人/猪SERPING1同源性比较及猪SERPING1敲除细胞系的建立

目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立SERPING1^-/-猪胎儿成纤维细胞(PFFs)系,为构建遗传性血管性水肿模型提供细胞实验材料。方法 首先比较人/猪SERPING1氨基酸同源性。其次,分析猪SERPING1基因有效的编码区,据此选择第八外显子为敲除靶点,设计并合成靶向猪SERPING1的单导向RNA(sgRNA),连接到含有Cas9核酸内切酶的pX330载体上,构建SERPING1打靶载体pX330sgRNA,将其转染至猪胎儿成纤维细胞中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,用T7E1酶切实验检测靶点编辑情况,测序验证单克隆细胞基因型。结果 生物信息学分析结果提示人/猪SERPING1蛋白氨基酸同源性较高,氨基酸比对相似性达到65.87%。成功构建打靶SERPING1的载体,并转染到细胞,药物筛选获得SERPING1基因敲除的单克隆细胞,测序确认了突变的基因型。结论 人/猪SERPING1蛋白同源性较高,适合用于构建遗传性血管性水肿模型。构建的Cas9/sgRNA表达载体实现了SERPING1基因编辑,获得基因敲除的单细胞克隆,为后续SERPI...     

基于CRISPR/Cas9技术建立敲除OSBPL2基因的HeLa细胞株

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建OSBPL2基因敲除的稳定HeLa细胞株?方法:设计3个单导向RNA(single-guide RNA,sgRNA),分别靶向OSBPL2基因的第2?3和5外显子,以PGK1.1为载体,构建出3个重组真核表达载体?分别转染HeLa细胞后,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,CruiserTM敲除检测实验和测序共同检验载体靶向效率?选出靶向效率最高的质粒转染HeLa细胞,进行单克隆细胞培养,最后用Western blot 鉴定敲除效果?结果:sgRNA正确插入到PGK1.1载体,靶向第2外显子的重组载体转染HeLa细胞并筛选单克隆后,细胞未检测出OSBPL2蛋白的表达?结论:敲除OSBPL2基因的稳定HeLa细胞株构建成功?     

GPRASP2基因编辑猪胎儿成纤维细胞系的建立

目的：采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G蛋白偶联受体相关分选蛋白2（G protein?coupled receptor associated sorting protein 2,GPRASP2）基因敲除的猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblast,PFF）,为构建GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型提供相应的供体细胞。方法：采用生物信息学方法对人与猪GPRASP2基因进行亲缘性和同源性分析,预测人与猪GPRASP2基因编码的氨基酸序列和蛋白二级结构;设计合成靶向巴马猪GPRASP2基因编码区上游和下游的单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以pX330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组打靶质粒,并将此重组质粒转染至PFF中,G418药物筛选阳性单克隆细胞,测序分析其基因型。结果：生物信息学分析提示人/猪GPRASP2亲缘关系相近,同源性较高,且主要功能结构域Arm2的二维和三维结构相似。构建了靶向猪GPRASP2基因的重组打靶质粒并转染PFF,通过药物筛选、基因型分析和Western blot验证,成功获得GPRASP2基因敲除单克隆PFF。结论：人/猪GPRASP2基因亲缘关系相近且高度同源;采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术成功构建GPRASP2基因敲除的单克隆PFF,为建立GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型奠定了前期基础。     

利用CRISPR/Cas9技术高效构建巴马小型猪F9基因敲除细胞系

目的：利用CRISP/Cas9基因编辑技术建立巴马小型猪F9基因敲除的胚胎成纤维（porcine fetal fibroblast,PFF）细胞系,为后续构建血友病乙巴马小型猪模型提供原材料。方法：首先通过生物信息学方法对人和猪F9基因同源性进行分析,模拟并分析人和猪FⅨ二级、三级结构的相似性;其次选取猪F9基因的第2外显子为敲除靶点,利用CRISPR在线靶点设计工具（http：//www.e?crisp.org/E?CRISP/designcrispr.html）设计并合成单链向导 RNA（single guide RNA,sgRNA）,以pX330质粒为骨架构建打靶载体,同G418抗性质粒一同转染至野生巴马小型猪的PFF中,经药物G418筛选获得抗性单细胞克隆,测序并鉴定其基因型。结果：生物信息学分析表明人和猪的F9基因具有较近的遗传距离,FⅨ的氨基酸序列相似值为83.33%,三维结构的均方根偏差（root mean square deviation,RMSD）值为0.149。成功构建打靶载体并转染PFF细胞,药筛后共获得55个单细胞克隆,经过测序显示有25个单细胞克隆的F9基因发生突变,计算敲除率为45.5%。结论：人和猪F9基因具有高度同源性;构建的Cas9/sgRNA 表达载体可以高效编辑PFF中的F9 基因。最终获取F9基因敲除的单细胞克隆,为构建乙型血友病巴马小型猪模型奠定了重要的前期工作基础。     

