帕金森病细胞模型的建立及鱼藤酮对多巴胺能神经元的毒性作用

目的：建立帕金森病细胞模型,研究鱼藤酮对多巴胺能神经元的毒性作用及机制。方法：PC12细胞诱导分化成多巴胺能神经元,加入不同浓度鱼藤酮（0、10、25、50、75和100 nmol•L^-1）,观察细胞形态改变;鱼藤酮处理PC12细胞24、48和72 h,MTT法检测细胞活性;免疫组化和免疫荧光法观察α-synuclein 在胞内聚集情况;AO/EB双染检测细胞凋亡。结果：神经生长因子（NGF）诱导后PC12细胞形状不规则,突起增多变长,细胞间连接增多;染毒后细胞突起结构逐渐消失,细胞体积变小、形态变圆。50 nmol•L^-1鱼藤酮作用24 h后PC12细胞活力开始低于对照组（P<0.05）,随着浓度增大,细胞活力进一步下降,呈浓度依赖性（P<0.01）;随着作用时间延长,细胞活力亦逐渐下降,不同时间组间比较差异有显著性(P<0.01)。免疫组化结果显示,胞浆中出现棕色的类圆形α-synuclein染色阳性颗粒;免疫荧光显示,胞浆中有α-synuclein标记的强绿色荧光的蛋白聚集。染毒细胞逐渐呈现出早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞状态。结论：鱼藤酮对多巴胺能神经元有毒性作用,可形成类包涵体样蛋白聚集并诱导细胞凋亡。α-synuclein 代谢异常及细胞凋亡可能在鱼藤酮所致的帕金森病发病机制中发挥重要作用。     

多巴胺对鱼藤酮诱导α-突触核蛋白聚集的促进作用

目的:探讨多巴胺能细胞内多巴胺在鱼藤酮诱导α-突触核蛋白聚集过程中的作用。方法:采用鱼藤酮(1μmol/L)处理PC12细胞,流式细胞术检测双氢罗丹明123荧光强度;Western印迹法检测胞质内α-突触核蛋白表达;免疫荧光法观察α-突触核蛋白聚集体。并采用多巴胺耗竭剂——利血平预处理3h,观察上述指标。结果:鱼藤酮处理24h后,PC12细胞内过氧化物水平显著升高,而利血平(1μmol/L和5μmol/L)预处理后,细胞内过氧化物水平较鱼藤酮组显著下降(P<0.05)。鱼藤酮处理后,α-突触核蛋白表达水平显著升高,胞质内可见α-突触核蛋白免疫阳性的聚集体形成;采用利血平预处理后,α-突触核蛋白表达水平较鱼藤酮组显著下降(P<0.05),α-突触核蛋白聚集体面积减小。结论:在鱼藤酮作用过程中,多巴胺可促进α-突触核蛋白表达上调及其聚集体的形成。     

姜黄素对鱼藤酮诱导的黑质多巴胺能神经元损伤的保护作用

目的 观察姜黄素对由鱼藤酮诱导的慢性帕金森病大鼠模型黑质多巴胺能神经元损伤的保护作用并探讨其可能机制。方法 2014年12月-2015年5月,选取清洁级雄性SD大鼠80只按随机区组法分为溶剂对照组、姜黄素组、鱼藤酮组、治疗组,每组20只。采用脑切片免疫组化染色法检测大鼠脑黑质区酪氨酸羟化酶（TH）阳性细胞数,Western blotting法检测大鼠脑黑质区沉默信息调节因子3（SIRT3）、P47phox表达水平,流式细胞仪检测大鼠脑黑质区活性氧（ROS）水平。结果 4组大鼠脑黑质区TH阳性细胞数比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。鱼藤酮组大鼠脑黑质区TH阳性细胞数低于溶剂对照组、姜黄素组（P＜0.05）;治疗组大鼠脑黑质区TH阳性细胞数低于溶剂对照组、姜黄素组,高于鱼藤酮组（P＜0.05）。4组大鼠脑黑质区SIRT3、P47phox表达水平比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。鱼藤酮组脑黑质区SIRT3表达水平低于溶剂对照组、姜黄素组（P＜0.05）;治疗组脑黑质区SIRT3表达水平低于溶剂对照组、姜黄素组,高于鱼藤酮组（P＜0.05）。鱼藤酮组脑黑质区P47phox表达水平高于溶剂对照组、姜黄素组（P＜0.05）;治疗组脑黑质区P47phox表达水平高于溶剂对照组、姜黄素组,低于鱼藤酮组（P＜0.05）。4组大鼠脑黑质区ROS水平比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。鱼藤酮组大鼠脑黑质区ROS水平高于溶剂对照组、姜黄素组（P＜0.05）;治疗组大鼠脑黑质区ROS水平高于溶剂对照组、姜黄素组,低于鱼藤酮组（P＜0.05）。结论 姜黄素可有效拮抗鱼藤酮诱导的慢性帕金森病大鼠多巴胺能神经元损伤,其机制可能与姜黄素通过促进SIRT3的表达清除小胶质细胞源性ROS有关。     

