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1.
目的:用腺病毒介导的反义VEGF165(Ad-aVEGF165)转染人血管内皮细胞系(ECV304)和人皮肤恶性黑色素瘤细胞系(A375)后,观察Ad-aVEGF165对这两细胞系体外生长的影响.方法:用感染复数为100的Ad-aVEGF165分别转染上述细胞,测定其生长曲线(MTT法)、细胞周期、VEGF基因的表达.结果:转染Ad-aVEGF165基因的A375细胞上清能够抑制ECV304细胞的生长,其增殖指数下降.Ad-aVEGF165对A375细胞的生长、增殖指数无明显影响,但是它能抑制A375细胞VEGF的表达.结论:①ECV304细胞不表达VEGF,Ad-VEGF 165对ECV304细胞无直接影响,必须要经过A375细胞介导才能抑制ECV304细胞的生长;②在体外,Ad-aVEGF165不能直接抑制A375细胞的生长,但能抑制A375细胞分泌VEGF.  相似文献   

2.
目的 探讨携带多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,mdr1)反义RNA重组腺病毒载体靶向逆转甲胎蛋白阳性(AFP+)的肝癌多药耐药细胞HepG2R的疗效及作用机制.方法 将携带AFP启动子和EGFP基因的重组腺病毒载体Adeno-EGFP转染人正常肝细胞LO2(AFP-)、人宫颈癌细胞HeLa(AFP-)及HepG2(AFP+)细胞,检测EGFP基因在各细胞的转录水平,证实重组腺病毒载体的靶向性;将携带AFP启动子和mdr1基因反义核苷酸片段的重组腺病毒载体Adeno-asmdr转染HepG2R细胞和HepG2R裸鼠皮下移植瘤模型,检测Adeno-asmdr在体外和体内逆转HepG2R的活性.结果 EGFP基因在AFP阳性的HepG2细胞可得到显著的转录,而在LO2细胞和HeLa细胞,其转录和表达量极少,显示了该载体的良好转录活性以及靶向特异性;Adeno-asmdr转染HepG2R细胞后,mdr1转录水平下降;Rhodamine 123在细胞内聚集量有所下降;在裸鼠皮下移植瘤实验中,经Adeno-asmdr+ADM处理组,移植瘤体积无增大,TUNEL法检测移植瘤内凋亡细胞增加,而经PBS和ADM处理组移植瘤体积明显增大(P<0.05),ADM处理组移植瘤中出现少量的凋亡细胞,而PBS处理组移植瘤未见凋亡细胞.结论 实验构建的Adneo-asmdr重组腺病毒载体可在AFP阳性HepG2R细胞内特异靶向性表达目的 基因,有效降低mdr1基因产物P-gp170的表达,从而达到对HepG2R细胞MDR的逆转作用;结合化疗药物的作用,可以导致裸鼠皮下移植瘤细胞凋亡增加,阻止瘤体生长.  相似文献   

3.
目的 研究5-脂氧合酶(5-LOX)siRNA转染人肝癌HepG2细胞后对裸鼠移植瘤生长的作用及对细胞外信号调节激酶(ERK)1/2信号通路的影响.方法 将5-LOX siRNA转染人肝癌HepG2细胞,验证在细胞水平5-LOX表达受抑制.再用转染后的细胞建立裸鼠移植瘤模型.裸鼠分3组:转染组(接种5-LOX siRNA转染的HepG2)、转染空载体组(接种空白质粒转染的细胞)、未转染组(接种未转染的HepG2).接种21 d后处死裸鼠,测量移植瘤体积.Western blot和RT-PCR检测瘤体5-LOX、ERK1/2的蛋白和mRNA表达.结果 转染组肿瘤平均体积与转染空载体组、未转染组比较明显减小(P<0.01),检测瘤体5-LOX、ERK1/2蛋白水平及mRNA表达量明显下降(P<0.05,P<0.01).结论 抑制5-LOX表达可显著抑制肝肿瘤生长,测得ERK1/2表达下降,提示其作用机制可能通过抑制ERK信号转导途径抑制肿瘤增殖.  相似文献   

