含突变型p53和LMP1双基因重组质粒的构建与鉴定

目的构建一种双基因真核表达载体，使之表达人突变型p53蛋白(p53mt)和EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)，为研究这两个蛋白在鼻咽癌变中的交互作用奠定基础。方法通过基因重组技术，构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1-p53mt；采用脂质体LipofectAMINE^TM 2000将此载体转入体外培养的HeLa细胞中，转染后48h，采用免疫细胞化学方法分析突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的表达。结果对重组载体进行限制性内切酶酶切及PCR鉴定分析，结果与预期相符合：转染试验观察到转染细胞中突变型p53基因和LMP1基因的阳性表达。结论成功构建了表达人突变型p53蛋白和EB病毒LMP1的真核载体pLMP1-p53mt，其研究思路可以为中医体质病机研究提供借鉴。     

重组质粒pLMP1-p53mt的构建与表达

目的构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的双基因真核表达质粒,为研究突变型p53基因和EB病毒LMP1基因在鼻咽癌发生中的相互作用奠定基础.方法通过分子克隆技术,构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1-p53mt;培养HeLa细胞,采用脂质体lipofectAMINETM 2000将该质粒转入HeLa细胞中,转染后48h,利用免疫细胞化学法研究突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的表达情况.结果重组质粒限制性内切酶酶切及PCR鉴定结果与预期一致;观察到转染细胞中突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的高效表达.结论成功构建了含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的双基因真核表达质粒.     

用显微注射法制备携带Epstein-Barr病毒膜抗原基因--BLLF1的转基因小鼠

目的 :用显微注射法制备携带EB病毒 (Epstein Barrvirus,EBV)膜抗原 (membraneantigen ,MA)基因 BLLF1的转基因小鼠。方法 :对 38只昆明种小鼠进行超排卵 ,收集受精卵 ,将EBVMA基因 BLLF1显微注射到受精卵的原核内。将注射后成活且健康的受精卵移植到假孕母鼠的输卵管内使其发育直至分娩。PCR分析检测仔鼠基因组中转基因的整合。结果 :显微注射 6 77个受精卵 ,其中成活且健康的 32 0个 ,卵的成活率为 47.2 %。将其移植到 12只假孕母鼠的输卵管内 ,其中 2只鼠怀孕并产仔 12只 ,出生率为 3 .75 %。PCR分析 5只仔鼠基因组整合有BLLF1基因 ,整合率为 41.7%。结论 :携带EBVMA基因 BLLF1的转基因小鼠已制备成功     

人胰岛素转基因小鼠模型的建立

目的:建立人胰岛素的转基因小鼠模型.方法:通过原核显微注射法,把外源基因pEF1α-mINS注射入FVB种小鼠受精卵,胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠获得子代小鼠.结果:移植注射胚胎204枚给38只假孕小鼠共出生108只后代鼠,经PCR和Southern blot检测到5只阳性小鼠.结论:通过显微注射法使外源基因pEF1α-mINS在小鼠基因组中得到整合,建立了人胰岛素的转基因小鼠模型.     

转基因技术在鼻咽上皮细胞癌变中医病机研究中的应用

目的探讨利用转基因技术研究鼻咽上皮细胞癌变中医病机的可行性及相关实践问题。方法从鼻咽上皮细胞癌变的"气虚染毒"病机假说出发,通过分析其可能的相关性现代生物学基础和代表性指向基因,选取目的基因,显微注射法制备转基因小鼠,反复筛选,建立鼻咽癌前病变纯系转基因小鼠模型,并以"益气解毒"法进行干预试验,反证模型动物的可靠性。结果鼻咽癌"气虚染毒"中医病机假说的"气虚"部分与遗传背景有关,"染毒"部分与EB病毒感染活性有关,其可能的相关代表性指向基因分别为体细胞抑癌基因p53和EB病毒瘤基因LMPl。于C57BL/6J♀×CBA♂小鼠转入p53mt和EB病毒LMP1,经反复筛选,获得纯系转p53mt-LMP1基因小鼠品系,鼻咽、鼻腔黏膜等组织的目的基因表达活性很高,并出现明显的上皮细胞异型性改变,显示了癌变发展趋势。经"益气解毒"中药的干预治疗,上皮细胞的异型性改变发展趋势出现抑制或逆转。结论鼻咽上皮细胞癌变的"气虚染毒"病机假说具有特定的生物学基础。"气虚"状态由遗传因素决定,"染毒"之变由EB病毒瘤基因LMP1引起。"益气解毒"中药干预能够在很大程度上逆转由该病机诱发的鼻咽上皮细胞癌变进程。     