不同剂量鱼藤酮对拟帕金森病模型大鼠行为学及纹状体多巴胺

目的 观察不同剂量鱼藤酮皮下注射对大鼠行为学及脑纹状体多巴胺含量的影响,探讨鱼藤酮拟帕金森病大鼠模型的适宜造模条件.方法 Lewis大鼠分别给予鱼藤酮不同剂量(1.0、1.5和2.0 mg/kg/d)皮下注射共28 d.应用旷场实验和斜板实验分别测定大鼠的运动功能和协调性,高效液相色谱-电化学法检测大鼠纹状体内多巴胺含量.结果 模型组大鼠存活率随鱼藤酮注射剂量的升高呈逐渐下降趋势.鱼藤酮2.0 mg/kg组大鼠体重最先明显降低,随着注射时间的延长,各模型组大鼠均出现显著的体重降低.旷场实验结果显示,各剂量鱼藤酮组大鼠跨格次数和站立次数均明显下降.斜板实验结果显示,鱼藤酮1.5 mg/kg组大鼠在斜板的停留角度较对照组显著减小.鱼藤酮1.5 mg/kg组大鼠脑纹状体内多巴胺含量显著降低.结论 鱼藤酮1.5 mg/kg皮下注射28 d,大鼠出现明显的运动功能障碍和脑内多巴胺含量减少,而死亡率相对较低,因此是建立帕金森病大鼠模型的适宜剂量.     

蛋白酶体抑制剂对小鼠黑质多巴胺神经元的毒性作用

目的:观察蛋白酶体抑制剂对小鼠黑质多巴胺神经元的毒性作用.方法:8周龄C57BL/6小鼠随机分组:磷酸盐缓冲液(PBS组)和lactacystin组,二种制剂分别单侧立体定向注射于中脑前脑束(Middle forebrain bundle);12周龄时灌注取脑分离纹状体,采用HPLC法测多巴胺、5-HT及代谢产物,取中脑观察黑质区多巴胺能神经元变性及包涵体样物质形成情况.结果:Lactacystin组同侧黑质区多巴胺细胞数减少51%,并可见泛素染色阳性的类包涵体样物质形成,同侧纹状体多巴胺(DA)及其代谢产物二羟苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)浓度分别减少52%、46%和51%,而5-羟色胺(5-HT)及5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)浓度无改变.结论:蛋白酶体抑制剂可引起选择性黑质区多巴胺能神经元变性,并可能导致细胞内异常蛋白质聚集.     

松果菊苷对鱼藤酮诱导的大鼠帕金森病模型黑质多巴胺能神经元的选择性保护作用（英文）

目的：观察鱼藤酮对大鼠中脑纹状体多巴胺能神经系统、肝、肾等组织的损伤及松果菊苷的干预作用。方法：雄性健康Sprague-Dawley大鼠被随机分为对照组,模型组和低、中、高剂量松果菊苷干预组。运用鱼藤酮2.75mg/（kg·d）腹腔注射4周的方法制作大鼠帕金森病模型;对照组腹腔每日注射同等体积不含鱼藤酮的溶解液;干预组除注射鱼藤酮外,分别给予松果菊苷20、40、80mg/（kg·d）灌胃处理。运用改良神经功能缺损评分（modified neurological severity score,mNSS）测量大鼠的神经行为改变,采用试剂盒检测其肝、肾损伤的指标,酪氨酸羟化酶免疫染色观察中脑黑质多巴胺能神经元的数目,比色法测定纹状体多巴胺的含量。结果：与正常对照组比较,鱼藤酮模型组肝、肾损伤的指标明显上升（P〈0.05）,mNSS升高（P〈0.01）,黑质多巴胺能神经元数目显著减少（P〈0.05）,纹状体多巴胺含量降低（P〈0.05）;与模型组相比,松果菊苷低、中、高剂量组肝、肾功能没有显著改善（P〉0.05）,但mNSS显著降低（P〈0.05）,黑质多巴胺能神经元数增加（P〈0.05）,纹状体多巴胺含量也增加（P〈0.05）,以上保护效应呈现剂量依赖性。结论：鱼藤酮能引起大鼠严重的黑质-纹状体多巴胺能神经系统以及肝、肾等组织的损伤,松果菊苷可以选择性地改善其神经损伤。     

