SARS冠状病毒单克隆抗体制备及在肺尸检标本染色中的应用

目的制备抗SARS冠状病毒的单克隆抗体,用于SARS的实验室诊断。方法灭活SARS冠状病毒(PUMC01)全病毒免疫BALB／C小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(NS-1)融合,用酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光法(IFA)及免疫印迹法对所获得的细胞克隆进行筛选和鉴定,并用其中一株(M2)杂交瘤诱生的腹水单克隆抗体对SARS患者尸检肺组织切片进行免疫组织化学染色。结果共筛选出6株杂交瘤细胞,ELISA及IFA法证实其分泌的单克隆抗体与SARS冠状病毒有特异性反应,与其他常见呼吸道病原体均无交叉反应。免疫双扩散方法鉴定1株杂交瘤细胞(M2)为免疫球蛋白IgG3型,其余5株均为IgG1型。免疫印迹试验显示1株杂交瘤细胞(M2)分泌的抗体与相对分子质量68000的蛋白有特异性反应;4株杂交瘤细胞分泌的抗体与相对分子质量27000的蛋白有特异性反应,1株在免疫印迹上未见到结果。SARS患者尸检肺组织病理切片免疫组织化学染色阳性,在肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞及巨噬细胞的胞浆均可见阳性颗粒。结论我们制备的6株单克隆抗体是抗SARS冠状病毒的特异性单克隆抗体,用于SARS尸检肺组织免疫组化染色,结果阳性。     

抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定

目的在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上,制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb)。方法原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段S1c(N端249-667氨基酸残基),其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB/c小鼠,按常规方法制备单克隆抗体,并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定1株为IgG1,2株为IgG2a,经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。结论获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体,为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。     

抗SARS冠状病毒S1蛋白N端249至667的单克隆抗体的制备与鉴定

目的 在获得了具有免疫原性的SARS冠状病毒S1蛋白片段的基础上，制备和鉴定特异性抗该段S1蛋白单克隆抗体(mAb)。方法 原核表达含S蛋白受体结合区的SARS冠状病毒S1蛋白片段Slc(N端249-667氨基酸残基)，其免疫原性经SARS病人恢复期血清鉴定后免疫BALB／c小鼠，按常规方法制备单克隆抗体，并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果 筛选出3株特异性针对SARS冠状病毒S1蛋白N端249-667的mAb杂交瘤细胞株，IgG亚类鉴定1株为IgG1，2株为IgG2a，经免疫荧光鉴定与人冠状病毒株229E和OC43无交叉反应。结论 获得3株抗SARS冠状病毒S蛋白受体结合区特异性单克隆抗体。为建立新的SARS冠状病毒检测方法的和进一步研究S蛋白的功能奠定了基础。     

基因免疫制备抗SARS病毒N蛋白单克隆抗体

目的通过基因免疫方法，制备抗SAILS病毒N蛋白的单克隆抗体并对单抗进行初步鉴定。方法将含有N蛋白的编码基因的真核重组质粒pSecTagB／N免疫BALB／c小鼠，然后取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，用原核表达的SARS病毒N蛋白筛选阳性克隆。然后通过免疫印迹法进一步证明抗体对N蛋白的特异性，用ELISA方法检测抗体对灭活SARS全病毒的免疫反应。结果筛选得到10株抗N蛋白的单克隆抗体，ELISA和免疫印迹结果表明这些抗体特异性针对N蛋白上的抗原决定簇，且有7株抗体对SARS灭活病毒有阳性反应。结论所得的单克隆抗体特异针对N蛋白。     

SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体的快速、高效制备的方法研究

目的探讨制备和鉴定SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体(mAb)快速免疫方法。方法用基因重组SARS冠状病毒N蛋白和足垫免疫2周的BALB/c小鼠制备mAb,并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果筛选出4株抗SARS冠状病毒N蛋白mAb杂交瘤细胞株,ELISA间接法和免疫荧光证实这组单克隆抗体仅与SARS冠状病毒特异性反应,而与其他病原体无交叉反应,IgG亚类鉴定2株为IgG1,另2株分别IgG2a和IgG2b。2株抗体亲和常数分别为4.14×10-9 M和3.19×10-9 M。结论获得特异性针对SARS冠状病毒的单克隆抗体,为SARS的早期诊断、蛋白组学和发病机制的研究奠定了基础。     

