负载肿瘤抗原的树突状细胞疫苗诱导CTL的抗肿瘤效应

目的:探讨负载肿瘤抗原的树突状细胞(DC)疫苗诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的体外杀瘤作用及对荷瘤小鼠的治疗作用.方法:体外培养的小鼠骨髓树突状细胞用小鼠结肠腺癌细胞株CT26细胞抗原冲击致敏制备负载肿瘤抗原的DC疫苗;负载肿瘤抗原的DC疫苗激活同源T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL),采用乳酸脱氢酶(LDH) 4 h释放法检测CTL在体外对CT26细胞的杀伤活性;建立CT26荷瘤小鼠模型,应用CTL治疗荷瘤小鼠,观察肿瘤大小和小鼠存活期.结果:负载CT26肿瘤抗原的DC疫苗能够诱导T细胞增殖分化为肿瘤特异CTL,该CTL对CT26细胞有高效而强烈的杀伤作用,杀伤率为(83.95±11.25)%,而对B16细胞、3LL Lewis 细胞无明显杀伤作用,杀伤率分别为(12.75±5.36)%和(11.38±4.57)%.应用CTL治疗荷瘤小鼠能显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,延长荷瘤小鼠存活期.结论:负载肿瘤抗原的DC疫苗能够诱导高效而特异的CTL杀瘤活性并能治疗荷瘤小鼠.提示负载肿瘤抗原的DC疫苗诱导的CTL可能在肿瘤的免疫治疗中发挥重要作用.     

苦参碱对小鼠H22细胞抗肿瘤作用的实验研究

目的:观察苦参碱在体内和体外的抗肿瘤作用.方法:MTT法检测苦参碱对小鼠腹水瘤细胞H22的体外杀伤作用;Annexin V-FITC/PI双标记法检测苦参碱对体外培养的H22细胞的诱导凋亡作用;在BALB/C小鼠H22移植瘤模型上观察苦参碱的体内抑瘤活性,透射电镜观察苦参碱治疗后荷瘤小鼠肝癌细胞的超微结构改变;免疫组化法检测荷瘤小鼠肝癌组织中Bcl-2、Bax蛋白表达.结果:苦参碱在体外能够明显抑制H22细胞的生长和增殖,并可诱导细胞凋亡;对小鼠肿瘤生长也有明显抑制作用,高、低浓度组抑瘤率分别为60.71%和62.53%;用药组小鼠肿瘤组织中,电镜下可见较为典型的细胞凋亡的形态学改变;肿瘤组织中Bcl-2蛋白表达明显降低,Bax蛋白表达增强,与荷瘤对照组相比有显著性差异(P＜0.01).结论:苦参碱在体内外对H22肿瘤细胞生长均有抑制作用,同时可促进肿瘤细胞表达Bax蛋白,抑制Bcl-2表达,诱导肿瘤细胞凋亡.     

树突状细胞联合重组腺病毒Ad-Mig基因治疗小鼠淋巴瘤的实验研究

目的 观察树突状细胞(DC)和腺病毒介导的小鼠Mig基因对小鼠淋巴瘤的抗肿瘤效果.方法 利用EG7细胞皮下注射C57BL/6小鼠建立小鼠淋巴瘤模型,单独或联合应用DC和携带Mig基因的重组腺病毒(Ad-Mig)直接进行瘤内注射治疗,观察小鼠皮下肿瘤生长情况.采用HE染色观察肿瘤组织的变化.用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL和NK的杀伤活性.结果 DC能显著抑制荷瘤小鼠皮下肿瘤的生长.使肿瘤组织中炎细胞数量增多而肿瘤细胞数量明显减少,能显著增强荷瘤小鼠脾细胞NK和CTL杀伤活性.与单独应用DC相比,DC与Ad-Mig联合应用可明显提高抗肿瘤效果.结论 DC对小鼠淋巴瘤有显著治疗效果.且与Ad-Mig基因联合应用能进一步提高抗肿瘤效果.     

DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究

目的:研究随着时间延长,DAPI标记间充质干细胞(MSCs)的标记率变化。方法:分离培养纯化成年大鼠骨髓MSCs,DAPI标记,不同时点荧光显微镜观察,计算MSCs中DAPI阳性率。将标记的MSCs移植到缺血下肢模型动物骨骼肌中,不同时点取材,冰冻切片,观察移植细胞。结果:标记当天,荧光镜下MSCs胞核呈明亮蓝色荧光,标记率接近100%,随着培养时间延长,标记率逐渐下降。移植1周和2周组织切片中,可见密集移植MSCs,3周以后,可检出的DAPI阳性细胞明显减少。结论:DAPI短期标记细胞效率很高,但标记率随着时间延长而迅速下降。     

成年大鼠脑出血后室管膜下区、血肿周围神经前体细胞增殖研究

目的 研究成年大鼠脑出血后室管膜下区、血肿周围组织神经前体细胞增殖的规律.方法 立体定向注射胶原酶建立大鼠纹状体脑出血模型.脉冲法或连续法腹腔注射Brdu标记增殖细胞.在脑出血后第2、7、14及28天处死大鼠,行Brdu免疫组化染色.对室管膜下区、血肿周围的Brdu免疫阳性细胞作细胞记数.结果 脉冲法Brdu标记.大鼠脑出血后第2天双侧室管膜下区和血肿周围Brdu阳性细胞数增加,第7天时达高峰,第14天仍可见较多的增殖细胞;连续法Brdu标记.在脑出血后第14天时室管膜下区和血肿周围可见较多Brdu阳性细胞,第28天时室管膜下区Brdu阳性细胞数降至对照水平.但血肿周围仍可见较多的Brdu阳性细胞.结论 成年大鼠脑出血后可诱导双侧室管膜下区和血肿周围神经前体细胞增殖增加;室管膜下区增殖细胞可能向血肿周围迁移.     

Study on Anti-mouse Hepatocellular Carcinoma Effect of Cytokine-induced Kill Cells Activated by Dendritic Cells Transfected With Mouse Hepatocellular Carcinoma Total RNA in vitro

目的 探讨转染小鼠肝癌H22细胞总RNA的树突状细胞(DC)疫苗体外抗小鼠肝癌的免疫作用.方法 提取小鼠四肢长骨骨髓,在rmGM-CSF和rmIL-4体外刺激下增殖分化为DC.制备小鼠脾淋巴细胞,在体外经rmIFN-γ、anti-CD3、rmIL-2和rmIL-1b诱导成为细胞因子诱导的杀伤性细胞(CIK细胞).制备肝癌H22细胞总RNA,体外转染DC,流式细胞仪检测转染前后的DC表面分子的表达情况.将转染H22细胞总RNA的DC和CIK细胞混合培养制备成为效应细胞,LDH释放法测定效应细胞对小鼠H22细胞、S180细胞的杀伤活性.结果 经H22细胞总RNA转染后的DC,其MHC Ⅰ类分子、MHC Ⅱ类分子及CD83、CD86表达率明显增高,CD14表达率降低(P＜0.05).转染H22细胞总RNA的DC激活的CIK细胞对H22细胞的杀伤率高于其对S180细胞的杀伤率(P＜0.05).转染H22细胞总RNA的DC激活的CIK细胞对H22细胞的杀伤率高于其他各组效应细胞对H22细胞的杀伤率(P＜0.05).结论 转染H22细胞总RNA的DC激活的CIK细胞对H22细胞具有高效而特异性的体外抗小鼠肝癌免疫作用.     

