DAPI标记的骨髓间充质干细胞体内外示踪实验研究

目的:研究随着时间延长,DAPI标记间充质干细胞(MSCs)的标记率变化。方法:分离培养纯化成年大鼠骨髓MSCs,DAPI标记,不同时点荧光显微镜观察,计算MSCs中DAPI阳性率。将标记的MSCs移植到缺血下肢模型动物骨骼肌中,不同时点取材,冰冻切片,观察移植细胞。结果:标记当天,荧光镜下MSCs胞核呈明亮蓝色荧光,标记率接近100%,随着培养时间延长,标记率逐渐下降。移植1周和2周组织切片中,可见密集移植MSCs,3周以后,可检出的DAPI阳性细胞明显减少。结论:DAPI短期标记细胞效率很高,但标记率随着时间延长而迅速下降。     

人羊膜上皮细胞的体外培养及标记

目的 改良人羊膜上皮细胞的培养方法,检测生长特性,观察DAPI标记HAECs的效率。 方法 取足月剖宫产术后羊膜经胶原酶和胰蛋白酶消化获得上皮细胞。MTT法绘制细胞生长曲线、流式细胞仪检测细胞的生长周期,免疫组化对细胞角蛋白进行鉴定。并用DAPI标记,测1、2周荧光阳性率。 结果 培养的HAECs多角形,生长分为缓滞期、对数增长期和平台期,约80%处于细胞周期的静止期G0。细胞角蛋白keratin阳性表达。DAPI标记1周标记率为100%;2周细胞形态好,标记率不变,荧光强度减弱。 结论 本实验方法成功培养人羊膜上皮细胞。DAPI短期标记效果理想。     

体外诱导LAK细胞活性方法及其意义

目的：比较不同诱导方法对LAN细胞杀伤活性的影响。方法：外周血单个核细胞（PBMC）用重组白细胞介素-2（rIL-2）体外诱导LAK细胞，采用3H－TdR释放法测定LAK活性。结果；（1）PBMC诱导3h后，LAK活性高于或至少不低于24～72h者；（2）PBMC诱导3h后洗去游离的rIL-2，并不影响继续诱导LAN细胞活性；（3）PBMC分离后以清洗2次为佳；（4）PBMC用正常人血浆培养比用肝炎病人自体血浆培养诱导的LAK活性高。结论：在本试验系统中，PBMC分离后，清洗2次，以正常人血浆经IL-2诱导3h为最佳回输条件。     

rhIL-10对小鼠T淋巴细胞及NK细胞活性的影响

目的 研究ｒｈＩＬ－１０对小鼠免疫功能的影响。方法 用ＭＴＴ还原法检测ＣｏｎＡ诱导的Ｔ淋巴细胞增殖试验,中性红染色法检测ＮＫ细胞活性。结果 ｒｈＩＬ－１０能抑制小鼠Ｔ淋巴细胞及ＮＫ细胞活性（Ｐ〈０．０１）,这种抑制作用随剂增加而加强,结论ｒｈＩＬ－１０能抑制小鼠Ｔ淋巴细胞及ＮＫ细胞活性,并呈剂量依赖关系。     

PGE2对LPS诱导小鼠骨髓源性树突细胞成熟及EP4受体表达影响

目的：观察不同浓度前列腺素E2(PGE2)刺激对脂多糖( LPS)诱导小鼠骨髓源性树突细胞( DCs)成熟及EP4受体表达的影响。方法采用重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子( rmGM-CSF)、重组小鼠白细胞介素4( rmIL-4)刺激小鼠骨髓源细胞,诱导生成DCs;经LPS(100 ng/ml)诱导成熟后,用不同浓度 PGE2(0．625、1．25、2．5、5、10、20 nmol/L)刺激 DCs 24 h,流式细胞术检测 DCs 表型 CD40、CD83、MHC-Ⅱ的表达和抗原摄取功能,荧光间标法检测小鼠骨髓源DCs细胞膜上EP4的表达,以平均荧光强度表示表达的高低;MTT法检测经PGE2及LPS诱导成熟的DCs对T细胞增殖的作用。结果流式细胞术结果显示 PGE2(2．5、5、10 nmol/L)能明显上调 CD40、CD83、MHC-Ⅱ的表达;PGE2(1．25、2．5、5、10、20 nmol/L)能明显抑制DCs的抗原摄取功能;MTT法检测结果显示PGE2(2．5、5、10 nmol/L)刺激DCs能促进T细胞增殖的作用;荧光间标法检测结果显示PGE2(2．5、5、10 nmol/L)明显升高DCs细胞膜上EP4表达。结论 PGE2可以调节DCs功能,该作用可能与其调节EP4受体表达相关。     

