抑制NGF表达的pSUPER-H1 RNAi系统的构建

目的 构建抑制神经生长因子活性的siRNA表达载体。方法构建含有PolⅢ H1启动子的pSUPER-H1质粒，化学合成2对编码短发夹RNA的寡核苷酸序列，各64个碱基。退火、克隆到经BgiⅡ、HindⅢ酶切处理的pSUPER-H1质粒PolⅢ H1启动子下游，获得重组pSUPER-H1质粒。转化感受态大肠杆菌．挑选阳性克隆，抽取重组质粒，EcoRⅠ、Hind Ⅲ双酶切电泳、测序鉴定。结果重组pSUPER-H1质粒成功转化感受态大肠杆菌。经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切琼脂糖凝胶电泳分析，表明64个碱基的寡核苷酸成功插入到预计位点，经测序鉴定，表明序列完全一致。结论重组pSUPER-H1载体的成功构建，为进一步研究神经生长因子活性打下基础。同时开展了质粒介导在体内表达siRNA的方法。     

用于抗HBV RNAi重组质粒的构建

目的构建针对乙型肝炎病毒表面抗原和核心抗原的siRNA表达载体pSuper-HBV,以用于后继的RNAi研究.方法根据RNA作用原理设计,针对HBV S/C区的相应序列,再将其克隆入含聚合酶Ⅲ H1-RNA启动子的表达载体pSuper.结果经酶切鉴定、电泳和测序分析证明,含作用序列的重组质粒pSuper-HBVs/pSuper-HBVc及随机序列对照组pSuper-HBVcontrol构建是成功的.结论用于抗HBV RNAi的重组质粒可于体外成功构建,但仍需进一步实验来确定最佳作用靶点.     

抑制Smad3的pSUPER RNAi系统的构建和活性鉴定

目的:构建抑制Smad3的shRNA表达载体.方法:化学合成2段编码短发夹RNA序列的、靶向Smad3的寡核苷酸,各64个碱基,退火,克隆到经BgL Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切同时经牛小肠碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,CIP)处理后的pSUPER载体的poly Ⅲ H1启动子的下游,重组构建RNA干扰(RNA induced interference,RNAi)质粒,同时设立错义寡核苷酸作为非特异性对照.并将所构建的pSUPER Smad3转染到人类肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cells,HKC),检测其抑制效果.结果:重组构建的pSUPER Smad3载体经双酶切电泳分析及插入基因片段序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致.体外活性鉴定表明其能成功地抑制Smad3的基因和蛋白表达,却不影响Smad2的表达.结论:载体成功构建,其在体外抑制效率高,且特异性好.     

针对PKM2多位点RNAi质粒载体的构建和筛选

目的：构建针对M2型丙酮酸激酶（PKM2）基因3个可干扰序列设计小发夹RNA（small hairpin RNA,shRNA）载体,为下一步探索Ad-PKM2介导PKM2 RNAi对乳腺癌细胞作用及机制建立基础。方法：根据RNAi设计软件设计并合成3对shRNA模板序列,依次将它们克隆至pGenesil载体中构建重组质粒,通过MTT检测筛选出对乳腺癌细胞株MCF-7增殖效应影响最强的RNAi序列。结果：酶切鉴定和测序结果证实RNAi载体构建成功,均能高效感染MCF-7并抑制MCF-7细胞的增殖,pGenesil-PKM2-（1＋2＋3）的抑制能力最强。结论：针对PKM2多靶点RNAi载体成功构建,为下一步研究PKM2被沉默后细胞生物学行为的变化打下基础。     