牛膝多糖与锌对小鼠树突状细胞增殖分化和抗原提呈能力的影响

目的 研究牛膝多糖与锌单用及合用在异源性抗原负载的条件下对小鼠树突状细胞 (DC) 增殖分化和抗原提呈能力的影响,并通过体内实验证实其对荷瘤小鼠的免疫效应,探讨其发生机制。方法 无菌处死正常小鼠获取其骨髓细胞,粒细胞-巨噬细胞刺激因子 (GM-CSF) 和白细胞介素-4 (IL-4) 体外诱导骨髓细胞生成 DC,同时培养液中加入不同质量浓度的牛膝多糖 (200、300、400 μg/mL)、锌 (0.02 μg/mL)。通过显微镜、流式细胞检测技术观察牛膝多糖、锌单用与合用在异源性抗原负载的条件下对 DC 的影响,并通过体内实验观察对 H22荷瘤小鼠脾指数、胸腺指数及肿瘤质量的影响。结果 牛膝多糖和锌单用在异源性抗原负载的情况下能够促进小鼠骨髓源性 DC 的分化、成熟及表面标记 CD86、CD11a 的表达,增强 DC 诱导的细胞毒性T淋巴细胞反应,能够使荷瘤小鼠免疫器官脾脏和胸腺的质量增加,明显抑制肿瘤的生长,并存在明显量效关系;中剂量为正性效应,高剂量为负性效应;但牛膝多糖和锌合用并不协同增强效应。结论 牛膝多糖和锌在异源性抗原负载的条件下能够通过刺激 DC 的分化成熟,提高其抗原提呈能力,进而起到提高机体细胞免疫的作用。     

肿瘤抗原冲击的树突状细胞对小鼠肾细胞癌的治疗作用研究

目的 树突状细胞(dendritic cell,DC)疫苗是近年来肿瘤免疫治疗的热点,文中观察肿瘤冻融抗原体外冲击的DC对肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)的治疗作用. 方法 反复冻融法制备肿瘤抗原,Lowry法测定肿瘤抗原蛋白浓度,小鼠重组巨噬细胞粒细胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、白细胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)培养扩增小鼠DC,肿瘤抗原体外冲击制备DC瘤苗,DC瘤苗与淋巴细胞混合培养诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL),LDH释放法测定CTL的杀伤活性,小鼠皮下接种Ranca细胞荷瘤后72 h皮下接种DC瘤苗,1次/周,共接种3次,荷瘤后4周取瘤体称重. 结果 小鼠RCC Ranca细胞冻融抗原体外冲击制备的DC瘤苗具有典型的DC形态特征与免疫表型特征,在体外能有效诱导肿瘤特异性CTL生成,对于小鼠RCC Ranca细胞具有较强的杀伤作用,体内接种DC瘤苗治疗组小鼠肿瘤体积较等渗盐水对照组及细胞因子激活的杀伤(lymphokine activated killev,LAK)细胞治疗对照组明显缩小, DC瘤苗治疗组小鼠的瘤体重较等渗盐水对照组(P<0.01)及LAK细胞治疗对照组(P<0.05)显著减小. 结论 肿瘤冻融抗原体外冲击的DC瘤苗对小鼠RCC具有明显的治疗作用,本研究为DC免疫治疗复发、难治性RCC提供了实验依据.     

IDO基因转染小鼠树突状细胞体外诱导Treg细胞增殖的研究

目的调节性T细胞(Treg)在肿瘤局部免疫耐受中发挥了重要作用,但其产生机制尚不清楚。本实验通过将吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)基因转染小鼠树突状细胞(DC),体外研究对Treg细胞的诱导增殖作用,为肺癌免疫耐受产生机制研究提供新的依据。方法采用慢病毒转染技术,将含人全长IDO基因转染到小鼠DC细胞,G418筛选获得IDO-DC细胞,同时设置空白对照组(DC细胞)及空质粒转染组(EGFP-DC细胞),将3种细胞分别与小鼠T淋巴细胞混合培养,利用流式细胞技术分析3种细胞对Treg细胞的诱导增殖作用。结果 IDO基因成功转染到小鼠DC细胞,与小鼠T淋巴细胞共培养后,Treg细胞增殖明显,和EGFP-DC细胞(7.5%vs 3.6%,P<0.05)及DC细胞(7.5%vs 3.1%,P<0.05)相比差异显著。结论 IDO基因转染小鼠DC细胞在体外能明显增强Treg细胞的增殖,为肺癌局部免疫耐受机制研究提供了新的实验依据。     