人冠状病毒SARS-CoV、229E和OC43核衣壳(N)蛋白单克隆抗体的制备及3株人冠状病毒N蛋白的抗原相关性观察

目的 通过制备和鉴定人冠状病毒SARS．CoV、229E和OC43核衣壳（N）蛋白单克隆抗体〈mAb），观察3株人冠状病毒的N蛋白抗原相关性。方法 分别用基因重组SARS．CoV、229E和OC43N蛋白免疫BALB／c小鼠，制备mAb，并采用ELISA间接法、免疫印迹和免疫荧光进行筛选和鉴定．同时用mAb分析3株人冠状病毒N蛋白之间的免疫交叉反应。结果 获得多株抗SARS．CoV、229E和OC43N蛋白mAb杂交瘤细胞株。ELISA间接法、免疫印迹和免疫荧光结果均显示，所有的mAb仅与各自病毒的N蛋白特异性反应。而在3株人冠状病毒N蛋白抗原之间不产生免疫交叉反应。结论 获得的特异性抗人冠状病毒N蛋白mAb为进一步研究3株人冠状病毒的抗原决定簇相关性奠定了基础。     

甲型肝炎灭活疫苗的研究

目的研制甲肝灭活疫苗.方法甲型肝炎病毒TZ84株、吕8株接种人胚肺二倍体细胞2BS、KMB17株,经培养繁殖、收获、提纯、甲醛溶液灭活和氢氧化铝吸附制成灭活疫苗.结果纯化的甲肝病毒经HPLC、SDS-PAGE等方法检测表明具有良好的纯度.灭活工艺经验证盲传三代证明灭活可靠.甲肝灭活疫苗在豚鼠、小白鼠、ICR小鼠、恒河猴和普通狨猴上具有良好的安全性和免疫原性;经539例临床研究表明,该疫苗儿童组和成人组副反应均轻微,全程免疫后接种者100%抗体阳转,儿童组0,6月注射500u全程免疫后抗体水平达4535mIU/ml,成人组注射500u 0,6月全程免疫后抗体水平为1657mIU/ml,均可获得较长期的保护效果;该疫苗2～8℃保存21个月、37℃保存32天,质量稳定.结论甲肝灭活疫苗安全、有效、稳定.     

SARS相关冠状病毒M基因片段的克隆及其DNA疫苗诱导的体液免疫

目的：构建含有SARS相关冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS—CoV)M基因片段的核酸疫苗，观察其免疫小鼠后病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的M基因片段克隆到核酸疫苗真核表达载体pVAX1中，免疫小鼠后，用SARS—CoV抗体ELISA检测试剂盒定期检测免疫小鼠血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：构建了重组核酸疫苗质粒pVCo—M，免疫小鼠后可诱导产生出病毒特异性抗体。结论：以M为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体，为进一步改进或探索同类DNA疫苗提供有益启示。     

SARS病毒S2蛋白的原核表达与DNA疫苗的构建

目的 构建SARS冠状病毒(SARS-CoV)S2基因的原核和真核表达质粒,研究该真核表达重组质粒作为DNA疫苗的可行性.方法 采用RT-PCR技术从灭活的SARS冠状病毒RNA扩增得到SARS-CoV-S2基因片段,定向克隆入原核表达载体pET-28a和真核表达载体pCDNA3.1 中,构建pET-28a-SARS-CoV-S2和pCDNA3.1-SARS-CoV-S2质粒.用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导重组质粒pET-28a-SARS-CoV-S2在大肠埃希菌BL21(DE3)plysS中表达融合蛋白;并将重组pCDNA3.1-SARS-CoV-S2质粒免疫BALB/c小鼠,采用ELISA、Western blot的方法检测被免疫小鼠的抗体应答情况.结果 应用RT-PCR技术,从灭活的SARS冠状病毒扩增得到大小约为998 bp SARS-CoV-S2基因片段后,构建了含SARS-CoV-S2基因片段的原核表达质粒pET-28a-SARS-CoV-S2和真核表达质粒pCDNA3.1-SARS-CoV-S2;通过IPTG诱导,重组pET-28a-SARS-CoV-S2质粒在表达菌BL21(DE3)plysS内表达S2融合蛋白;用纯化的重组真核表达质粒经基因枪免疫BALB/c小鼠后,获得了高效价的特异性抗体.结论 成功构建了可表达SARS-CoV-S2融合蛋白的原核表达质粒pET-28a-SARS-CoV-S2.重组pCDNA3.1-SARS-CoV-S2质粒可作为DNA疫苗使被免疫小鼠产生明显的免疫应答.为建立SARS特异性血清学诊断方法和研制SARS DNA疫苗奠定了一定的基础.     

全人源抗狂犬病病毒糖蛋白抗体的制备及鉴定

目的:利用重组狂犬病病毒糖蛋白(RVG)免疫人源IgM转基因小鼠,制备全人源抗重组RVG蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行初步鉴定?方法:以重组RVG蛋白作为抗原免疫人源IgM转基因小鼠,采用杂交瘤技术制备筛选全人源抗重组RVG蛋白杂交瘤细胞株,双抗体夹心ELISA实验鉴定单抗的人源性及抗体类型,并对其特异性及与灭活狂犬病病毒CVS-11株的结合能力进行鉴定?结果:建立了5株稳定分泌抗重组RVG的全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为5D1?6H11?9A3?15D6?19E6,均为人源IgM免疫球蛋白,5株单抗均能特异性识别重组RVG蛋白,其中3株能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合?结论:筛选制备了特异性全人源抗重组RVG蛋白的单克隆抗体,能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合,为进一步研制用于狂犬病防治的抗体药物奠定了基础?     