FGL2基因RNAi慢病毒载体的构建及外源性筛选与鉴定

目的拟构建人纤维蛋白原样蛋白2(FGL2)凝血酶原酶基因RNA干扰慢病毒载体,为调控人FGL2凝血酶原酶表达水平提供有利的工具。方法根据人FGL2凝血酶原酶基因的mRNA序列选择4条靶序列,设计合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生FGL2慢病毒载体,采用PCR及测序鉴定,应用Western blot技术外源性筛选干扰效率高的有效靶序列。用慢病毒包装系统pGCSIL-GFP、pHelper1.0和pHelper2.0共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以系列稀释法测定病毒滴度。结果 PCR扩增和测序结果显示,人FGL2凝血酶原酶核苷酸链序列插入正确,外源性筛选确定一条干扰效率高的有效靶序列。利用筛选确定的有效靶序列,包装产生慢病毒,其浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/ml。结论证实实验成功构建了FGL2基因RNA干扰慢病毒载体。     

PCBP1 RNAi重组慢病毒包装及筛选其稳定感染的神经细胞系

目的 PCBP1是真核细胞内的一种桥梁蛋白,具有多种生物学功能。本研究以慢病毒质粒构建PCBP1基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体,并筛选其稳定感染的神经细胞系,为进一步通过该载体系统探讨PCBP1的具体功能提供有力手段。方法设计合成针对人及小鼠的PCBP1基因的siRNA茎环结构的正反义序列,退火形成双链,与pLenti-Lox3.7载体的双酶切产物连接,以质粒PCR、酶切和DNA测序等方法,对重组克隆进行鉴定以确认目的片段的插入。之后,采用脂质体转染,将慢病毒载体系统的核心载体pLentiLox3.7和包装质粒共转染293T细胞,收获病毒颗粒,分别感染SH-SY5Y细胞,再通过流式分选获得感染不同病毒颗粒的细胞,提取RNA检测PCBP1 mRNA水平。结果检测结果显示PCBP1 siRNA茎环结构序列正确插入pLentiLox3.7载体,并且成功构建PCBP1基因敲低的神经细胞系。结论 PCBP1基因siRNA表达载体及其基因敲低稳定细胞系的成功构建,为进一步研究该基因在相应细胞中的功能奠定了基础。     

Dnd1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建小鼠Dnd1基因的RNAi慢病毒载体.方法:针对小鼠Dnd1基因RNAi设计有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA.退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.结果:PCR鉴定与DNA测序证实合成的舍Dnd1...     

人SET基因RNA干扰重组质粒载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的建立真核质粒载体介导的人SET基因RNA干扰表达体系,并检测其在肝细胞中对SET蛋白表达的影响,为研究SET蛋白在三氯乙烯致肝细胞毒性的作用打下基础。方法设计并合成2对人SET基因特异性短发夹RNA(short hair-pin RNA,shRNA)寡核苷酸链,退火形成双链DNA后插入到真核表达质粒psiRNA-hH1 neo中产生shRNA重组质粒载体,经酶切和测序鉴定成功后,转染至L-02肝细胞中,48h后收集细胞提取总蛋白,Western blotting检测干扰后SET蛋白的表达。结果 shRNA重组质粒的酶切和测序鉴定均正确,Western blotting结果显示重组质粒psiRNA1组的干扰效果较好,对SET蛋白表达的抑制率达60%左右,与正常对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建针对人SET基因的RNA干扰真核质粒载体,其能有效地抑制肝细胞内SET蛋白的表达,为深入研究SET蛋白在三氯乙烯致肝细胞毒性中的作用奠定了基础。     

大鼠Pik3cb shRNA质粒的构建及鉴定

目的构建大鼠Pik3cb短发卡状RNA(shRNA)真核表达载体,为利用RNA干扰技术(RNA interference,RNAi)从转录后水平抑制移植术后血管再狭窄的研究做准备。方法根据大鼠Pik3cb mRNA序列设计6条并经预实验挑选出2条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-1,进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计的相同,获得大鼠Pik3cb shRNA表达载体质粒。结论成功构建了2条大鼠Pik3cb shRNA真核表达载体,为靶向Pik3cb的RNAi防治血管再狭窄奠定了基础。     