Brdu标记VECs和ADSCs构建组织工程骨体内增殖研究

目的研究联合培养的血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)和脂肪干细胞(adipose-derived stromal cells,ADSCs)构建组织工程骨,在体内增殖和分化情况.方法 (1)用猪椎骨制备部分脱蛋白骨,纤维粘连蛋白修饰制成部分脱蛋白生物骨,电镜扫描生物骨表面情况;(2)选用大鼠脐血单个核细胞诱导分化的血管内皮细胞和大鼠脂肪干细胞,体外1:1浓度联合培养;(3)分别用Brdu标记的血管内皮细胞、脂肪干细胞和联合培养细胞体外复合部分脱蛋白生物骨,体外培养6 d后植于SD大鼠两侧股部肌袋处;2周、4周、8周、12周取材,硬组织切片中Brdu抗体免疫荧光染色,观察植入的种子细胞在机体内的增殖分化情况.结果 (1)猪椎骨制备部分脱蛋白骨孔隙分布均匀,由大量的羟基磷灰石纤维编织而成;部分脱蛋白生物骨表面可见大量颗粒状蛋白结晶;(2)Brdu免疫荧光染色各组植入种子细胞开始呈分散状分布,细胞逐渐增殖呈巢状,血管内皮细胞组和联合培养细胞组植入内皮细胞增殖形成大量新生血管;未标记Brdu空白组未见阳性细胞出现.结论组织工程骨植入种子细胞在体内能大量增殖,参与新组织和新生血管的形成.     

两种干细胞体外标记及体内示踪方法的比较研究

目的研究5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine,Brdu）及PKH26作为人真皮多能干细胞（human dermis multipotent stem cells,hDMCs）标记物进行体内示踪的可行性。方法分别以Brdu和PKH26标记培养的hDMCs,在体外观察其标记效果。将标记的hDMCs以2×10^6个细胞/只尾静脉移植经6Gy全身照射的C57BL/6J小鼠,检测hDMCs在各脏器的定植与分布。结果 Brdu和PKH26在体外均能很好地标记hDMCs,在体内可检测到Brdu标记的hDMCs,尚不能检测到PKH26标记的hDMCs。结论与PKH26相比较,Brdu更适合作为hDMCs体外标记及体内示踪的标记物。     

小鼠骨髓干细胞体外诱导成熟的树突状细胞对T细胞增殖的影响

目的：研究小鼠骨髓干细胞体外诱导分化的树突状细胞对T细胞增殖的影响,为进一步研究树突状细胞的功能及临床肿瘤的治疗提供有效的实验方法。 方法：应用IL-4和GM-CSF培养小鼠骨髓细胞5~7 d,光镜下观察细胞形态学变化;培养至第5~6天,加入黑色素瘤（B16）冻融抗原继续培养1~2 d,流式细胞仪检测细胞表面分子CD83、CD86,并与同种异体T细胞混合培养72 h,终止培养前16 h加入³H-TdR（18.5 kBq/孔）,γ-液体闪烁仪测定cpm值。 结果：用IL-4和GM-CSF培养3 d可见细胞形态发生改变,细胞形状不规则,培养5~6 d时,有刺状突起、拉长,为典型树突状细胞形态学特征;抗原装载后流式细胞仪检测CD83、CD86表达,IL-4+GM-CSF+TNF-α组（61.68%、71.25%）及IL-4+GM-CSF+冻融抗原组（63.11%、76.88%）明显高于对照组（2.41%、3.88%）及单纯IL-4+GM-CSF培养组（21.86%、28.69%）（P<0.001）,IL-4+GM-CSF+TNF-α组与IL-4+GM-CSF+冻融抗原组比较,CD83和CD86表达差异无显著性;液闪仪检测结果显示,IL-4+GM-CSF+冻融抗原组刺激T细胞增殖的能力明显强于其他组,且差异具有显著性（P<0.001, P<0.05）。 结论：小鼠骨髓细胞体外培养成功地诱导扩增出足量树突状细胞,经肿瘤抗原刺激后绝大部分成熟,并能够刺激同种异体T细胞大量增殖,参与免疫应答。     