4.
目的探讨阳离子脂转染方法在骨髓基质干细胞(BMSC)基因转染中的应用.方法通过梯度试验确定相对最佳的转染条件并测定LipofectamineTM2000(LP2000)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染大鼠BMSC的瞬时转染效率;分析细胞周期对导入基因表达的影响;以流式细胞仪测定转基因BMSC的EGFP表达强度和阳性比例随时间的变化;将EGFP基因转染的大鼠BMSC注射法移植入同源大鼠心肌内,以逆转录PCR法检测心肌组织内EGFP基因的转录,荧光显微镜法检测EGFP阳性的BMSC.结果在不同转染条件下(DNA浓度、DNA:LP2000),LP2000介导EGFP基因转染大鼠BMSC的瞬时转染效率不同;通过阳离子脂法导入基因的表达效果受细胞周期制约;细胞移植后,能在大鼠心肌组织中检测到EGFP基因的转录以及表达EGFP基因的BMSC.结论阳离子脂可以作为基因修饰的细胞移植治疗的有效载体.为了提高基因转染的瞬时效率和基因的表达效率,降低毒性、满足转基因细胞移植的要求,尚需进一步的研究.  相似文献   

5.
目的通过以PLGA纳米粒作为端粒酶hTEKT反义核酸的载体,促进反义核酸对肝肿瘤细胞的抑制作用。方法用绿色荧光蛋白报道基因pEGFP—N1表达质粒DNA转染细胞;观测不同转染方法的转染率,TRAP—ELISA法检测端粒酶活性;噻唑蓝(MTT)法测定端粒酶反义核酸对肝肿瘤细胞HepG2的抑制;过氧化物酶的抗荧光素抗体法检测肿瘤细胞凋亡指数。结果裸DNA和磷酸钙的转染效率均不高,分别为18%和24%;脂质体的转染效率为42%,纳米粒的转染效率最高,达61%;以脂质体或PLGA纳米粒为载体介导端粒酶反义核酸处理的肿瘤细胞,其端粒酶活性和生长与空白对照相比明显下降(P〈0.05),两种载体之间的差异也非常显著(P〈0.05);处理72h后,纳米粒介导组的肿瘤细胞凋亡率显著高于脂质体介导组,分别为23.1%和16.4%。结论PLGA纳米粒是一种非常有前途的非病毒基因治疗载体。  相似文献   

6.
目的 评价1型重组腺相关病毒(rAAV1)作为新生血管性角膜病变基因治疗载体的可行性.方法 rAAV1-EGFP按转染倍数(MOI)5×103,5×104,5×105转染ECV304细胞,转染后在倒置荧光显微镜下观察ECV304细胞中GFP阳性表达情况和细胞生长形态特点等,流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对EVE304细胞的转染效率.MTT法检测rAAV1-EGFP对EVC304细胞增殖的影响.结果 转染后2 d,MOI=5×105组细胞中的GFP开始表达;表达强度随MOI值的增高而增强,同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强,转染后第7天达到高峰,此时流式细胞仪检测rAAV1-EGFP对ECV304细胞的转染率分别为45.90%(MOI=5×103),58.56%(MOI=5×104),68.31%(MOI=5×105).AAV1-EGFP转染ECV304细胞后.细胞生长及形态正常.MTT法显示转染后72、96 h各转染组与未转染组之间A值无显著性差异.结论 rAAV1-EGFP对ECV304细胞转染稳定、有效,重组腺相关病毒对细胞增殖无明显抑制,重组腺相关病毒可作为基因治疗角膜新生血管性病变的载体.  相似文献   

7.
目的以PEG化壳聚糖(PEG-Chitoson)纳米粒作为端粒酶逆转录酶反义寡核苷酸的载体转染HepG2细胞,研究其对HepG2细胞的增殖影响;方法采用MTT法检测PEG-CSNPs的细胞毒性和细胞增殖情况;以脂质体转染试剂作为对照,倒置荧光显微镜和流式细胞仪(FCM)检测FITC标记的ASODN转染细胞后胞内荧光强度,转染效率和ASODN各组转染细胞后细胞周期的变化。结果NPs质量浓度超过3.0μg/mL时细胞毒性较大。转染24h后,ASODN纳米粒组和ASODN脂质体组细胞内荧光明显增强,且ASODN纳米粒组的转染效率要高于ASODN脂质体组。与空白对照组相比,ASODN处理后HepG2细胞生长受到明显抑制(P<0.01),且抑制率随时间延长而增高,72h时达到最高值;细胞周期改变,细胞被阻滞于G1期,S期细胞明显减少(P<0.01);结论PEG-CSNPs介导的hTERT ASODN能有效抑制HepG2细胞增殖、改变细胞周期,对该细胞生长有明显抑制作用。  相似文献   