多药耐药基因RNAi重组腺病毒构建

目的 构建抑制多药耐药基因(MDR1)表达的RNAi腺病毒载体,探讨基因治疗改善癫痫多重耐药现象的可行性.方法 根据大鼠MDR1基因序列,选择3个19nt的靶序列,设计并合成3对66nt含编码短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸,构建pSIREN-shuttle-MDR1重组质粒,测序分析正确后转染通过马桑内酯诱导的已表达多重耐药蛋白的大鼠星形胶质细胞,通过RT-PCR法测定多药耐药蛋白(P-gp)表达量,判断所设计的3条DNA序列对于P-gp表达的抑制作用.选择抑制效率最高的1个重组质粒,将其中的MDR1 shRNA表达结构酶切后插入腺病毒载体pAdeno-X,构建的pAdeno-MDR1经Pac1酶切后与脂质体共转染HEK293细胞进行病毒包装扩增纯化,所得病毒液作酶切电泳及测序分析正确后再转染大鼠星形胶质细胞模型.RT-PCR及免疫组织化学法分别测转染前后星形胶质细胞模型的MDR1及P-gp表达量.结果 重组质粒及pAdeno-MDR1病毒经PCR、酶切、测序分析证实构建正确.病毒滴度为6×109 pfu/mL.重组腺病毒转染星形胶质细胞后MDR1及P-gp表达量减少,干扰效率接近100%.结论 成功构建针对大鼠MDR1基因的RNAi腺病毒载体,并通过体外实验证实其对大鼠MDR1基因的高效抑制作用.为进一步探索难治性癫痫的多药耐药机制和基因治疗奠定了基础.     

RNA干扰Twist基因真核表达载体的构建与筛选

目的： 构建编码Twist mRNA 的短发卡样RNA （shRNA ）质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA 质粒表达载体。方法： 以Twist mRNA 编码区中第777位和第845位序列作为RNA干扰靶点,分别构建2个shRNA 质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,构建后通过PCR 酶切电泳和质粒测序进行鉴定。经鉴定后分别转染稳定表达Twist基因的膀胱癌T24细胞,RT-PCR 和Western blotting 分别从mRNA 和蛋白质水平检测抑制效果。结果： 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出400 bp的目的条带,插入片段测序结果与合成的shRNA 结果一致。靶向Twist基因的shRNA 对膀胱癌T24细胞中Twist基因mRNA 抑制率为90%,蛋白质抑制率为86%,两种干扰质粒中shRNA1干扰效果最明显。结论： 成功构建了靶向Twist 基因的shRNA 质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA 质粒表达载体为pGenesil-shRNA1 质粒。     

靶向血管内皮生长因子受体3基因的小干扰RNA表达载体构建及其生物学效应

目的构建靶向血管内皮生长因子受体3（VEGFR-3）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体（psiRNA-VEGFR-3）,并观察其抑制人结肠癌细胞株LoVo细胞中VEGFR-3基因表达的效果及生物学效应。方法设计并合成1对VEGFR-3编码基因的反向重复序列,定向克隆至载体pSUPER,构建siRNA真核表达载体,利用脂质体2000将构建的psiRNA-VEGFR-3载体转入LoVo细胞中,应用半定量RT-PCR检测基因转染前后VEGFR-3mRNA表达水平的变化,四甲基偶氮唑蓝法观察细胞生长变化、凋亡率及细胞周期的变化。结果成功构建针对VEGFR-3基因的siRNA表达载体。psiRNA-VEGFR-3可显著抑制LoVo细胞中VEGFR-3基因的表达（P〈0．01）;转染psiRNA-VEGFR-3后能够诱导LoVo细胞发生明显凋亡。结论psiRNA-VEGFR-3载体能够在LoVo细胞中引发RNA干扰效应,通过下调VEGFR-3基因表达可以抑制细胞增殖,诱导LoVo细胞发生明显凋亡。     