CRISPR/Cas9介导的猪Six1和Six4基因敲除细胞系的建立

目的：利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模型奠定重要的研究基础。方法：选取猪Six1基因和Six4基因第一外显子为敲除靶点,分别设计并合成单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,将其插入含有Cas9骨架的PX330质粒,分别构建Six1基因和Six4基因敲除打靶载体PX330?sgRNA1和PX330?sgRNA4;用T7EN1酶验证打靶载体敲除效率后,将高效打靶载体与含G418抗性的质粒（pCMV?tdTomato）共转染原代猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblasts,PFFs）中,并通过药物筛选获得单克隆细胞群落,随后对单克隆细胞进行基因型鉴定。结果：分别成功构建Six1和Six4基因的Cas9/sgRNA表达载体。转染Six1基因打靶载体经药物筛选后,利用PCR方法鉴定所获得的Six1基因敲除单克隆细胞系48个,其中Six1-/-细胞系21个。通过同样方法同时转染Six1基因和Six4基因打靶载体,经药物筛选后共获得44个单克隆细胞系,其中Six1-/- Six4-/-细胞系为13个。结论：通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可高效获得Six1单基因敲除细胞系和Six1/Six4双基因敲除细胞系,为构建肾脏发育缺陷猪动物模型提供了基础,并有助于研究Six1和Six4基因在猪肾脏发育中的功能。     

CRISPR/Cas9联合Cre-Loxp系统建立VASN条件敲除的小鼠肝细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统的条件性敲除策略构建VASN基因敲除的AML12小鼠肝细胞株。方法：在VASN基因第二外显子上下游设计靶点并合成gRNA序列,构建2个CRISPR/Cas9重组载体;设计构建VASN上下游分别带有Loxp序列和旁侧同源序列的供体载体donor DNA质粒;将3个质粒共转染至小鼠肝细胞AML12中,分离单克隆,提取基因组DNA,经PCR及测序鉴定获得稳定敲入Loxp序列的单克隆细胞株AML12-Loxp;将pALB-Cre质粒转染至AML12-Loxp,筛选建立敲除VASN基因的细胞系。结果：成功构建2个靶向敲除VASN基因的pX459-gRNA-VASN-1和pX459-gRNAVASN-2重组载体及一个供体载体;转染药筛后获得12个单细胞克隆,经测序,5个单克隆细胞实现VASN基因上下游精确敲入Loxp序列;同源重组敲入效率为41.6%;p ALB-Cre质粒转染后获得20个单细胞克隆,经PCR和测序获得12个VASN基因敲除的单克隆细胞,敲除效率为60%。结论：利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统成功构建...     

α-半乳糖苷酶A基因敲除猪胎儿成纤维细胞系的建立

目的 基于CRISPR/Cas9技术构建α-半乳糖苷酶A (GLA)基因敲除的巴马公猪胎儿成纤维细胞(PFFs),为构建人类Fabry病猪模型提供实验材料。方法 利用生物信息学方法对人/猪GLA基因编码的α-Gal A的相似性进行分析,并鉴定出猪α-Gal A的催化残基位置。通过在线工具在编码催化残基之前的外显子区设计单链向导RNA,构建CRISPR/Cas9打靶载体。将打靶载体与抗性质粒共转染至巴马公猪胎儿PFFs,用G418药物筛选出单克隆细胞,并PCR测序鉴定。结果 人/猪α-Gal A的氨基酸序列一致性为81%,相似性为89%;三维结构的均方根偏差值为0.012。猪α-Gal A的催化残基是第174位和第235位的天冬氨酸。成功构建CRISPR/Cas9打靶载体,并筛选出单克隆细胞,PCR测序鉴定其基因型。结论 用生物信息学方法验证了人/猪α-Gal A具有高度的相似性。利用CRISPR/Cas9技术获得了GLA基因敲除的巴马公猪PFFs细胞系,为构建人类Fabry病猪模型奠定了基础。     