8.
载阿霉素葡聚糖纳米粒的制备及其对肝癌细胞的杀伤作用   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的 制备载阿霉素葡聚糖纳米粒(DOX/DEX-PEA),观察其药物缓释规律,探讨其对人肝癌细胞的杀伤作用.方法 以双乳化剂蒸发法制备DOX/DEX-PLA载药纳米粒,透射电镜观察纳米粒形态,分光光度法计算载药率,体外药物释放实验考察纳米粒对DOX的缓释作用.噻唑蓝(MTT)比色法观察对肝癌细胞的体外杀伤作用,动物实验观察其体内抑瘤效应.结果 DOX/DEX-PLA纳米微粒呈球形,粒径约83 nm,药物包封率约67.1%.体外释放实验提示,纳米制剂中约50%的药物持续缓慢释放,可持续达7 d;DOX纳米制剂及DOX裸药均抑制HepG2细胞生长,两者抑瘤率相当(51.3%比50.7%,P>0.05),而DEX-PLA纳米载体对HepG2细胞生长无抑制作用.体内抑瘤实验显示,DOX纳米制剂可抑制肝癌细胞抑制瘤的生长,抑瘤率达68.56%,优于DOX裸药(4S.17%).结论 DOX/DEX-PLA纳米粒可有效抑制肝癌细胞的生长.  相似文献   

9.
目的 制备聚乙烯亚胺载基因纳米颗粒并研究其理化性质和体外转染活性.方法 通过自由基聚合法制备出聚乙烯亚胺空载纳米粒后,用绿色荧光蛋白(PEGFP-C1)质粒做报告基因,以静电吸附的方式将PEGFP-C1质粒DNA和聚乙烯亚胺结合形成聚乙烯亚胺裁基因纳米粒,用透射电镜观察其形态特征,激光粒度分析仪测定其粒度分布、表面电位(Zeta电位),MTT试验检测聚乙烯亚胺纳米载体HepG2和L-02的细胞毒作用,用体外基因转染实验评价纳米粒的转染活性,用流式细胞仪测定转粢效率.结果 聚乙烯亚胺与聚甲基丙烯酸甲酯形成表面带正电荷的纳米粒,呈单分散球形,平均粒径为102.62 nm,Zeta电位为+46.2 mV.当PEGFP-C1质粒DNA与纳米粒的N/P为3.2:1以上时,两者方可完全结合形成复合物.PEI纳米粒可携带质粒DNA进入COS7细胞,并突破吞噬小泡释放质粒于细胞质,最终质粒聚集于细胞核内进行表达.结论 聚乙烯亚胺纳米粒可以用作基因递送的非病毒栽体系统,值得进一步研究.  相似文献   

10.
目的研究5-脂氧合酶(5-LOX)siRNA转染人肝癌HepG2细胞后对裸鼠移植瘤生长的作用及对细胞外信号调节激酶(ERK)1/2信号通路的影响。方法将5-LOX siRNA转染人肝癌HepG2细胞,验证在细胞水平5-LOX表达受抑制。再用转染后的细胞建立裸鼠移植瘤模型。裸鼠分3组:转染组(接种5-LOX siRNA转染的HepG2)、转染空载体组(接种空白质粒转染的细胞)、未转染组(接种未转染的HepG2)。接种21 d后处死裸鼠,测量移植瘤体积。Westernblot和RT-PCR检测瘤体5-LOX、ERK1/2的蛋白和mRNA表达。结果转染组肿瘤平均体积与转染空载体组、未转染组比较明显减小(P<0.01),检测瘤体5-LOX、ERK1/2蛋白水平及mRNA表达量明显下降(P<0.05,P<0.01)。结论抑制5-LOX表达可显著抑制肝肿瘤生长,测得ERK1/2表达下降,提示其作用机制可能通过抑制ERK信号转导途径抑制肿瘤增殖。  相似文献   

