EV71小鼠适应株制备及体内外感染特点

目的 用1日龄ICR小鼠传代制备EV71小鼠适应株,研究EV71亲代株与小鼠适应株的体内外感染特点,建立EV71感染ICR小鼠动物模型,为病毒疫苗和抗病毒药物的研究提供实用的动物评价工具.方法 用1日龄ICR小鼠进行EV71病毒(Fuyang-0805)的传代,得到小鼠传代株.以一定浓度亲代株和传代株病毒分别接种RD、Vero、SY5Y、Caco-2四种细胞,定量方法检测各时间点不同毒株在四种细胞上的复制数量,CCK8方法测定各时间点细胞的存活率;同时,两毒株分别腹腔注射感染1日龄小鼠,定期安乐死动物,采集肺、小肠、骨骼肌、大脑四种器官组织,进行动物体内病毒半定量和定量分析,同时进行各器官组织病理学观察、免疫组织化学鉴定.结果 与亲代毒株相比较,小鼠传代株(EV71-MMP4)表现出更强的肌肉来源细胞嗜性与毒性;同时,两毒株腹腔注射感染1日龄小鼠后,EV71-MMP4感染的小鼠体重增长较正常小鼠体重增长缓慢;半定量和定量RT-PCR显示,在小鼠肌肉中的病毒载量于感染后1 d和5 d达到高峰.EV71-MMP4感染组感染率较高、病毒组织分布较广、感染持续性较好、病毒载量较高,高剂量病毒感染后小鼠小肠、心肌和骨骼肌可观察到细胞空泡变性、淋巴细胞浸润等病理变化.免疫组织化学显示感染后小鼠骨骼肌有EV71病毒特异分布.结论 阜阳EV71小鼠适应株表现出较亲代毒株更好的小鼠易感性、细胞毒性,所建立的动物模型可用于EV71病毒致病机制、感染特点的研究和病毒疫苗及药物的评价.     

C4亚型人肠道病毒71型的小鼠肌肉适应株对小鼠具有致死毒力

目的 人肠道病毒71型( EV71)感染婴幼儿可导致手足口病,偶尔伴随有严重的并发症.建立EV71的小鼠模型是深入研究病毒感染的致病机制、进行疫苗和药物评价的基础.方法将EV71的临床分离株在小鼠骨骼肌中进行系列传代,得到了小鼠的肌肉适应株MP10.使用MP10经腹腔注射感染10日龄ICR小鼠,对感染小鼠的症状、病毒复制和病理进行了监测.结果 与临床分离株相比,MP10对人横纹肌瘤细胞(rhabdomyosarcoma cell,RD细胞)的感染力提高,并且对小鼠的毒力增强,MP10感染10日龄小鼠可导致其瘫痪和死亡.病毒主要在骨骼肌中复制,并引发大面积的坏死性肌炎,同时神经组织未观察到病变.病理分析发现:感染小鼠体内与呼吸运动相关的肌肉均发生严重的坏死性肌炎,推测此类肌肉的坏死会影响小鼠的呼吸功能,从而成为导致小鼠死亡的因素之一.结论 建立了C4亚型EV71毒株感染10日龄ICR小鼠的模型,该模型可作为研究EV71感染的致病机制、以及疫苗和药物评价的工具.     

EV71临床分离株BALB/c小鼠致病特点分析

目的 将肠道病毒71型(EV71)临床分离株接种小鼠观察其致病特点.方法 将6株EV71临床株分别腹腔接种1日龄BALB/c小鼠,观察小鼠表现以及脑、肺脏、骨骼肌组织病理变化;采用免疫组化和RT-PCR方法,检测组织中病毒抗原和基因片段.结果 临床分离的6株EV71(C4亚型)接种1日龄小鼠均出现病症,其中JN200804株实验小鼠症状较重,小鼠脑组织和骨骼肌可观察到细胞空泡变性、淋巴细胞浸润等病理变化;JN200804株感染组小鼠脑内检测到EV71抗原和基因片段.结论 6株EV71临床株均可感染小鼠并致病,重者出现松弛型麻痹并死亡,轻者出现震颤、麻痹但可恢复至正常.     

