实时定量PCR检测小鼠脑组织miR-16家族表达

目的分析小鼠脑组织microRNA-16家族表达谱,为研究miR-16家族及其靶基因在中枢神经系统疾病中的作用提供参考.方法用RNAzol法提取C57BL/6小鼠脑组织总RNA,设计茎环反转录引物,利用半定量qRT-PCR技术对C57BL/6小鼠脑组织中miR-16家族的表达进行分析.结果检测了miR-16家族miRNA中miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195和miR-497在小鼠大脑组织中的表达,发现以小鼠脑组织中miR-15a的表达量作为标准,miR-16的表达水平最高,约为miR-15a表达量的32倍,而miR-195的表达量约为miR-15a表达量的9倍,其余miRNA表达水平均较低.结论本研究采用茎环实时定量RT-PCR法分析了小鼠脑组织中miR-16家族miRNA的表达谱,获得了该家族miRNA在小鼠大脑中的表达数据,将有助于研究中枢神经系统疾病中该家族miRNA的差异表达,并对其功能进行探讨.     

利用表达谱芯片数据筛选不同表达丰度的内参基因

目的 基于表达谱芯片的检测结果,筛选多个内参基因,用于小家鼠肝脏组织中具有不同表达丰度基因的定量检测。方法 应用表达谱芯片技术,完成小鼠肝脏组织的表达谱检测;依据基因表达丰度将基因分为3组,并进一步通过变异系数（coefficient of variation,CV）组内筛选候选内参基因;采用实时荧光定量PCR技术（real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR）和geNorm软件确定内参基因。结果 表达谱芯片成功采集超过60000个小鼠肝脏组织中转录本的表达量数据,并将之分为低、中、高3个组合。最终筛选了低表达Casp2和Lrrc14、中表达Nrd1和Trpc4ap、高表达Atp5a1和Clu,共6个内参基因。结论 基于表达谱芯片数据筛选的6个内参基因,可适用于qPCR技术准确定量小家鼠肝组织转录组中不同表达丰度基因的表达量。     

通过引物设计和提高退火温度提高实时定量PCR检测microRNA的特异性

目的：了解因某些microRNA (miRNA) 家族成员序列相似,以及同一种成熟miRNA的长度不均一对PCR定量检测结果的影响,寻找区分相似miRNA成员和准确定量的方法和条件。方法: 采用RNA加尾和引物延伸实时定量RT-PCR法,设计不同位置错配的引物,以克隆到质粒中的全长成熟miRNA为模板,比较在不同退火温度下各种错配引物与完全匹配引物在扩增miRNA上的效率差异,并根据由此得出的经验设计let-7家族成员引物,以克隆的成熟miRNA为模板,检测其在不同退火温度下区分相似家族成员的能力。此外,设计了10组3′末端碱基位置不同的特异引物,比较了它们在检测小鼠大脑miRNA表达水平上的差异。结果：提高退火温度12 ℃~14 ℃将最大限度增加特异性而不降低敏感性,将引物的3′ 末端置于差异碱基或其附近可以有效区分相似miRNA序列,将引物3′ 末端置于miRNA第18~20个碱基,可避免漏检较短的成熟miRNA,使定量更真实准确。结论：精心设计引物并提高退火温度可提高实时定量PCR检测microRNA的特异性和准确性。     

MicroRNAs在唐氏综合征模型小鼠海马中的异常表达

目的：寻找唐氏综合征模型鼠Ts65Dn和对照二倍体组小鼠海马组织中差异表达的microRNAs。方法：从小鼠的海马组织中提取小分子RNA,采用RNA加尾和引物延伸RT- PCR法检测microRNAs。通过geNorm软件和Normfinder软件分析选择最佳的内参照基因,将每种microRNAs按其引物Tm值排成阵列,用梯度实时PCR仪在不同的退火温度扩增,并计算每种相对于microRNAs内参照基因的表达量。结果： geNorm和Normfinder两种方法均选定miR-27a为最稳定的内参照基因,共检测了52种microRNAs,其中miR-33 和miR-19a在Ts65Dn小鼠海马组织中表达显著下调,miR-130在Ts65Dn小鼠海马组织中表达显著上调,小鼠16号染色体三体区段包含的miR-802在Ts65Dn小鼠和对照二倍体小鼠海马组织中表达量均低,差异没有统计学意义。结论：MicroRNAs在Ts65Dn小鼠海马组织中的异常表达可能与唐氏综合征脑发育不良有关。     