同种异体移植的骨髓间充质干细胞在椎间盘环境中存活及增殖能力的研究

目的观察同种异体移植的骨髓间充质干细胞（MSCs）在椎间盘环境中的存活及增殖能力。方法从30只日本大白兔中分离培养骨髓MSCs,Ad—EGFP标记后同种异体移植到椎间盘环境中,术后1周、2周、4周、8周、12周取材,Brdu处理后做石蜡切片,荧光显微镜观察细胞存活,并行Brdu免疫组化染色检测细胞增殖。结果术后1周、2周、4周、8周、12周标本内可观察到绿色荧光,术后1周、2周、4周、8周、12周标本内均有Brdu免疫组化染色阳陆细胞。结论自体移植的MSCs在椎间盘环境中能够存活并且增殖,为MSCs作为椎间盘组织工程的种子细胞提供了实验依据。     

一种骨髓单个核细胞新型示踪方法——细胞膜染料DiD标记法

 目的 检测细胞膜染料DiD对骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells, BM-MNC)的染色效率和造血功能的影响,并用DiD示踪BM-MNC活体直观观察DiD标记的BM-MNC在小鼠颅骨骨髓内的顺利归巢。方法 体外流式细胞术分析方法和激光共聚焦扫描显微镜成像方法检测BM-MNC的DiD染色效率;CCK-8细胞活性-增殖实验和造血集落形成实验,检测DiD染料对BM-MNC的造血功能的影响;单/双光子共聚焦显微镜下活体直观观察DiD标记的BM-MNC在小鼠颅骨骨髓内的归巢。结果 BM-MNC的DiD染色效率高达90%以上,且DiD对BM-MNC的细胞活性-增殖和造血能力均无明显的毒性影响(P＞0.05);单/双光子共聚焦显微镜下,在活体小鼠颅骨骨髓内可直观观察到DiD标记的BM-MNC的顺利归巢。结论 细胞膜染料DiD对BM-MNC的染色效率高、均一,无明显细胞毒性,荧光不易被淬灭,且受机体自身组织的背景干扰少,用于活体示踪时DiD标记的BM-MNC可顺利归巢到骨髓。     

老年骨髓基质细胞移植治疗急性心肌梗死实验研究

目的 :观察老年大鼠骨髓基质细胞 (MSC)能否在急性心肌梗死环境中存活、增殖和向心肌样细胞分化。方法 :选用老年近交系Wistar大鼠 ,取供体鼠MSC ,体外扩增 ,DAPI荧光标记。受体鼠经左冠状动脉结扎建立急性心肌梗死模型。 1周后将标记的MSC用直接注射方式移植到梗死灶中 ,移植后 3、7、14d取材 ,观察梗死灶中MSC分布、扩散及心肌特异性蛋白T(TnT)的表达。结果 :在不同移植时间梗死灶中都发现DAPI阳性的细胞 ,且细胞计数随移植时间延长而增多。部分细胞表达TnT ,其中少数细胞出现心肌样横纹。结论 :老年大鼠MSC可在急性心肌梗死环境中存活、增殖 ,有向心肌样细胞分化的能力。     