11.
内皮抑素基因腺病毒载体的构建及表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:构建人内皮抑素(Human Endostatin,hE)基因的腺病毒载体,并研究其对胃癌细胞株SGC-7901、MKN-45及人脐静脉内皮细胞系ECV304生物学特性的影响。方法:采用Lipofectamine2000法将含有人内皮抑素基因的质粒pCA13-hE与pBGHE3共同转染293细胞;免疫荧光法及Western Blot检测hE的表达;用不同感染复数(Muhiplicity of infection,MOI)的重组人内皮抑素基因的腺病毒感染ECV304细胞,观察细胞生长。结果:成功构建了含hE基因的腺病毒载体;经含hE基因腺病毒载体感染的人SGC-7901胃癌细胞株、MKN-45胃癌细胞株均表达hE蛋白;表达的hE蛋白具有一定的生物学活性,可以抑制人静脉内皮细胞系ECV304的生长。结论:获得了有表达功能活性的Endostatin腺病毒载体,表达产物可抑制ECV304细胞的增殖,为肿瘤的抗血管基因治疗提供了必要条件。  相似文献   

12.
目的:观察重组质粒pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES携带的双基因TRAIL和endostatin联合X射线照射后,对血管内皮细胞ECV304增殖、周期和凋亡的影响。方法:实验分为对照组、空载体pshuttle转染组、TRAIL单基因重组质粒pshuttle-Egr1-shTRAIL转染组、endostatin单基因重组质粒pshuttle-Egr1-shES转染组和TRAIL、endostatin双基因重组质粒pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES转染组。细胞转染采用脂质体介导的方法进行,对照组不转染。细胞转染后给予X射线照射(照射剂量分别为0、0.1、0.5、1.0、2.0和5.0 Gy),采用ELISA法检测转染细胞中TRAIL和endostatin蛋白的表达,并分别采用MTT及PI单染或/和Annexin Ⅴ双染流式细胞术(FCM)检测TRAIL、endostatin单/双基因治疗联合放射治疗对ECV304细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。结果:2.0 Gy X射线照射后与0 h比较,各时间点转染pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES的ECV304细胞上清中TRAIL和endostatin蛋白表达水平明显升高(P<0.01),分别于12和24 h达峰值;不同剂量X射线照射可诱导TRAIL和endostatin蛋白表达,且蛋白表达水平随照射剂量的增加而明显升高(P<0.05或P<0.01)。MTT结果显示,X射线照射后, pshuttle-Egr1-shTRAIL、pshuttle-Egr1-shES和pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES组ECV304细胞A490值均明显低于对照组和pshuttle组,并显示一定的时间-效应和剂量-效应关系,并伴有细胞凋亡率明显增加、G2+M期细胞百分数明显上升和G0/G1期细胞百分数明显下降。上述细胞效应,尤以pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES组变化最为明显,与pshuttle-Egr1-shTRAIL和pshuttle-Egr1-shES组比较差异有统计学意义(P<0.05 或 P<0.01)。结论: TRAIL和endostatin双基因联合放射治疗可抑制ECV304细胞生长,影响细胞周期进程,促进细胞凋亡,且其治疗效果优于单纯放射治疗或TRAIL/endostatin单基因-放射治疗。  相似文献   

13.
目的通过接种转染携带小鼠内皮抑素基因的腺病毒到人血管内皮细胞(ECV304),观察内皮抑素基因表达对人血管内皮细胞增殖的影响。方法分对照Ⅰ组(磷酸盐缓冲液)、对照Ⅱ组(携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒)和实验组(携带小鼠内皮抑素基因的腺病毒),用二苯基四氮唑溴盐法(MTT法)测定各孔的光吸收值,计算细胞增殖抑制率。结果各组的细胞增殖抑制率分别为7%(对照Ⅰ组)、6%(对照Ⅱ组)和78%(实验组)。结论证实腺病毒携带的内皮抑素基因可以抑制人血管内皮细胞系的增殖,为进一步研究内皮抑素基因治疗提供实验基础。  相似文献   