心脏发育相关的微小RNA差异表达

目的 探讨微小RNA(miRNA)在心脏发育中的作用.方法 建立先天性心脏病-室间隔缺损相关基因Pax-8敲除小鼠模型Pax-8 KO-/-(纯合子)及Pax-8 KO +/-(杂合子),提取纯合子和杂合子小鼠心脏总RNA,采用含有567种miRNA的芯片进行检测并分析miRNA表达谱的差异,并通过荧光实时定量PCR技术对结果进行验证.结果 纯合子小鼠比杂合子小鼠左心室腔扩大,左心室壁肥厚,室间隔增厚,左室乳头肌肥大,心脏呈球形.超声结果显示杂合子小鼠左室收缩末期内径(LVIDs)[(1.23±0.25)mm比(1.93±0.50)mm]和左室舒张末期内径(LVIDd)[(2.13±0.18)mm 比(2.89±0.29)]均明显小于纯合子小鼠,差异有统计学意义(均P<0.01)心肌左心室壁以及室间隔组织可见大量的凋亡心肌细胞.在纯合子小鼠发现miRNA表达谱中差异表达的miRNA共10个, 其中2个miRNA表达下调,8个miRNA表达上调.荧光实时定量RT-PCR结果与芯片结果基本符合.结论 miRNA参与心脏发育过程,在先天性心脏病室间隔缺损的发病机制中可能发挥重要作用.     

微小核糖核酸荧光定量聚合酶链反应检测方法的建立及其在急性肺损伤中的表达分析

目的探讨微小核糖核酸(miRNA)荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测方法的建立条件,并运用这一方法对急性肺损伤中miRNAs的表达进行分析。方法设计miRNA特异的颈环结构反转录引物,对miRNA进行反转录,得到miRNA的环状脱氧核糖核酸(cDNA)。分析miRNA cDNA定量PCR过程中的标准曲线和熔解曲线,确定该检测方法的检测灵敏性和特异性。应用miRNA的荧光定量PCR检测方法分析脂多糖(LPS)诱发的急性肺损伤小鼠中miRNA的表达。结果 miRNA特异的颈环结构反转录引物实现了miRNA长度的延长。通过对心肌特异表达的miRNA-1进行实时荧光定量PCR检测,表明miRNA-1是心肌组织特异表达的miRNA。通过该方法对LPS诱发的急性肺损伤小鼠(急性肺损伤组)进行分析,发现与对照组比较,急性肺损伤组的miRNA-23a的相对表达量显著降低(P<0.05),miRNA-155、miRNA-451的相对表达量显著升高(P值均<0.01),miRNA-21的相对表达量未发生改变(P>0.05)。结论本实验建立的miRNA实时荧光定量PCR具有较高的精确性和特异性,通过该方法发现多种miRNA在LPS...     