脑黑质单侧注射鱼藤酮制备帕金森小鼠模型方法探讨

目的探讨应用鱼藤酮建立帕金森病小鼠模型的方法。方法取30只清洁级国立卫生研究院(NIH)小鼠,随机分为正常组、溶媒组和实验组,每组10只。实验组采用立体定向微量注射法,将溶解于二甲基亚砜(DMSO)的鱼藤酮注射入小鼠脑右侧黑质致密区;溶媒组以同样的方法仅注射相同体积的DMSO,正常组不做任何处理。观察3组小鼠的行为变化,并采用免疫组织化学法分析黑质酪氨酸羟化酶(TH)水平。结果建模前,3组小鼠体质量、爬杆实验得分、悬挂实验得分、水平和垂直自由活动得分比较差异均无统计学意义(P>0.05)。建模后,3组小鼠体质量均高于建模前(P<0.05);实验组小鼠体质量明显低于对照组和溶媒组(P<0.05);对照组和溶媒组小鼠体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)。建模后,正常组和溶媒组小鼠爬杆实验得分、悬挂实验得分、水平和垂直自由活动得分与建模前比较差异均无统计学意义(P>0.05);实验组小鼠爬杆实验得分、悬挂实验得分、水平和垂直自由活动得分较建模前、正常组和溶媒组建模后明显下降(P<0.05)。建模后,正常组和溶媒组小鼠两侧脑黑质中TH阳性神经元数量比较差异无统计学意义(P>0.05);实验组小鼠右侧脑黑质中TH阳性神经元数量低于左侧(P<0.05)。3组小鼠左侧阳性神经元数量比较差异均无统计学意义(P>0.05);实验组右侧阳性神经元数量低于正常组和溶媒组(P<0.05)。结论鱼藤酮能选择性损毁黑质多巴胺能神经元,可较快建立稳定的、成功率较高的帕金森模型。     

Ghrelin拮抗鱼藤酮诱导的多巴胺能细胞凋亡的机制研究

【目的】 帕金森病(PD)是常见的神经退行性疾病之一,遗传和环境因素均可导致PD的发生,但90%的PD为散发性。由于病因不明,临床上的治疗多为对症治疗,且药物治疗的副作用大,因此,寻找新的预防和治疗PD的生物活性物质具有重要的临床意义。Ghrelin是1999年发现的由28个氨基酸残基组成的脑肠肽,对其研究集中在摄食和能量代谢的调控上,近年来发现Ghrelin对下丘脑神经元具有保护作用,为了探讨Ghrelin对多巴胺(DA)能神经元的作用,本实验拟在环境毒素鱼藤酮制备的PD细胞模型上,观察其对DA能细胞损伤的保护作用,并深入探讨其机制。 【方法】 本实验选用的DA能细胞是MES23.5细胞,具有DA能神经元的主要特点。实验分为三组:对照组,鱼藤酮处理组(500 nmol/L鱼藤酮孵育24 h),Ghrelin+鱼藤酮处理组(10^-9 mol/L的Ghrelin预孵育20 min后,加入500 nmol/L鱼藤酮共同孵育24 h)。应用MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测线粒体跨膜电位差和caspase-3活性,酶活性检测技术测定线粒体呼吸链复合物I的活性,蛋白质印迹法检测线粒体细胞色素C的释放,Hoechst染色观察细胞凋亡的形态学变化。 【结果】 鱼藤酮处理24 h后,细胞存活率降低39%(P<0.01)。而Ghrelin预孵育20 min,能显著拮抗鱼藤酮所致的细胞存活率的降低(P<0.01)。Ghrelin能够拮抗鱼藤酮导致的线粒体呼吸链复合物I活性的降低和跨膜电位差的降低,并进一步抑制鱼藤酮诱发的细胞色素 C由线粒体的释放。我们还观察了凋亡效应酶caspase-3活性的变化,在鱼藤酮处理组,细胞caspase-3的活性较对照组显著增加(P<0.01),而Ghrelin预孵育后,细胞caspase-3的活性较鱼藤酮组明显降低(P<0.05)。鱼藤酮孵育后,细胞出现明显的核碎裂与核固缩现象,而Ghrelin预处理后上述现象明显减轻。 【结论】 环境毒素鱼藤酮能够通过抑制DA能细胞线粒体呼吸链复合物I的活性,从而导致其功能的损伤,引起线粒体跨膜电位差的降低和细胞色素C的释放,并进一步诱发细胞的凋亡,而Ghrelin能够通过作用于线粒体呼吸链复合物I,从而恢复线粒体功能,抑制细胞凋亡,发挥其保护作用,但其细胞内的信号转导过程尚需进一步探讨。     