体外抗体功能修饰抑制性KIR对人NK细胞的影响

目的:检测抗体封闭抑制性受体KIR2DL1和KIR2DL2/2DL3对人NK细胞功能的影响.方法:应用Rosettesep人NK分选试剂盒分选外周血NK细胞,观察抗体封闭KIR2DL1和KIR2 DL2/2DL3受体后,NK细胞对不同白血病细胞(人肿瘤细胞株NB4、Raji和K-562)及同种异体的成熟树突状细胞(DC)的杀伤活性;检测混合淋巴细胞反应中NK细胞对T淋巴细胞增殖的影响;检测细胞因子TGF-β1的表达水平.结果:任何一个抗体封闭KIR后,NK细胞杀伤NB4细胞活性均增强,并与抗体浓度呈现量效关系(P＜0.05),2个抗体联用能增强NK细胞的杀伤活性;对Raji细胞的杀伤活性则改变较小;NK细胞对K-562细胞具有很强的杀伤活性,但经抗体封闭后,这种活性并没有提高.经抗体封闭KIR后,NK细胞对成熟DC的杀伤活性明显增强,并与抗体浓度呈现量效关系(2.20%±1.10% vs 37.59%±5.06%),各组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).经抗体封闭后的NK细胞在混合淋巴细胞反应中能明显提高对T细胞的增殖抑制(77.85%±8.31% vs 43.05%±5.95%,P＜0.05),上清液中细胞因子TGF-β1的含量增加.结论:以抗体修饰抑制性KIR受体有助于提高NK细胞杀伤肿瘤及同种异体成熟DC的能力,活化的NK细胞通过分泌TGF-β1,抑制T细胞的增殖、活化.     

NK细胞体外培养及对HepG2细胞的杀伤活性研究

目的:研究NK细胞的体外培养及对HepG2的杀伤活性。方法:采集外周血,肝素抗凝,分离单个核细胞(PMBC),用NK细胞培养基(补加IL-2200U/ml)培养12d,用流式细胞仪检测其表面标志及细胞毒颗粒表达水平,并按效靶比5∶1、10∶1、20∶1加入HepG2细胞,比较其杀伤活性。结果:培养12d的NK细胞CD3~-CD56~+阳性率(73.6±11.3)%与培养前的阳性率(14.2±5.1)%相比有显著性差异(P<0.001),其穿孔素、颗粒酶B、CD107a的表达水平分别为(75.5±10.9)%、(62.2±8.9)%、(63.9±10.5)%。在5∶1～20∶1效靶比范围内,随着效靶比增加,NK对HEPG2细胞杀伤活性增强(P<0.05)。结论:NK细胞对肿瘤细胞具有杀伤活性,随着效靶比增加,杀伤活性增强。     

肺癌患者口服消炎痛血浆PGE_2水平的变化及对NK细胞杀伤活性的影响

观察了１０例原发性肺癌患者口服消炎痛（ＩＮ）前、后血浆ＰＧＥ_２含量的变化及对ＮＫ细胞活性的影响。结果：１，肺癌患者血浆ＰＧＥ_２水平明显高于正常人，Ｐ＜０．００１；口服常规剂量ＩＮ后，血浆ＰＧＥ_２降至接近正常人水平，Ｐ＞０．５０。２，服ＩＮ前、后患者血浆对ＮＫ细胞活性的影响明显不同，前者使ＮＫ细胞活性明显降低，对ＮＫ４细胞活性的抑制率显著高于服ＩＮ后，Ｐ＜０．００１。提示ＰＧＥ_２增高是肺癌患者ＮＫ细胞活性低下的原因之一，ＩＮ可通过抑制ＰＧＥ_２的产生和（或）对ＮＫ细胞的直接作用发挥免疫增强效应。     