Humoral immune responses in rabbits induced by an experimental inactivated severe acute respiratory syndrome coronavirus vaccine prepared from F69 strain

Background The etiologic agent of severe acute respiratory syndrome (SARS) has been confirmed to be a novel coronavirus (CoV), namely SARS-CoV. Developing safe and effective SARS-CoV vaccines is essential for us to prevent the possible reemergence of its epidemic. Previous experiences indicate that inactivated vaccine is conventional and more hopeful to be successfully developed.Immunogenicity evaluation of an experimental inactivated SARS-CoV vaccine in rabbits was conducted and reported in this paper.Methods The large-scale cultured SARS-CoV F69 strain was inactivated with 0.4% formaldehyde and purified, then used as the immunogen combined with Freund‘s adjuvant. Eight adult New Zealand rabbits were immunized four times with this experimental inactivated vaccine. Twelve sets of rabbit serum were sampled from the third day to the seventy-fourth day after the first vaccination. The titers of specific anti-SARS-CoV IgG antibody were determined by indirect enzyme-linked immunosorbent assay, and the neutralizing antibody titers were detected with micro-cytopathic effect neutralization test.Results Rapid and potent humoral immune responses were induced by the inactivated SARS-CoV vaccine in all the eight test rabbits. Titers of both specific IgG antibody and neutralizing antibody peaked at about six weeks after first vaccination, with the maximum value of 1 : 81 920 and 1 : 20 480,respectively. After that, serum antibody levels remained at a plateau or had a slight decrease,though two boosters were given in the succedent 4 to 5 weeks. Cross neutralization response existed between SARS-CoV F69 strain and Z2-Y3 strain.Conclusions The inactivated SARS-CoVvaccine made from F69 strain owns strong immunogenicity, and the cross neutralization response between the two different SARS-CoV strains gives a hint of the similar neutralizing epitopes, which provide stable bases for the development of inactivated SARS-CoV vaccines.     

SARS相关冠状病毒S2基因的克隆及其DNA疫苗的免疫效果

目的：构建抗原基因为SARS相关冠状病毒(severe acute resplratory syndrome coronavtrus，SARS—CoV)S2基因的DNA疫苗，将其接种小鼠后观察病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的S2基因片段克隆至真核表达载体，随之将质粒进行小鼠肌内接种免疫，定期检测血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：疫苗接种后第2周就能检测出病毒特异性抗体，随着时间的延续，抗体水平逐步升高，而空质粒对照组未检测出明显的特异性抗体。结论：以S2为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体。     

SARS冠状病毒刺突蛋白编码基因及氨基酸序列的同源性分析

①目的 分析严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒刺突蛋白(S蛋白)编码基因及氨基酸序列的变异情况，并在GenBank中寻找其同源序列。②方法 将网上公布的具有全基因序列的12株SARS冠状病毒S蛋白的编码基因序列及氨基酸序列应用Clustal W方法对排分析变异情况，并应用GenBank的Blast对排功能寻找被GenBank收录的同源序列。③结果 SARS冠状病毒S蛋白相对比较保守，变异率较低，其氨基酸序列与鼠的肝炎病毒氨基酸序列有较高的同源性，某些核苷酸序列与人的基因组有同源性。④结论 S蛋白编码基因及氨基酸序列相对保守，为预防性疫苗的研发提供了可行性；据其同源基因及蛋白序列可以预测S蛋白的二、三级结构，对推测SARS可能的发病机制有积极作用。     

精制甲型肝炎灭活疫苗的狨猴保护实验

目的　检测精制甲型肝炎 (甲肝 )灭活疫苗的保护效果。方法　甲型肝炎病毒 (YN5株 )经Vero细胞培养制成精制甲肝灭活疫苗 ,采用普通狨猴进行疫苗的免疫原性和保护性研究。结果　 7只狨猴均有特异性抗体产生 ,无血清酶活性升高和肝组织学病理改变 ,接种疫苗的狨猴能抵抗甲肝病毒强毒 (Han ZD)株的攻击。但是 ,对照组狨猴均出现血清酶异常升高和肝组织学病理改变。结论　甲肝灭活疫苗 (YN5株 )具有良好的免疫原性和保护效果。     