鱼藤酮毒性及含量测定方法研究进展

鱼藤酮是一种线粒体复合体Ⅰ抑制剂,近年来被用于制备帕金森病动物模型。本文对其急性毒性进行综述,并重点介绍鱼藤酮生物样品的前处理和高效液相色谱法测定其含量的方法,将有益于鱼藤酮毒性与血药浓度关系的探讨。     

利血平对转染VMAT2基因的CHO细胞抵抗鱼藤酮及多巴胺毒性作用的研究

目的研究单胺囊泡转运蛋白 2（VMAT2）抑制剂利血平（RE）作用于转染VMAT2基因的中国仓鼠卵巢细胞（VMAT2 CHO）时,VMAT2 CHO对鱼藤酮（Rotenone）、多巴胺（DA）的毒性抵抗作用。方法采用MTT比色法检测RE与不同浓度Rotenone及DA共同作用下的VMAT2 CHO细胞存活率;采用流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）水平。结果Rotenone对VMAT2 CHO细胞有毒性作用,随浓度增大,细胞存活率下降;Rotenone和DA对细胞有协同毒性作用。随DA浓度增大,VMAT2 CHO细胞产生的ROS增加;VMAT2抑制剂利血平增加DA的毒性,使同样浓度的DA诱发VMAT2 CHO细胞产生的ROS增加,存活率下降。结论RE使VMAT2功能抑制时DA在胞浆内聚集,触发DA内源性毒性,通过氧化应激系统而发挥毒性作用。DA内源性毒性可协同环境毒物Rotenone增加对细胞的毒性作用。     

COX-2对帕金森病小鼠黑质内多巴胺能神经元的毒性作用

目的:观察环氧合酶-2(COX-2)对帕金森病(PD)模型小鼠黑质内多巴胺(DA)能神经元的损害作用.方法:采用Lau法制作PD小鼠模型,通过行为学观察,免疫组织化学和免疫蛋白印记法,观察PD小鼠模型的行为学表现,黑质致密部COX-2免疫反应阳性细胞,DA能神经元数量和腹侧中脑(包括VTA和SN)COX-2,酪氨酸羟化酶(TH)表达水平的变化,并观察给予COX-2抑制剂后对上述变化的影响.结果:与对照组小鼠相比,PD组小鼠出现PD典型的行为学表现,黑质致密部DA能神经元和腹侧中脑TH含量分别下降约63%和77%.同时,黑质致密部COX-2阳性细胞和腹侧中脑COX-2含量有大幅升高.经COX-2抑制剂处理的PD小鼠行为表现较轻,黑质致密部DA能神经元和腹侧中脑TH含量仅下降约37%和41%.与单纯PD小鼠比较,黑质致密部COX-2阳性细胞和腹侧中脑COX-2含量明显下降.结论:COX-2对PD模型小鼠黑质内DA能神经元有毒性作用.     

Neurotoxic effect of rotenone on dopaminergic neuron PC12 in vitro

Objective： To investigate the mechanism of oxidative stress in rotenone neurotoxicity to dopaminergic neuron PC12. Methods： High differentiated PC12 cells as dopaminergic neurons were treated by different concentrations of rotenone. The morphology was observed with inverted phase contrast microscope and transmission electron microscope. Cell viability and proliferation inhibition were assessed by MTT. SOD and MDA were detected with biochemical assay. And the specific fluorescent probe （DCF-DA） was used to examine ROS in PC12 cells. Results： After treated with rotenone for 24 h, most of the PC12 cells became smaller and rounder. The process of axon was reduced, shortened or broken in a time and concentration dependent manner. The mitochondrial structure and metabolism were changed. Endoplasmic reticulum expanded and the free ribosome increased. Compared with the control group, cell proliferation inhibition increased and cell viability decreased. SOD increased and MDA decreased. The intensity of fluorescence was more obvious in PC12 cells treated by rotenone compared with control group. Conclusion： Rotenone is neurotoxic to cultured dopaminergic neuron PC12. Rotenone might exert this effect through the metabolism of oxidative stress on the pathogenesis of the neuron.     