通过遗传多样性小鼠筛选EV71致病相关基因

目的通过遗传多样性小鼠资源(Genetic Diversity Mice Resources)筛选肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)的致病相关基因,深入理解该病毒的致病机理,对临床诊断、治疗以及预后提供基础。方法 107copies EV71病毒经腹腔感染4～6周龄遗传多样性小鼠品系,收集血液和后肢骨骼肌样本,利用实时荧光定量PCR技术分析病毒载量,之后利用The Gene Mine系统遗传学数据库分析感染数据,筛选获得EV71致病相关基因。结果通过遗传多样性小鼠感染数据筛选到53个与EV71致病相关的基因。结论遗传多样性小鼠在模拟人群基因多样性、研究复杂性状疾病等方面具有较大的优势,是筛选致病相关基因理想的动物新资源。     

肠道病毒感染致神经损伤小鼠脑组织NOD样受体蛋白3的表达

目的:探讨NOD样受体蛋白3(NLRP3)在肠道病毒(EV)感染导致的神经损伤中的作用.方法:30只BALB/c小鼠分为对照组、肠道病毒(EV)71组和柯萨奇病毒A组2型(CVA2)组,每组10只.EV71组和CVA2组小鼠分别经腹腔注射EV71或经肌内注射CVA2,观察临床症状和生存情况.感染后第7天,采用HE和尼氏...     

硒代蛋氨酸与亚硒酸钠对EV71在体内外增值的影响

目的探讨硒代蛋氨酸和亚硒酸钠抗EV71病毒感染的效果,解析硒蛋白在机体抗感染的免疫作用。方法以非洲绿猴肾细胞(VERO细胞)和ICR小鼠为研究模型,用体外细胞培养和小鼠的动物实验来探讨不同含量的硒代蛋氨酸和亚硒酸钠对EV71在VERO细胞中和ICR小鼠体内增值的抑制作用,用荧光定量PCR方法定量分析病毒载量。结果 2μmol/L和3μmol/L的硒代蛋氨酸在5d内能有效抑制EV71在VERO细胞中的增值。而用5mg/L硒代蛋氨酸饲养的小鼠产下的幼鼠经EV71感染后,肌肉组织中的EV71核酸载量也比对照组显著降低。结论硒代蛋氨酸在体外和体内都能够有效抑制EV71复制,暗示硒代蛋氨酸可能参加了机体的免疫应答抗EV71的感染。     

缺硒饲养ICR小鼠加快肠道病毒71型在体内的复制研究

目的观察硒蛋白对手足口病病原体肠道病毒71型（EV71）在感染动物体内复制的影响情况。方法将30只雌性ICR小鼠分为常规饲料组、缺硒饲料组和加硒饲料组,各种饲料饲养小鼠6周后,通过电感耦合等离子体质谱仪（ICP—MS）测定小鼠外周血中硒的含量以及荧光定量PCR方法测定动物体内肠道病毒EV71的载量．然后用病毒空斑实验测定病毒滴度并用酶促法来测定主要硒蛋白酶的活性。结果通过测定外周血中硒的含量发现,缺硒饲料组的ICR小鼠硒含量为0．081μg／g,显著低于常规饲料组0．135μg／g和加硒饲料组的0．128μg／g,差异有统计学意义（P〈0．01）;用荧光定量PCR方法测定EV71载量,加硒饲料组ICR小鼠体内EV71核酸扩增Ct值,明显高于缺硒饲料组（P〈0．05）;ICR小鼠体内主要硒蛋白酶（GPX1）的活力在缺硒饲料组的动物体内显著低于加硒饲料组：病毒空斑实验结果表明,缺硒饲料组的ICR小鼠体内EV71病毒复制活力显著高于其他两组。结论缺硒可能导致硒蛋白GPX1合成减少或其活力降低从而加快EV71在宿主内的复制。     