大鼠树突状细胞的体外扩增与初步鉴定

目的建立体外诱导和扩增大鼠骨髓树突状细胞(DCs)的方法，并进行生物学鉴定。方法大鼠骨髓细胞经贴壁去除悬浮细胞，加入细胞因子(IL-4和GM—CSF)培养2周。经过先镜，透射电镜观察培养DCs的形态学特征；通过同种T细胞混合培养，采用MTT比色分析法测定不同浓度的DCs发同种T细胞增殖的能力。结果培养的DC胞浆突起大而长，呈树突状，具有DCs的典型形态，并且具有强烈的激发同种异体T细胞增殖的能力。结论采用大鼠骨髓细胞经贴壁去除悬浮细胞，加入细胞因子(IL-4和GM—CSF)序贯培养，能获得大量、较高纯度的DCs。     

慢性粒细胞白血病患者骨髓中不同细胞诱生树突状细胞的体外研究

目的:体外诱导慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓单个核细胞(BMMNCs)、CD34+细胞、单核细胞为树突状细胞(DCs),并对其形态、表型及其刺激T细胞增殖作用进行比较。方法:利用GM-CSF、IL-4、TNF-α体外定向诱导生成树突状细胞,利用流式细胞仪对所诱生的细胞进行细胞形态及表型检测,用D-FISH方法检测所诱生DCs的白血病源性。并应用MTT法检测所诱生的DCs刺激T细胞增殖的能力。结果:CML患者BMMNCs、CD34+细胞、单核细胞体外均可诱导生成bcr/abl融合基因阳性的DCs,前者DCs产量明显高于后二者,但均具有刺激自体及异体T细胞增殖的能力,且三者无显著性差异。结论:来源于CML患者骨髓的BMMNCs、CD34+细胞、单核细胞均可诱生成CMLDCs,对T细胞均具有刺激增殖能力,但BMMNCs所诱生的DC主要来源于未成熟的中性粒细胞。     

Immunity of Unloaded Dendritic Cells in Lung Melanoma of Mice

In order to investigate the immunity of unloaded dendritic cells(DCs) derived from murine bone marrow to preexisting lung melanoma metastases of mice,MO5 were intravenously in-jected to induce lung metastases in syngeneic C57BL/6 mice.Unloaded GM-CSF DCs,PBS and DCs SIINFEKEL were subcutaneously injected into the mice,which were divided as experimental group,negative control group and positive control group respectively.Monoclonal antibody was used to deplete NK or T cells separately.The immunity-inhibitory effects on the lung melanoma were ob-served and the corresponding effector cells were examined.It was found that in the experimental and positive groups,the regression was induced in metastatic nodules in the lungs of tumor-bearing mice,but abrogated by treatment with anti-asialo-GM1 but not anti-CD8.It was concluded that the unloaded DCs could suppress the lung melanoma metastases to some extent,which was mediated by NK cells,and could be used as a potent therapeutic agents for lung tumor.     

小鼠脾脏来源树突状细胞的体外扩增培养

目的:对体外诱导小鼠脾脏单个核细胞分化成的树突状细胞(DC)的生物学表型及功能进行检测,并与骨髓来源的DC进行比较.方法:分离小鼠脾脏单个核细胞,在体外培养的条件下通过添加25 ng·ml-1的粒-单核细胞集落刺激因子和25 ng·ml-1的白细胞介素-4(IL-4)将其诱导为DC,分别从细胞形态、表型以及功能3个方面对其进行检测,并与骨髓来源的DC进行比较.结果:小鼠脾脏来源的DC经磷酸脂多糖(LPS)刺激成熟后其表面显示出明显的树枝状突起,高表达CD11c、CD86及MHC-Ⅱ类分子,并具有极强的刺激同种异基因淋巴细胞增殖的能力,其特征与骨髓来源的DC相差无几.结论:小鼠脾脏单个核细胞能够被诱导为具有正常形态、表型、功能的DC,为DC的功能研究以及进一步制备相应的肿瘤疫苗提供又一可靠来源.