依达拉奉对帕金森病模型小鼠多巴胺能神经元的保护作用

目的探讨依达拉奉(edaravone)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的C57BL/6J帕金森病模型小鼠的保护作用及相关机制。方法 90只雄性C57BL/6J小鼠随机分为依达拉奉组(ED组)、帕金森病模型组(PD组)和生理盐水对照组(NS组),每组30只。ED组和PD组小鼠给予皮下注射MPTP建立PD模型后,ED组给予依达拉奉(3mg/kg)治疗。用滚轴实验检测小鼠的旋转次数,用免疫组织化学实验检测小鼠黑质酪氨酸羟化酶(TH)的表达,用RT-PCR和免疫印迹实验分别检测小鼠黑质脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA与蛋白的表达。结果与NS组比较,ED组、PD组小鼠在滚轴实验中的旋转次数下降(P<0.05,P<0.01),黑质TH表达减少(P<0.05,P<0.01),黑质BDNF的mRNA(P均<0.01)和蛋白(P均<0.05)表达降低;与PD组比较,ED组小鼠在滚轴实验中的旋转次数增加(P<0.05),黑质TH表达增加(P<0.05),黑质BDNF的mRNA(P<0.01)和蛋白(P<0.05)表达升高。结论依达拉奉可增加C57BL/6JPD模型小鼠黑质区BDNF的mRNA及蛋白表达,降低MPTP对小鼠黑质的损伤,对多巴胺能神经元有保护作用。     

鱼藤酮对PC12细胞线粒体膜电位及细胞周期的影响

目的观察鱼藤酮对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(pheochromocytoma, PC12细胞)线粒体膜电位及细胞周期的影响,探讨鱼藤酮对多巴胺神经元的损伤机制.方法用流式细胞仪检测PC12细胞线粒体膜电位及细胞周期.结果 5.0 μmol/L鱼藤酮作用于PC12细胞12 h及24 h后,G0/G1期及S期细胞所占比例逐渐下降(P<0.01),而G2/M期细胞比例逐渐升高(P<0.01).单纯鱼藤酮中毒12 h线粒体膜电位即降低.结论大剂量(5.0 μmol/L)鱼藤酮引起线粒体膜电位降低及细胞周期改变,可能导致PC12细胞生长障碍.     

FGF21对鱼藤酮导致神经细胞损伤的作用及其机制

采用鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞损伤建立帕金森病样病变细胞模型,探讨成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)对其作用及机制。以不同浓度的FGF21对鱼藤酮诱导的神经细胞损伤模型进行干预,MTT法检测神经细胞活性;采用Annexin V-FITC/PI双染法分析神经细胞凋亡情况;Western blot检测FGF21及鱼藤酮对神经细胞酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)表达的影响;采用DCFH-DA荧光探针检测FGF21及鱼藤酮对神经细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的作用。结果显示:FGF21能够减少鱼藤酮致神经细胞的损伤,抑制神经细胞凋亡,缓解鱼藤酮引起的神经细胞TH和α-syn水平的异常,同时降低神经细胞内异常ROS水平,提示FGF21可能通过调控氧化应激进而缓解鱼藤酮导致的神经细胞损伤。     

人参皂苷Rg1对多巴胺能神经元的保护作用及ICI182,780的阻断作用

目的研究人参皂苷Rg1对去卵巢（ovariectomized,OVX）帕金森病（Parkinson disease,PD）模型大鼠黑质（substantianigra,SN）酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）表达的影响以及ICI182,780的阻断作用。方法雌性Wistar大鼠随机分为正常组、OVX组、6-hydroxydopamine（6-OHDA）组、Rg1＋6-OHDA组及ICI＋Rg1＋6-OHDA组。大鼠OVX后应用6-OHDA单侧损毁内侧前脑束（medial forebrain bundle,MFB）制备PD模型,腹腔注射Rg1或侧脑室同时给予雌激素受体（estro-gen receptor,ER）拮抗剂ICI182,780,免疫组织化学技术检测TH阳性神经元,RT-PCR技术检测SN内TH基因的表达。结果OVX大鼠SN内TH基因的表达较正常大鼠明显降低（P〈0.05）。6-OHDA制备的PD模型组损毁侧SN内TH阳性神经元数量及TH基因表达较健侧明显降低（P〈0.01）。与模型组相比,Rg1可显著提高损毁侧大鼠SN内TH阳性神经元数量及TH基因的表达（P〈0.01）。此效应可以被ER拮抗剂ICI182,780完全阻断（P〈0.01）。结论ER拮抗剂ICI182,780可以阻断人参皂苷Rg1对OVX PD模型大鼠黑质多巴胺能神经元的保护作用。