应用RT-PCR技术检测啮齿类动物冠状病毒

为了检测啮齿类动物冠状病毒，设计了特异性引物，建立RT—PCR检测方法，并用于检测。在基因文库中查找了啮齿类动物冠状病毒和SARS病毒的基因序列，从N基因片段中，利用计算机软件设计了一对特异性引物，通过确定反应混合物的浓度和反应条件，并建立了一整套从病毒。RNA抽提、反转录到PCR反应的快速检测啮齿类动物冠状病毒的方法，扩增出了148bp的目的片段。并已用于啮齿类动物中检测各组织和拭子中的冠状病毒。该方法对啮齿类动物冠状病毒的早期诊断和与SARS病毒区别有重要意义。     

Evaluation of a real-time polymerase-chain reaction for severe acute respiratory syndrome (SARS) associated coronavirus in patients with hospitalised exacerbation of COPD

One year after the first outbreak infections with SARS associated coronavirus were again reported and the clinical picture varied. Because health care facilities will have to initiate immediate preventive action in cases of probable SARS we tested the potential of PCR to exclude SARS associated coronavirus in patients hospitalized with respiratory symptoms. Based on primers published recently a real time Taqman PCR was established and evaluated. Lower respiratory tract specimens of patients with acute exacerbation of COPD were investigated. 141 patients with mild to moderate COPD were included. The assay was specific, sensitive, precise and reproducible and allowed absolute quantification without cross-reactivity to other respiratory viruses. None of the samples were positive for SARS associated coronavirus. Our RT-PCR for SARS associated coronavirus is a valid and practicable method to further exclude SARS in X-ray negative patients with respiratory symptoms, even in the presence of other respiratory RNA viruses.     

非人灵长类结核病的诊断方法及进展

目前非人灵长类结核病的诊断方法单一,给饲养和管理带来影响。通过总结和讨论人的结核病诊断技术,结合非人灵长类的实际情况,指出在结核病检疫中,虽然结核菌素是经典的早期诊断的方法,但血清抗体的检测是结核菌素试验的有效辅助手段,尤其对无反应猴群的结核病检测具有独特的优势。然而,IFNγ的检测有望替代结核菌素试验,实现体外检测结核病。传统的结核菌培养技术时间长,假阴性多,污染率高,给猴的结核病的确诊带来困难。原位PCR技术,能加快诊断速度,提高检出率,特别有利于对小病灶区的病源诊断。虽然目前该技术还不能替代细菌学诊断技术,但两种方法的有效结合将有利于提高非人灵长类的结核病的病源诊断。     

SARS冠状病毒多聚酶基因临床检测方法的建立

目的分析SARS冠状病毒广东株多聚酶基因片段的异质性,建立RT-PCR检测SARS冠状病毒的方法,为SARS的快速诊断提供依据。方法合成针对SARS冠状病毒多聚酶基因区段的特异性引物,从广东省SARS病人及疑似病人标本中提取RNA,经反转录和巢氏PCR扩增出相应大小的DNA片段。对这些片段克隆后进行DNA序列分析,并将序列与SARS冠状病毒和其他已知冠状病毒进行同源性分析。结果从多例SARS病人痰、咽拭子或血液标本中得到RT-PCR阳性片段,随机选取其中8例经克隆和DNA序列分析证实均为SARS冠状病毒序列(同源性100%),而所有阴性参照标本RT-PCR均为阴性。克隆片段BNI109与已知冠状病毒在核苷酸和氨基酸水平进行分析显示,该片段与牛冠病毒(bovinecoronavirus,BCV)和鼠肝炎病毒(murinehepatitisvirus,MHV)同源性最高,在氨基酸水平上同源性高达75%。结论SARS冠状病毒多聚酶基因片段BNI109的保守性极强,适合建立RT-PCR法检测SARS冠状病毒。     

SARS冠状病毒多聚酶基因临床检测方法的建立

目的 分析SARS冠状病毒广东株多聚酶基因片段的异质性。建立RT-PCR检测SARS冠状病毒的方法，为SARS的快速诊断提供依据。方法 合成针对SARS冠状病毒多聚酶基因区段的特异性引物，从广东省SARS病人及疑似病人标本中提取RNA，经反转录和巢氏PCR扩增出相应大小的DNA片段。对这些片段克隆后进行DNA序列分析，并将序列与SARS冠状病毒和其他已知冠状病毒进行同源性分析。结果 从多例SARS病人痰、咽拭子或血液标本中得到RT-PCR阳性片段，随机选取其中8例经克隆和DNA序列分析证实均为SARS冠状病毒序列(同源性100％)，而所有阴性参照标本RT-PCR均为阴性。克隆片段BNll09与已知冠状病毒在核苷酸和氨基酸水平进行分析显示，该片段与牛冠病毒(bovinecoronavirus，BCV)和鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus，MHV)同源性最高，在氨基酸水平上同源性高达75％。结论 SARS冠状病毒多聚酶基因片段BNll09的保守性极强，适合建立RT-PCR法检测SARS冠状病毒。