特女贞甙体外对小鼠脾淋巴细胞转化和自然杀伤细胞活性的影响

目的：观察特女贞甙（ＳＰＮ）体外对小鼠脾淋巴细胞转化和自然杀伤细胞活性的影响。方法：分别采用（１）３Ｈ－ＴｄＲ掺入法，以核素掺入量为测定指标；（２）３Ｈ－ＴｄＲ标记靶细胞释放法，以杀伤率和抑制率为测定指标。结果：ＳＰＮ能与亚适量刀豆球蛋白Ａ（ＣｏｎＡ）协同提高正常鼠脾Ｔ淋巴细胞的转化；ＳＰＮ对正常鼠脾自然杀伤细胞（ＮＫ）活性无明显作用（Ｐ＞０．０５），但能显著提高由环磷酰胺抑制的ＮＫ杀伤功能（Ｐ＜０．０１），减轻由地塞米松引起的ＮＫ活性低下作用（Ｐ＜０．０１）。结论：ＳＰＮ为中药女贞子中具有免疫活性的水溶性成分之一。     

蜕膜自然杀伤细胞的表型及功能变化

目的：通过比较蜕膜自然杀伤细胞（dNK细胞）与外周血NK细胞（pNK细胞）的表型及功能变化,探讨dNK细胞特殊的表型和功能与母胎界面免疫耐受调节机制的关系.方法：收集晚孕胎膜组织及外周血,流式细胞术检测dNK细胞与pNK细胞表型的差异;免疫磁珠分选dNK细胞与pNK细胞,乳酸脱氢酶法测定其对K562的自然杀伤活性.结果：dNK细胞表面CD16的表达明显低于pNK细胞（P＜0.01）,NKG2A的表达明显高于pNK细胞（P＜0.01）,NKG2D的表达低于pNK细胞（P＜0.05）;dNK细胞对K562的自然杀伤活性明显低于pNK细胞（P＜0.01）.结论：dNK细胞特殊的表型和功能可能是维持母胎界面免疫耐受的重要因素.     

树突状细胞联合重组腺病毒Ad-Mig基因治疗小鼠淋巴瘤的实验研究

目的 观察树突状细胞(DC)和腺病毒介导的小鼠Mig基因对小鼠淋巴瘤的抗肿瘤效果.方法 利用EG7细胞皮下注射C57BL/6小鼠建立小鼠淋巴瘤模型,单独或联合应用DC和携带Mig基因的重组腺病毒(Ad-Mig)直接进行瘤内注射治疗,观察小鼠皮下肿瘤生长情况.采用HE染色观察肿瘤组织的变化.用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL和NK的杀伤活性.结果 DC能显著抑制荷瘤小鼠皮下肿瘤的生长.使肿瘤组织中炎细胞数量增多而肿瘤细胞数量明显减少,能显著增强荷瘤小鼠脾细胞NK和CTL杀伤活性.与单独应用DC相比,DC与Ad-Mig联合应用可明显提高抗肿瘤效果.结论 DC对小鼠淋巴瘤有显著治疗效果.且与Ad-Mig基因联合应用能进一步提高抗肿瘤效果.     

浸润巨噬细胞、自然杀伤细胞与甲状腺自身免疫

作者用 APAAP 法对37例甲状腺标本作免疫组化研究,结果发现在桥本甲状腺炎(HT)与非毒性甲状腺肿(NTG)间浸润单个核细胞中 Ki-M8~+细胞比例差异显著(p<0.05),而 NKH-1~+细胞比例差异不显著.在 HT 与 Graves 病(GD)间以及 GD 与 NTG 间,无论是 Ki-M8~+细胞抑或 NKH-1~+细胞比例差异均不显著.Ki-M8~+细胞浸润程度与滤泡细胞 HLA-DR 抗原表达成正相关.Ki-M8~+及 NKH-1~+细胞多呈散在浸润,在有破坏的 HT 甲状腺滤泡中常见 NKH-1~+细胞,作者认为是自然杀伤细胞攻击甲状腺滤泡的证据之一.     