结直肠癌组织中miRNA的差异表达研究

目的：寻找并鉴定在结直肠癌及癌旁正常组织中差异表达的miRNA,为进一步阐明其在结直肠癌发生、发展机制中的作用奠定实验基础。方法：收集10例新鲜的结直肠癌及癌旁正常组织,抽提总RNA,利用miRNA芯片技术寻找结直肠癌及癌旁正常组织中差异表达的miRNA,并通过real-time PCR技术进行验证。结果：与结直肠癌旁正常组织相比,结直肠癌组织中上调2.3倍以上的miRNA有32个,下调2倍以上的miRNA有10个;real-time PCR结果与miRNA芯片结果较吻合。结论：筛选得到结直肠癌miRNA差异表达谱,其可能与结直肠癌的发生、发展相关。     

坐骨神经缺损1周背根神经节组织中microRNA的表达变化

目的：研究大鼠坐骨神经缺损后背根神经节中microRNA（miRNA）的表达变化。方法：采用miRNA芯片检测神经缺损0 d（对照组）和7 d（实验组）背根神经节组织中miRNA的表达情况,应用Real time Taqman PCR对芯片结果进行验证。结果：实验组与对照组比较发生上调1.4倍和下调〉1%以上的miRNA分别有13个和5个,Real time TaqmanPCR检测的4个miRNA的表达变化与芯片一致（上调：miR-21,miR-221;下调：miR-500,miR-551b）。结论：大鼠坐骨神经缺损1周后背根神经节组织中miRNA的表达谱发生改变。     

甲状腺乳头状癌microRNA差异表达谱分析

目的 建立甲状腺乳头状癌(PTC)microRNA(miRNA)的差异表达谱,为进一步探讨miRNA在甲状腺乳头状癌发生机制的作用提供依据.方法 收集12例PTC肿瘤组织和临近肿瘤未受侵袭的组织标本,临近肿瘤未受侵袭的组织标本作为正常对照,一半用于芯片检测,另一半用于荧光定量PCR检测.用Trizol法抽提组织标本总RNA,YM-100微离心滤器富集小RNA,含875个探针的miRHuman_13.0_091250 miRNA芯片检测PTC肿瘤组织标本和临近肿瘤未受侵袭组织标本miRNA的差异表达谱.利用TaqMan miRNA Assays定量PCR试剂盒,以U6 snRNA作为内标,对部分差异表达的miRNAs进行实时定量PCR检测.结果 部分miRNAs在PTC肿瘤中表达异常, miR-433、miR-221和miR-21在PTC肿瘤高表达,miR-138、miR-26a和miR-709在PTC肿瘤低表达.结论 部分miRNAs在PTC肿瘤和临近肿瘤未受侵袭组织中存在差异表达,可能参与了PTC发生的分子机制.     

早期糖尿病肾病相关微小RNA在小鼠肾脏的表达变化

目的 建立db/db小鼠早期糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)微小RNA(microRNA,miRNA)的差异表达谱.方法 采用12只9周龄高血糖且24 h尿白蛋白显著增高的db/db小鼠作为早期糖尿病肾病组,12只9周龄db/m小鼠作为正常对照组,用于miRNA芯片和实时荧光定量RT-PCR检测.Trizol法抽提肾脏总RNA,YM-100微离心滤器富集小RNA,芯片技术检测DN组和对照组miRNAs的差异表达谱.应用实时荧光定量RT-PCR验证部分差异miRNAs,运用生物信息学技术预测部分相关miRNAs的靶基因.结果 芯片结果显示,66个miRNA在DN组和对照组存在差异表达(P<0.01),其中35个miRNAs在DN组呈高表达,31个miRNAs在DN组呈低表达,差异倍数从1.08～10.20.实时荧光定量RT-PCR进一步验证部分miRNA的表达,结果显示3个miRNAs在DN组表达上调,分别为:miR-196a、miR-98和miR-29c;4个表达在DN组下调,分别为miR-21、miR-451、miR-709和miR-187,差异显著(P<0.01).结论 部分miRNAs在DN和正常对照肾脏组织中存在差异表达,可能参与了DN发生的分子机制.     

