PLGA纳米可降解尿道支架的制备及力学性能

目的：探讨电纺丝法制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)(摩尔比80∶20)可降解尿道支架的可行性，并评价支架管的力学性能。方法：PLGA（80∶20）用三氯甲烷溶解并配成3%、4%、5%和6%的溶液，采用电纺丝技术制备纳米尿道支架，采用扫描电镜观察各种浓度PLGA制备的纳米尿道支架的微观结构，比较各种浓度PLGA支架的纤维直径、孔径、孔隙率及力学性能的差异。结果：浓度为3%、4%和5%的PLGA尿道支架制备成功，浓度为6%的PLGA因浓度过高制管失败。支架呈白色,长度4 cm,内径约 3.0 mm，外径约4.0 mm。电镜扫描见3种浓度的PLGA支架纤维平均直径随浓度的增高而增粗，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。3种浓度PLGA支架的平均孔径分别为（7±4）、(13±7)和(32±13)μm，各组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。3%PLGA支架的孔隙率接近79%，4%PLGA支架的孔隙率约为85%，而5%PLGA支架的孔隙率约为90%，各组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。3种浓度PLGA支架的平均断裂强度分别为（2.37±0.15）、（1.97±0.07）和（1.85±0.11）MPa，3%PLGA支架的断裂强度显著高于浓度4%及5%PLGA支架（P<0.05），而4%与5% 2种浓度PLGA支架的平均断裂强度比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：5%PLGA尿道支架在孔径、孔隙率等方面可较好满足尿道组织工程支架对空间结构的要求，虽力学性能较3%PLGA支架略差，但可完全满足支架对力学性能的要求。     

牙周膜成纤维细胞与静电纺丝纳米纤维的生物相容性研究

目的 研究不同比例的静电纺丝聚乳酸/聚己内酯(PLA/PCL)纳米纤维与牙周膜成纤维细胞(PDLF)的生物相容性,探索其作为牙周膜组织工程支架的可行性.方法 聚乳酸(PLA)和聚己内酯(PCL)分别按重量比75:25、50:50和25:75制成混合溶液,应用静电纺丝技术制成3种比例的纳米纤维支架.将PDLF接种于3种比例的支架上,经细胞培养,通过光学显微镜观察PDLF在3种支架上的形态;MTT法检测PDLF在支架上的增殖,荧光显微镜下计数细胞,检测粘附能力;活死细胞染色法比较PDLF在3种比例支架上的活力.结果 在体外培养条件下,PDLF在3种比例支架上均能生长,其中50:50支架上的PDLF增殖曲线最接近常规培养细胞的曲线,明显较其他2种支架上PDLF数量多;50:50支架对PDLF的粘附作用明显强于另外2种;50:50支架对PDLF活性的影响最小,优于其他比例的支架.结论 PDLF能在不同比例的PLA/PCL纳米纤维上生长,其中,按重量比为50:50合成的支架在与牙周膜成纤维细胞共培养时体现出较好的生物相容性,可作为牙周膜组织工程候选支架材料.     

电纺丝法PLGA 可降解输尿管支架的制备及体外降解研究

 目的探讨电纺丝法制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）可降解输尿管支架管的可行性,并评价支架管的体外降解性能。方法不同比例PLGA 合成后,采用电纺丝技术得到纳米输尿管支架管,使用扫描电镜观察支架管表征。将输尿管支架管截成长约2 cm 小段,并浸于尿液中进行体外降解试验研究,分别于各观察点取出样品,观察大体形态、残重率及分子量变化。结果支架管具有纳米结构,其物理性质及电镜下结构完全满足可降解支架管的需求。PLGA 材料的降解的残重率曲线近乎成线性,其中50：50比例的PLGA 降解最快,约至第6周材料崩解,而70：30 比例的PLGA 降解最慢,在10 周左右崩解,80：20 降解速率介于二者之间,降解时间约需8 周。材料的体外降解过程中分子量变化趋势与重量损失大体相同,降解早期分子量下降迅速,后期减慢并趋于平稳。结论电纺丝技术得到的输尿管支架管管物理特性完全满足可降解输尿管支架管的要求。PLGA（80：20）及PLGA（50：50）两种材料满足了输尿管支架管对降解时间的要求,是制备支架管较为理想的材料。     