特异性针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因SiRNA表达载体的构建、鉴定及对高糖状态下INS-1细胞周期的影响

目的 构建并筛选携带针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因(PTH1R)的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体以及鉴定及观测高糖下对INS-1细胞周期的影响.方法 根据Genbank筛选PTH1R三个阳性克隆及一个阴性克隆序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPERretro-GFP/Neo,并用RT-PCR和测序鉴定,将其转染至INS-1细胞中,Westernblotting观察PTH1R表达,鉴定其转染效率,筛选出最佳抑制基因后,应用流式细胞仪检测25mmol/LD-葡萄糖处理INS-1细胞周期.结果 菌落RT-PCR及基因测序鉴定结果表明序列正确.并能成功转染到INS-1细胞株中,Westernblot筛选最佳抑制基因.细胞周期检测提示PTHIR沉默后抑制INS-1细胞从G0/G1期进入S期.结论 成功构建并筛选出特异性沉默大鼠甲状旁腺激素受体1基因的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体,高糖状态下PTH1R表达可能为INS-1细胞自我保护的一种作用.     

靶向hVEGF165基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的 构建编码hVEGF165 mRNA的shRNA质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 以hVEGF165 mRNA编码区中第5和第7外显子序列作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体并通过PCR进行鉴定.经鉴定后分别转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果.结果 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出预期条带,构建成功.靶向hVEGF165基因的shRNA对所转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞中hVEGF165基因mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中shRNA2最为明显.结论 成功构建了靶向hVEGF165基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒.     

小鼠肝脏特异的微RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的利用分子克隆技术,构建微RNA(microRNA,miRNA)真核细胞载体.方法人工合成小鼠肝脏特异的微RNA(miR-122)前体基因序列,并添加酶切位点及polyT转录终止序列,经退火处理后形成双链结构,插入小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体pAVU6 27中,经酶切鉴定和测序证实后,构建成为miR-122真核表达载体(pAVU6 27-mir122).结果合成的基因序列完全正确并成功克隆到真核表达载体pAVU6 27上.结论 miR-122真核表达载体的构建,为进行真核细胞转染及miR-122表达的研究奠定了基础.     

Prohibitin基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体．方法：根据prohibitin mRNA序列,利用Ambion网上设计软件设计两条针对该基因不同靶点的shRNA干扰序列,克隆到线性化的质粒载体上,并进行酶切鉴定和测序．结果：酶切结果表明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计一致．结论：成功构建两个靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体,为下一步研究prohibitin基因在肿瘤细胞中的作用和后续的的体内外实验奠定了基础．     

大鼠Nogo受体基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠Nogo受体(Nogo receptor,NgR)基因RNA干扰慢病毒表达载体,并观察其对293T细胞感染效率.方法: 应用基因工程技术,首先构建携带目的基因siNgR199的慢病毒穿梭质粒表达载体,然后使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒穿梭质粒共转染293T细胞,转染48 h后收集上清离心过滤后冰浴保存,最后进行病毒滴度测定,与标准病毒液分别感染293T细胞,按MOI值分为5个梯度:1、3、5、10、20,以确定病毒滴度及适合感染的MOI值.其中采用PCR方法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测.结果: 酶切鉴定及PCR结果与病毒载体的预期结果一致,病毒滴度达1×108 ifu/m1,适合感染的MOI值为3.结论: 应用基因工程技术,成功构建了大鼠siNgR199慢病毒表达载体,为应用于治疗脊髓损伤后轴突再生创造了条件.     

