA文库不仅提供完整的mRNA信息,而且可以通过基因序列比对得到mRNA剪接信息,此外,还可以对蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因的功能等[2].全长cDNA文库的优点明显,克隆大部分是全长的,有效提高了基因测序和生物信息学分析的进程,利于后期蛋白质表达及功能分析.