14.
This study examined the effects of TRAIL-endostatin-based gene-radiotherapy on cellu-lar growth, apoptosis and cell cycle progression in human vascular endothelial cells ECV304 in vitro. The expression of TRAIL and endostatin protein in ECV304 cells was detected by ELISA after the transfection of recombinant plasmid pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES and X-ray irradiation. Then MTT assay was used for determining the cellular proliferation, and flow cytometry (FCM) plus Annexin V and propidium iodide (PI) double-staining or PI single-staining were employed for the detection of apoptosis and cell cycle progression. The results showed that expression of TRAIL and endostatin protein exhibited a time- and dose-dependent change in ECV304 cells after pshut-tle-Egr1-shTRAIL-shES transfection in conjunction with irradiation. In the TRAIL-endostatin-based single- or double-gene-radiotherapy, the cell viability declined in a time- and dose-dependent manner, the percentage of cells at G2/M phase and apoptotic rate was increased, and the percentage of cells at G0/G1 phase was lowered as compared with those receiving radiotherapy alone. Moreover, TRAIL-endostatin-based double-gene-radiotherapy demonstrated better effects on growth inhibition, promotion of apoptosis and induction of cell cycle arrest in ECV304 cells than sin-gle-gene-radiotherapy.  相似文献   

15.
目的:包装5种携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组逆转录病毒,筛选肝细胞靶向性好的病毒载体。方法:在前期构建的融合表达质粒基础上,构建4种新的表达质粒,采用脂质体法将这5种质粒分别与质粒pL-EGFP共转染已稳定表达Gag-Pol蛋白的NIH3T3包装细胞系中,48h后收获病毒上清,分别感染肝源性HepG2215细胞及非肝源性293T细胞,48 h后提取细胞总RNA,荧光定量PCR比较重组病毒的靶向性。结果:酶切鉴定结果表明4种新的表达质粒构建成功,包装的病毒滴度约为105cfu/ml,以pcDNA3.1(-)-envm-preS1-S2质粒包装的病毒有较好的肝细胞靶向性。 结论:包装的肝细胞靶向性好的重组逆转录病毒载体,为包装携带HDV核酶的病毒载体以及HDV核酶抑制乙型肝炎病毒复制表达的研究奠定了基础。  相似文献   

16.
OBJECTIVE: To construct the recombinant adeno-associated viral vector containing human endostatin gene (rAAV-hEndo) and observe the biological activity of the expressed human endostatin in vitro. METHODS: rAAV-hEndo was prepared using a helper virus-free packaging system. The rAAV viral genome titer was quantified by Taqman real-time PCR, and the endostatin expressed in human umbilical vein endothelial cell line ECV304 was detected by immunofluorescence staining. The effects of endostatin on ECV340 cells were evaluated by MTT cell proliferation assay, cell cycle analysis and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling (TUNEL) technique. RESULTS: The viral titer of rAAV-hEndo prepared was 2 x 10(12) vg/ml and the vector had an infection efficiency of 98%. Immunofluorescence staining showed that the human endostatin protein was expressed mainly in the cytoplasm of ECV304 cells, and the proliferation of the cells was obviously inhibited by the supernatant of rAAV-hEndo, with a inhibition rate of 67.3% 72 h after the addition of the supernatant. ECV304 cells infected with rAAV-hEndo were obviously arrested in G(1) phase, and the G(1)-phase cell percentage of treatment group were significantly higher than that of control group [(72.5+/-4.0)% vs (52.1+/-2.1)%, P<0.01]. ECV304 cells infected with rAAV-hEndo demonstrated markedly enhanced apoptosis, with a significantly greater apoptotic index than that of the control cells [(32.6+/-3.2)% vs (4.2+/-1.9)%, P<0.01]. CONCLUSION: rAAV-hEndo can effectively mediate the expression of biologically active human endostatin, which may facilitate further study of antiangiogenic gene therapy with endostatin for cancers.  相似文献   

17.
目的:构建miR-210的过表达载体,利用双荧光蛋白报告基因分析系统验证miR-210的靶基因HBVSP2。方法:构建含有miR-210前体序列的miR-210的过表达质粒pcDNA3.1(+)/pri-miR-210;选取表达绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒 pcDNA3/EGFP,将miR-210在HBVSP2上靶位点的一段特异性序列插入该质粒中,构建EGFP报告载体pcDNA3/EGFP-HBVSP2,并与miR-210ASO或者pcDNA3.1(+)/pri-miR-210及表达红色荧光蛋白质(RFP)的pDsRed2 -N1共同转染HEK293以及HepG2 2215细胞,用荧光分光光度计定量检测转染后提取的蛋白样品的荧光值。结果:共同转染pcDNA3/pri-miR-210 和pcDNA3/ EGFP-HBVSP2质粒后,EGFP/RFP的表达量明显低于pcDNA3和pcDNA3/ EGFP-HBVSP2共转染组,差异具有统计学意义(P<0.05)。pcDNA3/pri-miR-210和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组EGFP/RFP低于pcDNA3和pcDNA3/EGFP-HBVSP2共转染组(P<0.05)。共转染miR-210ASO和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组EGFP/RFP的表达量高于共转染LacZ和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组,差异具有统计学意义(P<0.05)。LacZ和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组EGFP/RFP低于LacZ和pcDNA3/EGFP组(P<0.05)。结论:成功构建miR-210的过表达质粒pcDNA3.1(+)/pri-miR-210和含有miR-210靶位点的pcDNA3/ EGFP-HBVSP2,HBVSP2 可能是miR-210的直接靶基因。  相似文献   