衔接蛋白2基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的：构建针对衔接蛋白2的μ2亚单位(AP2-μ2)的短链干涉RNA(siRNA)及其表达载体,转染细胞后观察其对AP2-μ2基因的干涉作用。方法：设计AP2-μ2靶向的发夹状siRNA,据此设计合成3条互补的寡核苷酸链,退火后分别连接到pSilencer 3.1 neo H1载体,转化扩增后进行序列测定。待转染细胞分为对照组、Scramble plasmid、AP2 plasmid-1、AP2 plasmid-2和AP2 plasmid-3组。用脂质体转染法将3组siRNA重组质粒与阴性对照质粒(Scramble plasmid)转染大鼠心肌细胞株H9C2,通过RT-PCR法检测AP2-μ2基因表达水平的变化。结果：合成的6条寡核苷酸单链凝胶电泳显示多个电泳条带,分别退火后,产物经凝胶电泳显示形成单一条带。双链DNA模板与载体质粒连接后,用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切,凝胶电泳可见4　300和66 bp的酶切片段。DNA测序连接的核酸序列与设计序列一致,表明AP2-μ2基因的3条siRNA载体构建成功。RT-PCR检测,在AP2 plasmid-1组,转染的H9C2细胞中AP2-μ2的基因表达水平较阴性对照组降低约96%。结论：成功地构建了针对AP2-μ2基因的3条siRNA载体,其中AP2 plasmid-1转染细胞后可显著抑制AP2-μ2基因表达。     

KDR siRNA表达载体的构建和鉴定

目的: 构建针对血管内皮生长因子受体Ⅱ(VEGFR2),又称激酶功能区受体(KDR)的pSilencerTM3.1 siRNA(small interfering RNA)表达载体,并在前列腺癌细胞PC3中观察其干扰效果. 方法: 设计针对KDR基因编码区的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经BamH Ⅰ, HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSilencerTM3.1-H1 neo中,对重组质粒进行酶切分析和DNA系列测定. 以脂质体法将pSilencerTM3.1-H1 neo空载体和3个(pSilencer3.1-KDR1, pSilencer3.1-KDR2和pSilencer3.1-KDR3)重组质粒分别导人PC3前列腺癌细胞系. 72 h后用RT-PCR和Western blotting技术检测各实验组前列腺癌细胞内KDR mRNA及蛋白水平的表达情况. 结果: 经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒中已插入了目的基因片断. 转染KDR-siRNA的前列腺癌细胞,72 h后,而以pSilencer3.1-KDR3的抑制KDR mRNA及蛋白表达效果最为有效,其抑制率约为55%. 结论: 成功构建了针对KDR的RNA干扰表达载体pSilencer3.1-KDR1, pSilencer3.1-KDR2和pSilencer3.1-KDR3, pSilencer3.1-KDR3能有效抑制KDR在前列腺癌细胞中表达,为将其进一步应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础.     

HCMV-IE1基因siRNA真核载体的构建及其效率研究

目的 采用RNA干扰技术研究在体外对人巨细胞病毒即刻早期Ⅰ基因(HCMV-IE1)表达的沉默作用.方法 根据HCMV-IE1基因表达框,设计siRNA干扰序列,重组至带U6启动子真核表达载体,构建针对HCMV-IE1基因的siRNA真核表达载体(pHCMV-IE1i);经测序鉴定后,脂质体法转染HEL细胞HCMVAD169株,应用荧光显微技术、流式细胞术和RT-PCR法检测分析pHCMV-IE1i对HCMV-IE1基因的表达干扰效果.结果 测序结果显示针对HCMV-IE1基因的pHCMV-IE1i构建成功;荧光显微结果表明pHCMV-IE1i转入HEL细胞后可以特异抑制细胞中HCMV-IE1基因的表达;流式细胞术结果显示对照细胞组HCMV-IE1基因表达阳性率达60%以上,干扰细胞组HCMV-IE1基因表达阳性率仅达10%左右(P＜0.05);RT-PCR检测结果发现pHCMV-IE1i能显著抑制HCMV-IE1基因的表达(P＜0.05).结论 采用RNAi技术能有效抑制HCMV-IE1基因在细胞内的表达,对探讨其在防治HCMV感染疾病中的作用与意义提供了科学的实验依据.