聚乳酸乙醇酸共聚物与纳米羟基磷灰石共混制备组织工程纤维环支架的实验研究

目的探讨以聚乳酸乙醇酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)与纳米羟基磷灰石(hydroxyapa-tite,HA)为原料,利用静电纺丝的技术制备出的三维多孔支架构建组织工程纤维环的可行性。方法将PLGA与HA溶解于丙酮中,配制20%(w/v)的溶液,磁力搅拌均匀后,进行静电纺丝,制备三维多孔支架。支架通过扫描电镜和磷酸盐缓冲液降解(phosphate buffered saline,PBS)的方式,观察支架的形貌和降解性能;利用CCK-8和伊红染色的方法观察支架的生物相容性。结果支架具有良好的纤维形貌,直径均匀,扫描电镜下可见HA结晶。支架在磷酸盐缓冲液中降解速度较快,8周时支架失重可达40%,表现出良好的降解性能。细胞毒性试验和伊红染色均表明细胞在支架上的生长情况较好,支架具有良好的生物相容性。结论 PLGA与HA共混制备的纳米纤维支架具有良好的空间结构和生物相容性,因此该支架是一种良好的组织工程纤维环支架材料。     

三种形貌静电纺丝膜片的制备及其与牙周膜细胞的相容性

目的探讨三种形貌静电纺丝膜片的制备方法,并比较其对牙周膜细胞（periodontal ligament cells,PDLCs）的细胞相容性。方法通过控制纺丝溶液成分、空气湿度、流速,制成3种静电纺丝膜片,利用扫描电镜观察其形貌;将PDLCs与三种膜片共培养,DAPI染色观察PDLCs的形貌、分布;MTT法检测PDCFs的增殖;活-死细胞染色法比较PDLCs的活力。结果研究显示,制得纤维状,液滴状,圆盘状三种形貌的膜片;在共培养第7、11天,PDLCs在圆盘状膜片上的细胞增殖和活性明显优于另两种膜片（P〈0.01）。结论通过调控静电纺丝的溶液成分、空气湿度、温度及流速,可以改变纺丝膜片的微观结构和形貌,从而影响材料的细胞相容性。圆盘状膜片具有更好的细胞相容性。     

载EPO腺病毒的PLGA纳米纤维支架在体内促进骨缺损修复作用

目的: 将促红细胞生成素(EPO)腺病毒局限在应用部位,观察其在体内的促进骨形成作用。方法: 采用冷冻干燥法,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)腺病毒与聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米纤维支架复合作为实验组(PLGA/Ad-EGFP组),以等剂量的EGFP腺病毒为对照组,分别感染骨髓基质细胞(BMSCs),以BMSCs感染EGFP的荧光细胞面积比例检测病毒活力。采用Picogreen dsDNA定量检测试剂盒检测病毒释放动力学。将EPO腺病毒与PLGA纳米纤维支架冻干复合作为实验组(PLGA/Ad-EPO组),以单纯骨缺损为对照组,植入大鼠颅骨缺损处,在第4和8周采用Micro CT及组织学HE染色检测EPO腺病毒的新生骨面积百分比。结果: PLGA/Ad-EGFP组荧光细胞面积比例明显高于对照组(P<0.05);腺病毒在PLGA上呈突释曲线,第1小时存留53.0%±5.6%,第16小时存留20.0%±3.3%。与对照组比较,PLGA/Ad-EPO组在第4周促进红细胞生成,并在第4及8周大鼠颅骨缺损修复,新生骨面积百分比达到25.0%±5.7%及35.0%±6.3%(P<0.05)。结论: 应用冻干法将腺病毒与PLGA复合能够有效保存病毒活性, PLGA /Ad-EPO纳米纤维支架能够在一定程度上促进骨缺损修复。     

转染CDMP-2基因的成肌细胞与PLGA材料的相容性

目的探讨转染软骨源性形态发生蛋白2基因的成肌细胞与PLGA(聚乳酸/乙醇酸共聚物)材料的相容性。方法将转染CDMP-2基因的成肌细胞接种于PLGA支架,以成肌细胞与PLGA支架培养组为对照。采用MTT法检测成肌细胞在支架上的生长情况,并绘制生长曲线。结果与结论各组吸光度值差异无显著性意义(P>0.05)。转染CDMP-2基因的成肌细胞可以在PLGA材料上良好的生长,为后续研究成肌细胞修复软骨损伤打下了良好的基础。     

