小鼠Tim-３真核表达载体pTARGET-Tim-3的构建

目的 构建小鼠Tim-3真核表达载体,并在黑色素瘤细胞系B16中表达小鼠TIM-3。方法 以脾细胞RNA为模板,逆转录PCR扩增鼠Tim-3编码区基因,T-A克隆至真核表达载体pTARGET,构建重组质粒pTARGET-Tim-3,采用脂质体转染法转染黑色素瘤细胞系B16细胞,以逆转录PCR和Western blot验证Tim-3在B16细胞中的表达。结果 利用酶切和测序的方法,筛选、鉴定pTARGET-Tim-3真核表达载体,转染黑色素瘤细胞系B16细胞,经逆转录PCR和Western blot证实TIM-3高效表达。结论 成功构建小鼠Tim-3真核表达载体, Tim-3在转染的小鼠B16细胞系中高表达。     

CRISPR/Cas9联合Cre-Loxp系统建立VASN条件敲除的小鼠肝细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统的条件性敲除策略构建VASN基因敲除的AML12小鼠肝细胞株。方法：在VASN基因第二外显子上下游设计靶点并合成gRNA序列,构建2个CRISPR/Cas9重组载体;设计构建VASN上下游分别带有Loxp序列和旁侧同源序列的供体载体donor DNA质粒;将3个质粒共转染至小鼠肝细胞AML12中,分离单克隆,提取基因组DNA,经PCR及测序鉴定获得稳定敲入Loxp序列的单克隆细胞株AML12-Loxp;将pALB-Cre质粒转染至AML12-Loxp,筛选建立敲除VASN基因的细胞系。结果：成功构建2个靶向敲除VASN基因的pX459-gRNA-VASN-1和pX459-gRNAVASN-2重组载体及一个供体载体;转染药筛后获得12个单细胞克隆,经测序,5个单克隆细胞实现VASN基因上下游精确敲入Loxp序列;同源重组敲入效率为41.6%;p ALB-Cre质粒转染后获得20个单细胞克隆,经PCR和测序获得12个VASN基因敲除的单克隆细胞,敲除效率为60%。结论：利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统成功构建...     

人G250真核表达载体的构建及稳定转染B16细胞系的建立

目的构建人G250真核表达载体,建立稳定表达人G250的小鼠黑色素瘤细胞系。方法采用PCR方法扩增出人G250基因的cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo-sig中,并加入酶切位点和FLAG标签,得到重组表达质粒pIRES-neo-sig-FLAG-G250。利用阳离子脂质体介导法将其稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出阳性克隆。RT-PCR及免疫荧光检测人G250在B16细胞中的表达。结果经限制性内切酶鉴定及序列分析,pIRES-neo-sig-FLAG-G250重组质粒构建正确,最终建立的表达人G250基因的B16细胞系阳性率接近100%。结论成功构建了真核表达载体pIRES-neo-sig-FLAG-G250,建立的稳定转染人G250小鼠黑色素瘤细胞系能够高效表达G250基因。该稳定转染细胞系的建立为G250在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。     

基于“睡美人”转座系统构建可视化黑色素细胞瘤及肿瘤模型

目的 利用“睡美人”（SB）转座系统构建可表达红色荧光蛋白和荧光素酶基因的黑色素瘤B16F10细胞系,建立可视化黑色素瘤动物模型。方法 从含荧光素酶Luc2的质粒中获取Luc2基因,用NcoⅠ和XbaⅠ限制性内切酶双酶切后插入pSBbi-RP SB转座子系统。构建的重组pSBbi-Luc2-RP转座质粒与转座酶按照一定比例转染黑色素瘤细胞B16F10,利用荧光显微镜观察转染效率,经嘌呤霉素筛选稳定转染的细胞系。利用活体成像系统可视化实时监测评价小鼠皮下成瘤模型。结果 利用SB转座系统成功构建黑色素瘤B16F10细胞系,24、48 h转染率分别达40%、70%,上述细胞系经皮下成瘤后1周活体动物成像系统可检测到肿瘤形成。结论 利用SB转座系统可快速建立可视化黑色素瘤细胞系,利用小动物活体成像系统可动态观察黑色素瘤动物模型中肿瘤生长情况。     