绿色荧光蛋白转基因小鼠模型的建立及胚胎冷冻保种

目的建立绿色荧光蛋白转基因小鼠模型，并采取胚胎冷冻的方法进行保种。方法通过原核显微注射法，把线性化、纯化后的外源基因pEGFP注射入BDF1小鼠受精卵中，胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠，获得子代小鼠。经鉴定对有表达的转基因鼠进行胚胎冷冻保种。结果移植注射胚胎385枚给30只假孕小鼠共出生了306只后代鼠，经PCR和southern blot检测得到5只阳性小鼠。F2代转基因鼠胚胎冷冻240枚胚胎。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP在小鼠基因组中得到整合，建立了转pEGFP的转基因小鼠模型。     

乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠的建立

目的：建立乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠。方法：构建乙型肝炎病毒核心基因真核表达载体pcDNA3-HBc；采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核巾，然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管；取其产10d龄子代鼠进行鉴定。结果与结论：表达载体内切酶酶切及序列分析结果与预期一致；PCR鉴定转基因阳性小鼠比例为25％(6／24)。可表达核心蛋白基因的转基因小鼠成功建立。     

角质细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的研制

本研究采用转基因技术中最常用的受精卵原核显微注射法，制备角质细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠。我们将经过超排处理的供体雌鼠拉颈处死，从其输卵管壶腹部取出卵丘细胞团，用透明质酸酶消化、清洗，得到形态饱满、极体和双原核明显的受精卵培养。将构建好的包括角质细胞特异性角质素5（K5）启动子、Cre重组酶基因和人生长激素（hGH）polyA的转基因载体pK5-Cre-hGH制备成一定浓度的注射片段，通过显微注射的方法将4．2kb的转基因片段引入小鼠受精卵的雄原核。共注射了720枚受精卵，移植至29只假孕母鼠的输卵管中发育，获得子代小鼠48只，经PCR鉴定有12只小鼠在基因组上整合有Cre基因，整合率为25％。此结果通过Southern杂交得到进一步证实。     

BIGH3R555w突变转基因小鼠模型的建立

目的建立BIGH3R555w突变转基因角膜营养不良小鼠模型。方法构建以磷酸甘油酸激酶（phosphoglyceratekinase,PGK）为启动子的BIGH3（M）-IRES-EGFP重组质粒载体,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒注射入C57小鼠受精卵中,胚胎移植入假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠。用PCR方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过RT—PCR及Western印迹法检测BIGH3基因表达。结果8只假孕小鼠共移植注射后的胚胎84枚,出生35只子代鼠,经PCR检测得到4只转基因阳性小鼠。RT—PCR和Westem印迹法检测结果显示,BIGH3R555w在转基因小鼠角膜表达量明显增多。结论通过显微注射法使外源基因B1GH3555w突变体在小鼠基因组中整合,成功建立了BIGH3突变转基因小鼠模型,该模型可为今后进一步研究角膜营养不良疾病的发病机制提供依据。     