可降解组织工程血管支架材料的细胞相容性

目的对可降解材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚氨酯体外评价,初步探讨其作为血管支架材料的可行性。方法通过血红蛋白的释放对溶血进行评价;采用细胞增殖度法(MTT法)、细胞形态学观察方法研究聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚氨酯材料的细胞毒性。结果 PLGA和PU组的溶血率均小于ISO规定的5%,可认为这两种材料无溶血作用。MTT比色法结果显示细胞毒性为0～1级;细胞形态学观察显示L929细胞在聚氨酯材料浸提液中呈梭形或三角形,贴壁良好。结论这两种材料溶血低,细胞相容性良好,符合组织工程血管支架材料的应用要求。     

PLGA纳米材料在缺血性脑卒中中的应用

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)具有良好生物相容性、生物可降解性、良好的成球或成膜性以及生物体内半衰期长等优势,已经广泛应用于肿瘤的临床治疗、诊断和其他医学生物领域;同时纳米医学技术在生物医药学、再生医学、诊断工具方面的发展也很迅速。目前缺血性脑卒中的治疗和早期诊断仍是一个难题,而PLGA纳米材料在缺血性脑卒中的诊疗中的应用已取得长足的进展。PLGA纳米材料在神经保护药物的载药、组织修复、影像诊断方面的应用是研究的热点。     

磁性聚乳酸-羟基乙酸氧化酚砷纳米微粒的制备及其特性

目的:研究磁性聚乳酸-羟基乙酸氧化酚砷纳米微粒(M-PLGA-PAO-NP)的制备工艺,并对纳米粒子进行评价.方法:运用超声乳化-溶剂挥发法制备磁性聚乳酸-羟基乙酸氧化酚砷纳米微粒,通过透射电镜(TEM)观察微粒形态,振动样品磁强计(VSM)确证纳米微粒磁性的存在,并对纳米微粒的平均粒径、载药量、包封率等进行评价.结果:纳米微粒外观呈规则球形,粒径在140～500 nm占总数的80%,载药量为3.2%,包封率为34.2%,药物磁性较好.结论:获得了较满意的磁性聚乳酸-羟基乙酸氧化酚砷纳米微粒制备工艺,其过程简单,粒子性状符合要求.     

去细胞化肝脏生物支架材料的制备

目的探讨制备去细胞化肝脏生物支架(decellularize d liver biological scaffold,DLBS)的新方法,寻找适合肝脏组织工程的新型支架材料。方法 (1)采用化学去垢剂—酶联合去细胞化技术制备去细胞化全肝脏生物支架,并观察去细胞化效果;(2)DLBS与C3A及骨髓间充质干细胞体外共培养,观察DLBS细胞相容性。(3)通过四氮唑盐比色法(MTTAssay)观察DLBS对C3A的增殖作用。(4)将DLBS植入SD大鼠背部皮下,4周后处死大鼠,观察鉴定DLBS的组织相容性。结果通过HE染色、扫描电镜观察证实经过化学去垢剂—酶联合去细胞方法制备的去细胞化全肝生物支架不含细胞成分,只剩下胶原、弹性蛋白等支架成分;体外培养实验发现,L02及骨髓间充质细胞能够与DLBS粘连、生长。MTTAssay检测证实DLBS有促进C3A生长、增殖的作用。结论利用化学去垢剂—酶联合去细胞化技术制备的DLBS脱细胞彻底、细胞外基质保留较完整,并且有促进细胞粘附、增殖和分化的作用,是一种较为理想的生物支架材料。     

人工生物可降解支架聚乳酸-聚乙醇酸种植人食管上皮细胞的实验研究

目的研究人食管上皮细胞在聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)三维支架上的贴附和生长情况,利用组织工程技术培养工程化人工食管.方法制作PLGA三维细胞支架;分离培养成人食管上皮细胞,体外扩增后种植到PLGA支架上.在体外和裸鼠体内分别培养食管上皮细胞-支架复合物,分期终止培养,进行组织学染色、扫描电镜、细胞角蛋白免疫组织化学检测.结果体外培养发现,人食管上皮细胞在支架材料上贴附生长良好,长期培养仍保持食管上皮细胞特性,裸鼠体内培养4周后可形成食管黏膜样组织.结论 PLGA支架适合食管上皮细胞黏附生长,可作为食管组织工程的细胞载体.利用组织工程的方法可获得适于移植的工程化人工い食管.     