18.
人纤溶酶原K5区基因真核表达载体的构建和活性鉴定   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的 构建含人纤溶酶原K5区基因的真核表达载体,转染人乳腺癌细胞株MDA—MB—231,观察阳性克隆表达的K5蛋白对人脐静脉内皮细胞株ECV304和MDA—MB—231细胞增殖的影响。方法 应用PCR将人纤溶酶原信号肽序列引入K5cDNA,所得的目的片段与真核表达载体pcDNA3重组,构建重组质粒poDNA3K5,脂质体法将其转染MDA—MB—231,G418筛选阳性克隆,PCR鉴定,RT-PCR和Western blot检测K5的表达。将鉴定正确的阳性克隆的培养上清作用于ECV304细胞,MTT、法检测其增殖情况,并用MTT法检测转染pcDNA3K5对MDA—MB—231细胞增殖的影响。结果 构建的重组质粒pcDNA3K5经酶切鉴定、测序正确,将其转染MDA-MB-231后挑取的阳性克隆有3个经PCR鉴定正确,并经RT-PCR和Western blot检测证实K5的表达。阳性克隆的培养上清作用于ECV304细胞后,其存活率降低;转染pcDNA3K5对MDA—MB—231细胞增殖无明显影响。结论 应用脂质体法将带有人纤溶酶原信号肽序列的K5cDNA转染MDA-MB-231细胞后,其分泌产生的有生物学活性的K5,呈现对ECV304细胞增殖的抑制作用,而对MDA-MB-231细胞的生长则无影响。  相似文献   

19.
目的在毕赤酵母中获得有活性的分泌型重组Endostatin.方法一步法抽提胎肝总RNA,RT-PCR扩增endostatin全基因.用T-A克隆技术构建克隆载体;双酶切回收550bp的endostatin基因,亚克隆入酵母表达载体.重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定.电转化法将线形化的重组表达DNA转导入GS¨5感受态细胞,SDS-PAGE电泳筛选阳性重组子,G25及Heprin亲和层析柱初步纯化重组蛋白.MTT法测定重组endosatatin对血管内皮细胞增殖的抑制作用.结果RT-PCR获得550bp的特异扩增条带,T-A克隆后,PCR挑选阳性重组子,测序证实序列正确;亚克隆后的表达载体,PCR可得550bp的特异条带,EcoRI、Not I双酶切获得550bp和3kb的条带,与预期一致,DNA测序证明核苷酸序列100%正确.SDSPAGE证实重组菌较空白有一明显条带,Heparin亲和层析后,1mol/INaCl洗脱的蛋白峰在体外可特异性抑制血管内皮细胞的增殖.结论在毕赤酵母菌中成功地获得了分泌表达的活性endostatin蛋白.  相似文献   

20.
目的 从ECV304细胞中克隆谷氧还蛋白1(glutaredoxin1,Grx1)的cDNA序列并构建真核表达载体pcD-NA3.1( )-Grxl.方法 利用Trizol一步法从ECV304细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术从中获得Grx1的cD-NA,将质粒pcDNA3.1( )进行双酶切、CIP处理并回收纯化,与纯化后的Grx1cDNA连接构成重组表达载体pcD-NA3.1( )-Grx1,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆鉴定并进行测序分析.结果 经RT-PCR和测序鉴定,成功地克隆了人Grx1cDNA.结论 从ECV304细胞中获得Grx1的cDNA,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1( )-Grx1,对Grx1在体外表达、进一步研究其在氧化应激中的作用及其作用机制具有重要意义.  相似文献   

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