高致病性禽流感(H5N1)实验流行病学初探——感染途径

目的观测不同感染途径实验性感染BALB／c小鼠后的感染状况，了解H5N1病毒的感染特点，为更深入的流行病学研究提供理论基础。方法分别通过口腔接种、污染饲料、腹腔注射、皮肤损伤途径感染6—8周龄BALB／c小鼠，定期安乐动物采血及各器官组织进行血清学、病原学、病理学检查，记录抗体变化、病毒分离情况及病理学改变。结果各途径感染小鼠感染后出现竖毛、弓背、觅食减少、体重减轻、精神呆滞及神经系统症状，肺组织病毒分离及RT-PCR阳性，病理表现间质性肺炎。感染后第7d动物血清中可检测到H5N1抗体。结论通过口腔接种、污染饲料、腹腔注射及皮肤损伤多种途径感染BALB／c小鼠，均能发生感染，提示呼吸道以外的感染方式不容忽视，有益于人类更好的防控禽流感；可通过多种方式建模，深入研究禽流感的发病机制。     

波形蛋白对EV71感染小鼠脑组织引起NLRP3炎性小体活化的影响

目的观察肠道病毒71型（EV71）感染的小鼠中枢神经系统中波形蛋白（VIM）介导NLRP3炎性小体的活化。方法取3~ 5 d龄的VIM基因敲除型乳鼠（VIM-/-）40只,随机分为EV71感染实验组和空白对照组,20只/组,实验组每只腹腔注射浓度为1× 108半数组织培养感染剂量（TCID50）病毒液10 μL,空白组腹腔注射无菌PBS 10 μL,再将同品质的野生型乳鼠（WT）40只以同样 方式分组处理。观察小鼠感染状态1周,提取小鼠脑脊液（CSF）和脑组织全蛋白、RNA及组织切片,通过Western blot、ELISA、 RT-PCR检测小鼠中枢神经系统的炎症小体激活状况,以及免疫组化技术考察小鼠中枢神经系统的损伤。结果与空白组比 较,VIM-/-实验组小鼠在感染EV71 后CSF 和脑组织中NLRP3 炎症小体及其下游产物IL-1β、caspase-1 含量无明显变化;而 WT实验组小鼠相较VIM-/-型实验组的NLRP3、IL-1β和caspase-1含量显著升高（P<0.05）;同时WT型实验组IL-1β和caspase-1 的mRNA拷贝数亦明显高于VIM-/-型实验组小鼠（P<0.05）;VIM-/-感染EV71 的脑组织神经元受损程度较WT小鼠明显轻微 （P<0.05）。结论EV71通过感染小鼠脑组织诱发VIM基因介导的NLRP3炎症小体活化,释放IL-1β和caspase-1,这可能是中枢 神经系统炎症和神经元损伤的原因之一。     

肠道病毒71型特异性单克隆抗体的制备及其在病毒鉴定中的应用

目的：建立肠道病毒71型（ EV71）特异性检测的免疫荧光方法用于病毒分离培养后的EV71鉴定,为EV71生物学特征研究和疫苗株的筛选奠定基础。方法：以EV71 VP1为免疫原制备单克隆抗体,用经测序鉴定的肠道病毒毒株建立EV71特异性免疫荧光方法;将不同地区收集的手足口病患儿的临床标本进行病毒分离,利用EV71特异性单抗进行分离培养后的病毒鉴定。结果：制备获得2株单抗,经鉴定其中1株3 E12为EV71特异性单抗;以此单抗建立的免疫荧光方法对EV71感染细胞呈阳性反应,而与柯萨基病毒A16和埃可病毒6等非EV71肠道病毒不反应。从104份手足口病临床标本中共分离到35株病毒,产生肠道病毒典型的细胞病变;用3E12特异性单抗免疫荧光鉴定分离病毒,其中29株为EV71,与RT-PCR验证结果完全一致。结论：成功制备获得EV71特异性单克隆抗体,以此单抗建立的EV71特异性免疫荧光方法敏感性高、特异性强,可用于分离培养EV71的鉴定。