新型温敏性重组人釉原蛋白载体与传统丙二醇藻酸酯载体的体外测试效果比较

目的 评价新型温敏性重组人釉原蛋白（rhAm）载体和传统丙二醇藻酸酯（PGA）载体的体外表征和对人牙周膜成纤维细胞活性的影响。方法 分别利用3.3%PGA与rhAm混合制备PGA-rhAm,2%的壳聚糖（CS）和rhAm混合并使用质量分数60%的β-甘油磷酸钠溶液（βGP）作为交联剂制备CS-βGP-rhAm凝胶;表征通过检测黏度、凝固时间、pH值、溶胀率、体外生物降解率和缓释性能来评估;通过观察金黄色葡萄球菌生长状况比较材料的抗菌效果;生物相容性评估是在人牙周膜成纤维细胞（hPDLFs）上利用CCK8检测各组细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,RT-qPCR检测成骨基因mRNA表达,Western blot检测蛋白的表达水平,碱性磷酸酶（ALP）染色检测各组细胞成骨分化情况。结果 PGA-rhAm具有黏度值3.262±0.055 Pa.s,CS-βGP-rhAm在37 ℃下具有6 min凝固成型能力、接近口腔环境的pH值、约90%的溶胀率,同时缓释rhAm可维持2周以上,自身降解时间维持3周以上。CS-βGP负载rhAm相比PGA负载rhAm更有效抑制金黄色葡萄球菌生长（P<0.001）。细胞水平上,CS-βGP是否负载rhAm都可促进细胞增殖（P<0.001）,PGA促进细胞增殖效果不显著。划痕实验显示,CS-βGP和PGA负载rhAm后均可促进细胞迁移（P<0.01）。RT-qPCR和Western blot结果显示,CS-βGP负载rhAm能促进RUNX2、OCN mRNA水平（P<0.001）,上调Ki67（P<0.001）、RUNX2（P<0.001）、Collagen Ⅰ（P<0.01）、β-catenin（P<0.05）蛋白表达。PGA负载rhAm促进RUNX2（P<0.05）、OCN（P<0.01）mRNA水平表达,蛋白水平变化无统计学意义。CS-βGP组ALP染色蓝紫色颗粒数增加,PGA组无明显变化。结论 CS-βGP具有能缓释rhAm的性能,同时相比传统的PGA载体,CS-βGP具有温度成型的特点、抑制金黄色葡萄球菌生长的性能、显著提高hPDLFs的生物活性并且负载rhAm后不影响其生物活性。     

新型乳酸 羟基乙酸共聚物(PLGA)/胶原复合材料用于软骨再生的体外研究

 目的 设计和制备新型乳酸 羟基乙酸共聚物［poly(lactic co glycolic acid),PLGA］/胶原(collagen)复合材料,研究其在体外对软骨再生的促进作用,为软骨组织工程提供新型支架材料。方法 利用冷冻干燥技术将胶原多孔海绵复合于PLGA编织网膜;扫描电镜观察材料表面微观结构,利用图像软件统计孔径大小;分离与培养牛膝关节软骨细胞(bovine articular chondrocyte, BAC),接种于PLGA/胶原材料,检测细胞接种效率,扫描电镜观察细胞在材料内部生长情况;体外培养1周后检测DNA和糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)含量,real time PCR检测I型胶原、Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖(aggrecan) mRNA表达强度。牛膝关节软骨组织和体外单层培养的BACs做对照。结果 成功构建新型PLGA/胶原复合材料,表面孔径为(136.4±11.8) μm;细胞接种效率为87.8%±1.6%;BACs在材料表面和中心生长活跃,培养1周后的DNA、GAG含量, Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA表达强度均显著高于对照组(P<0.05)。结论 新设计制备的PLGA/胶原复合材料能促进体外软骨再生,可作为支架材料用于软骨组织工程研究。     

全反式维甲酸对人牙周膜细胞向成骨分化的影响

目的检测全反式维甲酸(AT-RA)对人牙周膜细胞(hPDLCs)向成骨分化的影响。方法原代培养hPDLCs,用噻唑盐(MTT)方法检测AT-RA作用于细胞hPDLCs及对其增殖的影响,用酶动力方法检测对其碱性磷酸酶(ALP)活性的影响,用茜素红染色方法检测对其形成钙盐沉积的影响。结果 AT-RA不影响hPDLCs的增殖活性,但能增强hPDLCs的ALP活性,并明显促进钙盐沉积。结论 AT-RA可以促进hPDLCs向成骨分化。     