一种快速获得Vav1基因敲除稳定细胞系的方法

目的建立一种快速获得Vav1基因敲除稳定细胞系的方法。方法构建针对小鼠Vav1基因的特异性打靶载体,利用脂质体转染法转染B16小鼠黑色素瘤细胞,使用流式细胞仪对GFP阳性单细胞进行分选,对得到的GFP阳性单克隆细胞使用直接裂解法获取基因组DNA,将其用于荧光PCR,产物通过毛细管电泳和分析后即可快速获知其基因型。结果使用以上方法在短时间内得到了大量GFP阳性单克隆细胞,从中随机挑选16个,通过荧光PCR检测其基因型,结果表明敲除效率为87.5%;通过测序对部分荧光PCR结果进行验证,发现其基因型结果完全正确。结论将CRISPR/Cas9基因编辑系统、流式细胞仪单克隆分选、荧光PCR和大批量DNA样本处理技术结合,可以短时间内在B16小鼠黑色素瘤细胞中获得大量Vav1基因敲除稳定单克隆细胞。     

应用CRISPR/Cas9技术制备Vasohibin-2基因敲除小鼠模型及验证

目的:利用Cas9/RNA system gene targeting技术高效构建Vash2基因敲除小鼠模型?方法:根据Vash2基因序列,设计2对Vsah2基因的单链向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)引物序列并克隆进入pU57-T7-GDNA载体?利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9 mRNA?将体外转录的gRNA/Cas9 mRNA显微注射入小鼠受精卵,通过PCR和基因测序对Vash2移码突变进行检测和鉴定?繁育Vash2基因敲除小鼠并分析后代突变情况?结果:顺利构建表达sgRNA载体并体外转录,成功将有活性的sgRNA和Cas9 mRNA直接注射入受精卵?基因测序鉴定获得5只F0代初建鼠?选取5号鼠与野生型鼠回交,得到F1代鼠,再相互交配得到F2代鼠?PCR显示F2代鼠Vash2基因移码突变,成功建立Vash2基因敲除小鼠模型并传代繁育? 结论:通过Cas9/RNA systemgene targeting技术可以成功制备Vash2基因敲除鼠模型,是用于Vash2研究的有效工具?     

正义、反义Id1真核表达载体的构建及其对胃癌细胞的转染

目的构建正义、反义Id1真核表达载体,并转染胃癌SGC7901细胞株,筛选稳定表达的细胞株。方法设计Id1基因两端的引物,RT-PCR扩增Id1全长序列。将目的基因插入pcDNA3.1＋/Hygro构建正义Id1真核表达载体,插入pcDNA3.1-/Hygro构建反义Id1真核表达载体。脂质体转染法转染胃癌SGC7901细胞系,潮霉素筛选稳定表达的细胞株。结果RT-PCR法获得长约530 bp的Id1全长序列,经酶切及测序鉴定正确后转染胃癌SGC7901细胞株。经过潮霉素筛选8周,获得抗性的细胞株。经Western-blot鉴定,转染正义Id1真核表达载体的细胞株Id1蛋白表达水平高于对照组,而转染反义Id1真核表达载体的细胞株Id1蛋白表达水平低于对照组。结论成功构建正义、反义Id1真核表达载体并转染胃癌SGC7901细胞株,为进一步研究打下基础。     