TNNI2突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNI2突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-tnni2转基因构件，TNNI2基因的第175个氨基酸缺失，通过原核显微注射法。把线性化、纯化后的外源基因pEGFP-tnni2注射入BDF1小鼠受精卵中。胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠，获得子代小鼠。用PCR和Southern方法检测子代鼠尾DNA鉴定基因型。通过RT-PCR方法检测tnni2基因表达。结果移植注射胚胎115枚给4只假孕小鼠共出生了23只后代鼠。经PCR和Southern方法检测得到4只阳性小鼠。对其子代进行RT-PCR检测，tnni2基因在肌肉、心脏内表达。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-tnni2（TNNI2基因的第175个氨基酸缺失）在小鼠基因组中得到整合，建立了转pEGFP-tnni2的转基因小鼠模型。     

益气解毒方对癌前病变鼻咽黏膜超微病理组织的逆转效应

目的 研究TgN(p53mt-LMP1)/HT转基因小鼠癌前病变鼻咽黏膜超微结构特征并观察益气解毒方的干预效应.方法 将模型鼠随机分为3组,每组24只,模型组(MG)、益气解毒方组(YG)、维A酸组(TG);同品系C57BL/6J鼠24只作正常对照组(NG).各组均单用诱癌剂二亚硝基哌嗪73 mg/(kg·次),每周2次,连续14用.采用HE染色法和透射电镜观察各组小鼠鼻咽黏膜形态学变化.结果 MG组鼻咽黏膜异型性增生明显,TG、NG、YG鼻咽/鼻腔黏膜表现轻度增生.MG组细胞膜呈伪足样改变,线粒体变形、出现空泡样结构,YG、TG及NG上述改变不明显.结论 线粒体的改变可能与鼻咽黏膜癌前病变相关,而益气解毒方可有效逆转转基因小鼠鼻咽黏膜癌前病变.     

显微注射法制备携带EB病毒潜伏膜蛋白基因转基因小鼠

用显微注射法将Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒ病毒（ＥＢＶ）的潜伏膜蛋白（ＬＭＰ）基因分组注入１２３９只昆明种小白鼠受精卵的原核中。结果出生了２５只原代鼠（Ｆｏｕｎｄｅｒ），其中２只基因组中整合有ＬＭＰ基因，整合率为８％（２／２５）。培养基的质量、每次注射的持续时间及注入基因的浓度等均影响注射效果。此外，将溶解ＤＮＡ的缓冲液注入４ｌ３只受精卵中，结果发现注入的ＬＭＰ本身对注射后受精卵的存活率及幼仔出生率均有一定负性影响。     

脂质体介导的p53基因转染对鼻咽癌细胞作用的研究

目的 通过转染野生型p53基因,观察其对鼻咽癌细胞CNE2生长的影响.方法 将克隆有野生型p53基因的pUHD10-3-p53质粒,用脂质体(lipofectamine)介导的方法转染人鼻咽癌CNE2细胞,以RT-PCR检测p53基因的表达,通过细胞生长曲线、AO/EB染色和流式细胞术等方法对转染细胞的生物学行为进行检测.结果 人鼻咽癌CNE2细胞转染p53基因后,基因在细胞中表达增加,细胞的生长受到抑制,在荧光显微镜下观察到凋亡细胞增多,流式细胞技术显示细胞凋亡率增高.结论 采用脂质体转染野生型p53基因的方法,可抑制人鼻咽癌CNE2细胞的生长,诱导鼻咽癌细胞凋亡.     