少突胶质细胞相关microRNA差异性调控大脑和小脑神经前体细胞的增殖

目的探讨少突胶质细胞相关microRNA(m iRNA)对中枢神经系统神经前体细胞增殖的作用。方法利用D icer1 loxp/loxp基因型小鼠和Olig1-Cre品系小鼠杂交获得miRNA加工酶Dicer基因条件性敲除小鼠,再用免疫荧光染色和B rdU标记等技术检测这种Dicer条件性敲除小鼠大脑和小脑中神经前体细胞的增殖,以及脊髓中新生神经元的变化情况。结果 Dicer条件性敲除小鼠大脑中神经前体细胞增殖加快,而小脑中增殖细胞数目较正常小鼠减少(12%,P<0.05)。此外脊髓中神经元的数目并未受到影响。结论少突胶质细胞相关m iRNA对中枢神经系统的胶质细胞的发生和增殖具有时空特异性或差异性调节作用。     

人脑脑回的侧别差异性

目的：研究观测两侧端脑脑回的侧别差异性，并探讨其与机能之间的联系。方法：取32例成人正常端脑标本，将其主要脑回区染以不同颜色。然后对其形状及面积进行观察、测量，并分析其结果。结果：额上回、额中回、额下回、舌回、楔叶、楔前叶、角回、缘上回及顶上小叶的面积是左侧大于右例，而颞上回、颞中回、颞下回及海马旁回的面积是右侧大于左侧；其它脑回两例面积无显著差异；两侧角回、缘上回和顶上小叶的形状不对称，其余脑回形状两侧是对称的；脑回具有相对固定的形状。结论：一些脑回面积存在侧别差异，少数脑回形状也存在显著侧别差异；其它脑回无侧别差异。     

兔供脑动脉的放射学研究及结扎后的行为观察

23只兔供脑动脉(11只未结扎,12只结扎)放射学脑动脉造影研究结果表明,兔供脑动脉同人供脑动脉有许多相似之处,但兔供脑动脉有许多交通循环,因此结扎后,兔行为影响不大,3～5日后恢复正常。     

人体组织microRNA表达谱数据库信息的分析

目的：利用数据库信息获取人体组织microRNAs（miRNAs）表达数据,通过对其系统分析获得有益信息,进而为深入研究特定miRNA的功能提供新思路。方法：从miRNAs表达谱数据库获取人体多种组织miRNAs表达信息,按表达丰度、表达非特异性和特异性等对miRNAs表达谱进行分析;选择表达丰度大于0.004的miRNAs作为分析对象,并将在多种组织中均表达者定义为非特异性表达,而在单一组织中表达者则定义为特异性表达。结果：发现人体各种组织中miRNAs的表达谱存在明显差异,提示miR-122和miR-7两种miRNAs可能分别在肝脏和垂体中具有重要生理功能。结论：通过对人体miRNAs表达谱数据库资源的综合分析,有助于全面了解和掌握miRNAs在人体各种组织中的表达信息,并能为关键性miRNAs分子的筛选提供指导。     

PRL促进乳腺癌细胞增殖及与microRNA表达谱变化的相关性研究

目的:探讨基于催乳素(prolactin,PRL)反应的人乳腺癌细胞microRNA (miRNA)表达谱变化,以了解其在乳腺癌发生和发展中的潜在作用?方法:人重组PRL处理高表达催乳素受体(PRLR)的人乳腺癌T-47D细胞系,MTT法检测细胞增殖能力变化,流式细胞术检测细胞周期和凋亡变化情况?利用Solexa高通量测序技术检测PRL处理组和未处理组的T-47D细胞 miRNAs表达谱,荧光定量PCR法进行初步验证,同时进行相关的生物信息学分析?结果:PRL作用于T-47D细胞后,MTT结果显示细胞增殖能力增强,细胞周期检测结果表明PRL处理后,G1期的细胞比例减少,S期的细胞比例升高,而G2/M期没有变化?细胞凋亡分析结果则显示PRL可抑制细胞凋亡,导致细胞凋亡率下降?通过Solexa高通量测序技术成功检测了PRL处理和未处理组的人乳腺癌T-47D细胞miRNA表达谱,两组中分别检测到821个和798个miRNAs成熟体,其中428个共表达,42个为两组间明显差异表达?选取的4个miRNAs分子经荧光定量PCR法证实其细胞内的表达与测序结果一致?两组miRNA表达谱中同时也检测到86个和115个novel miRNAs 成熟体,其中46个novel miRNAs在两组细胞中共表达?结论:在初期实验明确PRL对人乳腺癌T-47D细胞产生促增殖作用的基础上,利用Solexa高通量测序技术检测两类T-47D细胞miRNAs表达谱,获得了一系列与PRLR信号通路高度相关的miRNAs分子,为进一步研究miRNAs分子在人乳腺癌发生发展中的作用奠定重要的研究基础?     