利用CRISPR/Cas9技术构建Bpi基因敲除小鼠

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术高效构建Bpi基因敲除的小鼠模型,并继续繁殖、鉴定及建立稳定遗传的Bpi基因敲除小鼠品系。方法针对C57BL/6小鼠Bpi基因的第2～3外显子两端设计敲除靶点,筛选高活性gRNA(guide RNA)靶点,体外转录得到sgRNA(small guide RNA)并与Cas9 mRNA一起显微注射到C57BL/6小鼠的受精卵内,经胚胎移植至代孕母鼠体内,获得F0代小鼠后,通过基因型鉴定和DNA测序获得基因突变的阳性子代鼠。结果筛选到高活性gRNA靶点并成功获得体外转录产物sgRNA;与Cas9 mRNA一起通过显微注射的方式获得了64枚状态良好的受精卵并成功移植到2只代孕母鼠体内;获得了22只F0代小鼠,经PCR鉴定和DNA测序后选择一只单链缺失708 bp碱基的阳性小鼠进行扩繁,并在F1、F2代检测到该突变,且F2代成功繁育出纯合子小鼠。结论成功构建Bpi基因敲除小鼠模型,为进一步研究Bpi基因及其表达产物的生物学功能奠定了基础。     

对小鼠黑色素瘤细胞肺转移的抑制作用mGM-CSF基因转染

目的探讨小鼠粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(mGM-CSF)基因转导对B16黑色素瘤细胞肺转移的抑制效果.方法应用脂质体将含有mGM-CSF基因的真核表达载体转染B16小鼠黑色素瘤细胞,经G418加压筛选后,挑选表达mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞.观察转导或未转导mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞在Balb/c小鼠体内的肺转移.结果转导mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞可以稳定表达mGM-CSF,在小鼠模型上其肺转移灶数目显著少于未转染基因的黑色素瘤细胞对照组,二者差异显著(n=5,125.8±34.3vs27.8±24.0,P<0.01).结论mGM-CSF转导可显著抑制小鼠黑色素瘤细胞B16的肺转移,提示GM-CSF具有治疗黑色素瘤的临床应用前景.     

利用CRISPR/Cas9技术构建Aff4基因敲除B16-F10细胞系及AFF4的多克隆抗体制备

目的：利用CRISPR/Cas9技术构建ALF转录伸长因子4(AFF4)基因敲除的小鼠黑色素瘤细胞（B16-F10），自主制备特异的AFF4多克隆抗体。方法：设计一对分别靶向小鼠Aff4基因第3个外显子和第4个内含子的向导RNA(sgRNA)。将构建成功的重组质粒转染至B16-F10细胞中，并利用抗性筛选出单克隆细胞，进行基因型鉴定和AFF4表达水平检测。验证自主制备的AFF4多克隆抗体的特异性。结果：通过基因组DNA鉴定获得两株正确的单克隆细胞系，其Aff4基因m RNA水平（t=53.08,P<0.001）和AFF4蛋白表达水平（t=15.17,P<0.001）显著降低。免疫共沉淀实验和蛋白免疫印迹实验证明自主制备的抗人/鼠AFF4多克隆抗体特异性良好（t=264.7,P<0.000 1）。结论：成功构建了Aff4基因敲除的B16-F10稳定细胞系，并且成功制备抗AFF4蛋白的多克隆抗体。     

基于CRISPR/Cas9技术构建严重联合免疫缺陷小鼠

目的 应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。方法 根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列,分别针对其外显子设计25 bp左右的sgRNA并进行合成, sgRNA退火后克隆入pX330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞,受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠,首建鼠（F0）与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞技术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。结果 成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录,mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后,获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型,分别是10 bp和11 bp的缺失突变;而Rag2只有一个基因型,为8 bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后,肿瘤生长良好,且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。结论 利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变,并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常。     