EB病毒潜伏膜蛋白LMP2A对人鼻咽癌细胞增殖与迁移特性的影响

目的:制备重组慢病毒载体pLMP2A,并检测其在人鼻咽癌细胞CNE1的表达情况及潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)对人鼻咽癌细胞CNE1增殖?迁移?侵袭的影响?方法:利用DNA重组技术将EB病毒编码的LMP2A基因克隆到慢病毒表达载体plv-GFP中,通过酶切?测序验证,将重组慢病毒载体pLMP2A与包装质粒pdelta-8.91?pVSVG共转染人胚肾上皮细胞株293T,包装重组慢病毒LV-LMP2A,并感染人鼻咽癌细胞CNE1,经单克隆筛选后,用RT-PCR?免疫荧光和Western blot检测LMP2A在人鼻咽癌细胞CNE1的表达,CCK8法检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1增殖的影响,划痕实验?Transwell侵袭实验检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1迁移和侵袭的影响?结果:酶切及测序结果表明,成功制备了重组慢病毒载体pLMP2A;RT-PCR?Western blot?免疫荧光结果显示筛选出的细胞克隆能高表达EBV-LMP2A,CCK8结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1增殖,划痕实验结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1迁移,Transwell侵袭实验结果显示LMP2A能提高人鼻咽癌细胞CNE1侵袭能力?结论:成功制备了慢病毒载体pLMP2A,包装的慢病毒能够成功感染人鼻咽癌细胞系CNE1,使LMP2A基因得以高表达,并发现LMP2A能够促进人鼻咽癌细胞株CNE1增殖?迁移?侵袭,为进一步探讨EB病毒在鼻咽癌中的发病机制及基因治疗奠定了基础?     

MTA1转基因小鼠的构建及鉴定

目的将人的MTA1外源基因整合到C57BL/6J小鼠中,构建稳定高表达MTA1的小鼠模型。方法通过RT-PCR方法克隆人的MTA1编码序列,将MTA1插入真核表达载体pcDNA3.1构建pcDNA3.1-MTA1载体,回收片段后利用显微注射技术将目的基因片段注入到受精卵的雄原核中,使用MTA1特异性的引物经PCR鉴定出基因型阳性的转基因小鼠,再利用Western-blot及免疫组化方法检测MTA1在转基因小鼠全身级织表达情况。结果成功构建了MTA1转基因注射片段。在320枚显微注射受精卵中挑选出300枚存活卵移植到10只ICR小鼠假孕受体的输卵管中,10只ICR小鼠均怀孕,移植成功率为100%,共生出子代鼠80只,经PCR检测其中共有9只整合了MTA1基因,整合率为11.25%。经PCR鉴定MTA1整合阳性的F1代小鼠,再经Western-blot和免疫组化分析检测MTA1表达水平在脑、肺、肝、肠等组织中表达明显增高,肾、骨骼肌表达无差异。结论成功构建了脑、肝、肺、结肠高表达MTA1的转基因小鼠,为进一步MTA1研究奠定了良好的研究模型。     

EB病毒BNLF－1基因原代转基因小鼠发育及死因分析

通过基因重组，构建携带ＭＬＶ启动子及ＥＢ病毒瘤基因ＢＮＬＦ－１的融合基因，经显微注射后共产生原代转基因小鼠１２只，这些小鼠在生长发育上与同胞胎中的野生型小鼠并无显著差异，但其发育期死亡率却高得多（９／１２）．对死亡小鼠的组织病理学诊断表明：肺、脾、肝、肾等器官均有程度不同的病变，有５只小鼠可确定为假结核病，存活的３只中有１只眼部感来致盲。上述结果提示，这种小鼠可能因免疫系统异常而易受致病微生物感染。     

人多聚免疫球蛋白受体转基因鼠的建立

目的 构建携带有多聚免疫球蛋白受体(pIgR)的转基因鼠，使其能以近乎自然的状态感染EBV，观察EBV在鼻咽部病变过程中的作用。方法 采用角质上皮特异性启动子ED—L2调控的pIgR基因，用显微注射方法将其导入受精卵中，使该基因能在F0代转基因鼠鼻咽部特异性表达。结果 PCR检测F0代pIgR基因阳性率达37．5％(6／16)，Southem杂交F0代pIgR基因阳性率为12．5％(2／16)。结论 表达多聚免疫球蛋白受体的转基因动物有望成为研究EBV病毒致病机制的一种新的动物模型。