克林霉素-PLGA微球的制备及其体外抑菌活性评价

目的: 制备出一种具有生物可降解性的搭载克林霉素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)缓释微球,并对其相关性质进行研究。方法: 采用乳化-溶剂挥发法制备搭载克林霉素的PLGA微球,检测克林霉素-PLGA微球表面形貌和粒径分布,观察PLGA/二氯甲烷(P/D)与PLGA/克林霉素(P/C)不同投药比对微球包封率的影响;用适量的释放介质分散缓释微球后,37℃ 震荡,取各时间点的药液,采用K-B纸片琼脂扩散法检测不同时间点的抑菌环直径大小评价微球体外缓释抑菌能力。结果: 微球的形体圆整、表面光滑、无明显黏连,且粒径大小主要集中在700 nm左右。当投药比为P/D=80/1、P/C=5/1时包封率最佳,为45.02%,包覆效果良好。微球在第 1~2天时体外抑菌效果最为明显,第3~19天呈现持续稳定的抑菌效果,在第20天时降至药物的最小抑菌浓度(MIC)。结论: 克林霉素-PLGA微球的制备工艺良好,其体外抑菌效果表现出明显的缓释性。     

Smoothened慢病毒干扰载体的构建及其对人牙周膜干细胞增殖与分化的影响

目的 体外构建及筛选人Smoothened(SMO)基因的慢病毒干扰载体,使用此载体下调人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem ceils,PDLSCs)中SMO基因表达并检测其对细胞增殖与分化的影响.方法 针对人SMO 基因设计3条干扰序列,构建RNA干扰慢病毒载体,在293FT细胞中包装病毒液并转染293A细胞,通过实时荧光定量PCR检测干扰效率,得到具有最佳干扰效率的病毒后,转染PDLSCs,用Western blot检测其对PDLSCs中SMO基因的干扰效果及对细胞分化的影响,CCK-8法检测其对PDLSCs增殖的影响.结果 成功构建3个SMO慢病毒干扰载体(pGP-SMO1、pGP-SMO2、pGP-SMO3),通过转染293A细胞并进行实时荧光定量PCR检测后,得到pGP-SMO1具有最佳干扰效率,转染后SMO mRNA水平下降到对照的(28.5±2.5)％.利用此病毒能够很好地转染体外培养的PDLSCs,并使PDLSCs中SMO蛋白水平下降80％.进一步检测细胞增殖发现,与未转染组比较,SMO下调后PDLSCs增殖变慢[(1.09±0.20) vs (1.86±0.21),P＜0.01].同时也导致成骨分化标志物Runx2的蛋白表达下调.结论 利用慢病毒介导的干扰病毒载体成功干扰了PDLSCs SMO基因的表达,SMO基因的下调会导致PDLSCs增殖减慢,成骨分化能力减弱.     

Fabrication of a novel hybrid scaffold for tissue engineered heart valve

The aim of this study was to fabricate biomatrix/polymer hybrid scaffolds using an electrospinning technique. Then tissue engineered heart valves were engineered by seeding mesenchymal stromal cells （MSCs） onto the scaffolds. The effects of the hybrid scaffolds on the proliferation of seed cells, formation of extracellular matrix and mechanical properties of tissue engineered heart valves were investigated. MSCs were obtained from rats. Porcine aortic heart valves were decellularized, coated with poly（3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate） using an electrospinning technique, and reseeded and cultured over a time period of 14 days. In control group, the decellularized valve scaffolds were reseeded and cultured over an equivalent time period. Specimens of each group were examined histologically （hematoxylin-eosin [HE] staining, immunohistostaining, and scanning electron microscopy）, biochemically （DNA and 4-hydroxyproline） and mechanically. The results showed that recellularization was comparable to the specimens of hybrid scaffolds and controls. The specimens of hybrid scaffolds and controls revealed comparable amounts of cell mass and 4-hydroxyproline （P〉0.05）. However, the specimens of hybrid scaffolds showed a significant increase in mechanical strength, compared to the controls （P〈0.05）. This study demonstrated the superiority of the hybrid scaffolds to increase the mechanical strength of tissue engineered heart valves. And compared to the decellularized valve scaffolds, the hybrid scaffolds showed similar effects on the proliferation of MSCs and formation of extracellular matrix. It was believed that the hybrid scaffolds could be used for the construction of tissue engineered heart valves.