利用CRISPR/Cas9系统建立叉头框G1基因敲除的人胚胎干细胞系

目的 采用成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9（CRISPR/Cas9）基因编辑技术构建叉头框G1（FOXG1）基因敲除的人胚胎干细胞系,研究FOXG1基因在人胚胎干细胞早期神经诱导过程中的作用。方法 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过转染2个向导RNA（gRNA）诱导人胚胎干细胞FOXG1基因的大片段敲除,经单克隆筛选、测序分析和蛋白质印迹分析验证获得FOXG1基因敲除的人胚胎干细胞;通过细胞免疫荧光染色、qRT-PCR检测FOXG1基因敲除前后细胞在早期神经诱导过程中关键标志物配对框基因6（PAX6）、性别决定区Y框蛋白2（SOX2）和正小齿同源物2（OTX2）的表达。结果 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得FOXG1基因大片段缺失的人胚胎干细胞,细胞免疫荧光染色、qRT-PCR结果均显示人胚胎干细胞早期神经诱导过程中的关键标志物PAX6、SOX2和OTX2的表达并未受FOXG1缺失的影响。结论 通过2个gRNA共转染可以快捷地诱导人胚胎干细胞FOXG1基因的大片段敲除。FOXG1基因缺失并不影响人胚胎干细胞的早期神经诱导。     

利用CRISPR-Cas9系统建立Prmt1敲除的小鼠胚胎干细胞系

目的利用CRISPR-Cas9系统构建Prmt1敲除的E14小鼠胚胎干细胞系,并分析验证其敲除效果。方法利用第3代基因编辑技术CRISPR-Cas9系统,针对Prmt1第4、5、6、7外显子设计4条gRNAs,gRNA两两组合转染E14细胞,特异性的敲除E14细胞中的Prmt1,并在蛋白质水平,mRNA水平和基因组水平分别验证敲除效果。结果与对照组相比,两组敲除实验组都检测不到Prmt1蛋白质和mRNA的表达,基因组测序结果分析显示,两实验组中Prmt1的mRNA均出现无义突变,使其mRNA的翻译异常终止。同时,实时定量PCR结果显示,精氨酸甲基转移酶家族其他成员Prmt2,Carm1和Prmt6 mRNA表达不受影响。结论成功获得特异性敲除Prmt1的E14细胞系,为研究Prmt1在胚胎干细胞中的作用提供了重要工具。     

Mac-1基因缺失对黑色素瘤生长的影响

目的探讨Mac-1缺失对黑色素瘤肿瘤生长的影响。方法 Mac-1基因敲除(Mac-1-/-)小鼠扩群获得实验所需数量小鼠。设立对照组C57BL/6J小鼠和实验组Mac-1-/-小鼠,分别皮下注射B16-F10细胞,统计小鼠生存率、测量肿瘤体积和重量,通过免疫组化染色检测肿瘤细胞增殖及巨噬细胞浸润情况。结果 Mac-1缺失后的黑色素瘤小鼠存活率较对照组C57BL/6J小鼠有显著性差异(P﹤0.001),肿瘤体积和重量较对照组C57BL/6J小鼠有显著性差异(P﹤0.001),肿瘤组织中增殖细胞数目与对照组相比较有显著性差异(P﹤0.01),并且肿瘤组织中巨噬细胞浸润显著减少。结论 Mac-1基因缺失显著抑制黑色素瘤肿瘤生长。     