RNA加尾和引物延伸RT-PCR法实时定量检测microRNA

目的:用改进的RNA加尾和引物延伸RT-PCR法实时定量检测组织中的microRNAs(miRNAs),并评价其敏感性和特异性.方法:提取组织中的小于200 bp的RNA,用poly(A)聚合酶在其3'末端加尾,再用5'带40 nt延伸序列的单碱基锚定Olig-dT引物进行反转录,得到约80 nt的cDNA,然后用特异引物进行SYBR Green实时定量PCR扩增.结果:该法线性范围宽,可检测低丰度的miRNAs,能特异区分3'末端碱基不同的亚型,但对序列中间个别碱基不同的亚型不能鉴别.对15种miRNA在大鼠心、肝和大脑皮层的相对表达的检测验证了该法的可靠性.另外,海马组织中的miRNAs表达与大脑皮层组织有一定差异.熔解曲线的单一峰型和电泳检测到的单一条带都证明了扩增的特异性.结论:该法可快速、敏感地检测不同组织中大多数miRNAs的表达差异,可用于寻找组织特异及疾病相关的miRNAs.     

胆固醇和蔗糖负荷对家兔脑组织脂质变化指标的研究

目的：了解胆固醇和蔗糖负荷对脑组织脂质及其脂质过氧化物产生的影响变化。方法：采用薄层层板法测定胆固醇和蔗糖两种负荷后家兔血浆、主动脉及脑组织脂质的百分比含量。结果：与对照组相比，胆固醇组脑组织中胆固醇酯（ＣＥ）和胆固醇酯过氧化物（ＳｐｏｔＸ）百分比明显增加，蔗糖组脑组织中的中性脂肪（ＴＧ）百分比含量也明显增加。胆固醇组血浆低密度脂蛋白（ＬＤＬ）、主动脉ＬＤＬ以及脑组织脂质三者ＣＥ／ＴＧ的比率经周动态变化极为相似。结论：可用血浆ＬＤＬ中ＣＥ／ＴＧ比率的变化来推测脑组织脂质代谢以及脑动脉硬化的形成和恢复情况。     

川芎嗪对青霉素致痫大鼠神经元内c-fos表达的影响

目的:用免疫组织化学方法观察川芎嗪（TM）对青霉素致痫大鼠大脑皮层神经元内c-fos表达的影响。方法:使用青霉素癫痫模型,采用BL-410生物机能实验系统记录双侧大脑皮层癫痫放电,观察腹腔注射TMP对大鼠癫痫放电大脑皮层神经元内c-fos表达的影响。结果:腹腔注射TMP（20-40mg/kg）后,大脑皮层神经元内c-fos表达较对照组明显降低。结论:TMP能明显抑制c-fos的表达,具有抗癫痫放电作用。     

持续ALT正常的慢性乙型肝炎患者外泌体miRNAs表达谱

目的：通过分析持续丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)正常的慢性乙型肝炎(以下简称慢乙 肝)患者外泌体miRNAs的表达情况,试图找出更好反映肝组织炎症的外泌体miRNAs。方法：收集持续ALT正常并行 肝活检的慢乙肝患者,选取肝组织炎症分级≥A2和相似文献