膀胱癌患者外周血NK细胞活性的研究

本研究测定了３２例膀胱癌和２６例前列腺增生症患者外周血ＮＫ细胞活性，并将膀胱癌组ＮＫ细胞活性分别与正常对照组及前列腺增生症组进行比较，其结果表明膀胱癌患者的ＮＫ细胞活性（３８．９１±２．２３％）比对照组（５０．９１±１．６６％）明显低，（Ｐ＜０．０１）与前列腺增生症组（４９．２７±２．３０％）相比亦有显著差异（Ｐ＜０．０１）。     

原发性肝细胞癌中枯否细胞、肝脏NK细胞的分布及意义

目的：研究枯否细胞、肝脏自然杀伤(NK)细胞在原发性肝细胞癌(PHCC组织中分布规律，探讨其在PHCC发生发展中的作用及其相互关系。方法：应用免疫组织化学S—P法检测51例人体肝癌组织中的巨噬细胞标志物CD68和NK细胞标志物CD57的表达，对阳性细胞数进行形态定量比较与相关分析。结果：CD68阳性细胞数随PHCC分化程度降低而减少，而CD57阳性细胞数在PHCC不同分化组中无显著差异；在PHCC中CD68、CD57阳性细胞数呈线性正相关。结论：枯否细胞数量与肝癌分化程度密切相关，并与肝脏NK细胞数量呈正相关。     

Comparison of the quantities and subset distributions of natural killer cells among different races

Background Natural killer （NK） cells play critical roles in host immune defense, while the quantities and subset distributions may vary among different races. To address the difference, we compared these variables among Chinese Han, the Caucasians and the Blacks. The study may provide critical background information for both basic research and clinical investigation. Methods Blood samples collected from populations of different races were tested within 12 hours after collection and subsets of NK cells were characterized using flow cytometry. Results The absolute NK count in the Chinese Han was significantly higher than that in the Caucasian. The Han and Caucasian groups showed higher percentages of cytotoxic subset compared to that of the Black group. The percentage of cytokine-producing subset of Chinese Han group was lower than that of Caucasian and Black groups. Black group had a higher percentage of function-unknown NK subset than that of the Han and Caucasian groups. Conclusion Our data indicated that NK cell count and the distribution of different subsets varied among different races, which should be taken into consideration in related investigations.     

Antitumour activities of cytokine-induced killer cells and dendritic cells in vitro and in vivo

Solidtumourcellsshowaresistancetoimmunologicaleffectorcellsinvitro.1Theresistancemaybeonereasonwhythesetumours withstandimmunotherapeuticapproachesin humans.Dendriticcells(DC)playanimportant roleintheimmuneresponsetotumourassociated antigensinhumans.DCintheperipherycapture andprocessantigens,expresslymphocyte costimulatorymolecules,migratetolymphoid organsandsecretecytokinestoinitiateimmune response.Cytokine inducedkiller(CIK)cellsarethemajor histocompatibilitycomplex unrestrictedcytotoxic …     

红细胞对NK细胞活性的影响

应用３ＨＴｄＲ释放法检测了红细胞对ＮＫ细胞活性的影响，结果表明在不同效靶比例时，红细胞均能显著增强ＮＫ细胞杀伤活性（Ｐ＜００１），而且红细胞的这种功能与其胞质液有关。提示红细胞通过调节ＮＫ细胞活性参与机体的肿瘤免疫反应。     

CIK治疗肝硬化患者抗病毒疗效及对淋巴细胞和DC的影响

目的:观察自体细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)治疗对于慢性HBV感染所致的肝硬化患者淋巴细胞和树突细胞的影响以及其抗病毒疗效.方法: 33例肝硬化患者给予CIK细胞治疗,在治疗前后检测患者淋巴细胞亚群和mDC以及pDC的数量、病毒学标志以及其他不良反应.结果:CIK治疗后, 12例患者HBVDNA阴转,总有效率达51.5%.14例HBeAg阳性患者中有10例阴转, 5例患者出现HBeAb转换.在治疗无效病例仅CD8 T淋巴细胞、NKT细胞较治疗前有明显增高,而有效病例则表现出CD3 、 CD4 、 CD8 T淋巴细胞以及NKT细胞均较治疗前明显增高.且有效病例mDC、 pDC的数量较治疗前有明显增高.结论:CIK细胞治疗对于慢性HBV感染所致的肝硬化患者有一定的抗病毒疗效.其可诱导体内多种免疫活性细胞增高.