基于CRISPR/Cas9系统定点编辑小鼠MAD2L1基因及其脱靶效应分析

目的 建立利用CRISPR/Cas9系统对小鼠MAD2L1基因第二外显子基因编辑的方法体系，并分析CRISPR/Cas9对MAD2L1基因编辑的脱靶效应。方法 通过CHOPCHOP网站设计位于小鼠MAD2L1基因第二外显子的靶点序列，并构建Cas9-MAD2L1载体，将该载体转染到NIH/3T3细胞中，通过嘌呤霉素筛选并结合荧光显微镜观察GFP后，提取细胞转染后的基因组DNA，利用PCR方法，结合T7E1分析和桑格尔测序，鉴定对小鼠MAD2L1基因编辑情况，并对转染后的NIH/3T3细胞进行CRISPR/Cas9脱靶效应分析。结果 将Cas9-MAD2L1载体转染到NIH/3T3细胞并进行嘌呤霉素筛选后，荧光显微镜下观察到大量表达GFP的细胞，PCR结合T7E1结果显示，以转染后的细胞DNA为模板扩增出的228 bp MAD2L1 PCR产物，可被酶切成166 bp和62 bp片段，测序结果显示，成功对MAD2L1基因第二外显子靶点处进行基因编辑，脱靶效应分析未检测到CRISPR/Cas9有对脱靶位点进行基因编辑。结论 成功建立对小鼠MAD2L1基因第二外显子进行基因编辑的方法体系，设计的对MAD2L1基因编辑靶点未检测到脱靶效应的发生。     

融合蛋白G3G6和HST1致敏DC疫苗抗黑色素瘤的药效学研究

探究促性腺激素释放激素(GnRH)与胃泌素释放肽(GRP)偶联的融合蛋白(G3G6)和热休克蛋白65(HSP65)与六跨膜前列腺上皮抗原(STEAP1)偶联的融合蛋白(HST1)致敏树突状细胞(DC)的效果和致敏后DC对B16F10黑色素瘤的抑制杀伤作用。利用实验室现存工程菌表达融合蛋白G3G6和HST1,按未致敏DC(US-DC)组,G3G6融合蛋白致敏DC(G3G6-DC)组,HST1融合蛋白致敏DC(HST1-DC)组和G3G6及HST1联合致敏DC(GH-DC)组致敏小鼠骨髓来源的DC分化成熟,获得融合蛋白致敏的相应DC疫苗。将B16F10黑色素瘤细胞以1×10⁶个/只移植于C57BL/6J雄性小鼠构建黑色素瘤模型,DC疫苗免疫治疗,体内外实验探究DC疫苗的抗肿瘤药效。流式细胞术分析证明,融合蛋白有效刺激DC分化成熟;动物实验显示,与US-DC组相比,G3G6-DC黑色素瘤抑制率为35.75%,HST1-DC组为34.03%,GH-DC组为55.74%。研究结果初步证明,G3G6-DC和HST1-DC均可有效抑制黑色素瘤B16F10细胞小鼠移植瘤的生长(P<0.05),且联合用药优于单独用药(P<0.01)。     

蛋白4.1家族在小鼠黑色素瘤细胞中的表达及其对细胞增殖的影响

目的筛选小鼠黑色素瘤细胞中蛋白4.1家族的表达,探讨蛋白4.1对小鼠黑色素瘤细胞增殖的影响。方法以MEF、B16、 B16-F10细胞基因组RNA和总蛋白为模板,经PCR法和Western blot筛选蛋白4.1在小鼠黑色素瘤细胞中的表达;通过分子克 隆构建真核表达载体pEGFP-N1-EPB41L3 并转染黑色素瘤细胞;检测表达蛋白4.1B后B16、B16-F10 细胞增殖的变化。结果 蛋白4.1B在黑色素瘤细胞中表达缺失;通过转染成功构建的真核表达载体pEGFP-N1-EPB41L3发现,表达蛋白4.1B的黑色素 瘤细胞的增殖作用被显著性抑制。结论通过真核表达载体pEGFP-N1-EPB41L3 转染表达蛋白4.1B 可显著抑制B16 和 B16-F10黑色素瘤细胞的增殖。     

一种gRNA快速合成及检测方法的建立

目的 建立一种gRNA快速合成及检测的方法。方法 设计引物并利用PCR技术迅速扩增gRNA 的DNA模板片段，然后通过体外转录纯化得到gRNA；最后通过体外反应迅速对gRNA和Cas9酶切效率及特异性进行检测。结果 体外合成的gRNA特异性强，活性高，在靶点上成功切开DNA双链。结论 成功建立gRNA快速合成及检测的方法，为后续转染或显微注射筛选有活性gRNA节约了时间。