猪SALL1蛋白分子信息分析及基因敲除细胞系制备

目的：从巴马小型猪SALL1的蛋白结构出发,分析其与人SALL1蛋白的同源性,进一步制备Sall1基因敲除的巴马小型猪胎儿成纤维细胞系,为通过体细胞核移植技术获得猪肾脏发育缺陷模型提供实验材料。方法：利用生物信息学方法分析人、猪、鼠 SALL1 的蛋白结构。利用在线设计软件,在猪 Sall1 基因第 1 外显子区域设计单链引导 RNA(single guide RNA, sgRNA)并将其连接至PX330质粒,构建猪Sall1基因敲除打靶载体。在初步转染细胞的基础上,通过Sall1基因测序分析验证 PX330?sgRNA载体打靶效率,最后将打靶载体转染至原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)中,通过药物筛选获得单克隆细胞并鉴定其基因型。结果：生物信息学分析表明,相比小鼠,猪的SALL1蛋白与人SALL1蛋白具有更高的同源性。成功构建猪Sall1基因敲除打靶载体,并获得33个单克隆细胞系,经基因测序鉴定得到16个Sall1双等位基因敲除的细胞系。结论：生物信息学方法验证了人和猪SALL1蛋白具有更高的同源性。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得Sall1基因敲除细胞系,为研究Sall1基因在猪肾脏发育过程中的作用提供研究材料,并为下一步获得猪肾脏缺失模型奠定基础。     

GGTA1/β4GalNT2双基因敲除近交系五指山小型猪的建立

目的：利用CRISPR/Cas9技术建立五指山小型猪近交系GGTA1/β4GalNT2双基因敲除克隆猪。方法：设计合成靶向猪GGTA1和β4GalNT2基因的单导向RNA（single guide RNA,sgRNA）,以pX330质粒为骨架,分别构建GGTA1和β4GalNT2的Cas9打靶载体,转染至近交系五指山小型猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblast,PFF）中,通过G418药物筛选和测序鉴定获得双基因敲除的单细胞克隆,然后利用体细胞克隆技术（somatic cell nuclear transfer,SCNT）获得双基因敲除的近交系五指山小型猪,并利用流式细胞技术检测克隆猪外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中αGal和Sd（a）抗原的表达。结果：成功构建GGTA1和β4GalNT2基因的Cas9/sgRNA表达载体,转染后获得双基因敲除的近交系五指山小型猪PFF细胞克隆 9个。SCNT成功获得了10只五指山小型猪近交系双基因敲除的克隆猪,其 PBMC无αGal和Sd（a）抗原的表达。结论：CRISPR/Cas9技术可以实现对猪GGTA1/β4GalNT2基因的编辑。本实验首次成功制备了GGTA1/β4GalNT2双基因敲除的近交系五指山型猪,为异种器官移植研究与应用提供了新的供体材料。     

利用CRISPR/Cas9技术敲除HeLa细胞中YAF2基因

目的 利用CRISPR/Cas9技术建立YAF2（YY1 associated factor 2）基因敲除的宫颈癌HeLa细胞株，用于YAF2基因在宫颈癌细胞中分子功能的研究。方法 首先利用CRISPR/Cas9序列设计网站，设计两对靶向YAF2基因第2外显子不同位点的向导RNA（single-guide RNA，sgRNA）。化学合成sgRNA寡核苷酸序列，分别克隆至质粒pX335中，测序确认插入片段正确的克隆。先用一对重组载体转染HeLa细胞，7天后，再用另一对转染HeLa细胞，第2对转染3天后，取培养细胞的2/3提取基因组DNA，对敲除位点附近的片段进行PCR扩增后通过DNA测序对敲除效率进行分析，剩余细胞在96孔平板上通过有限稀释法筛选YAF2敲除的细胞株。用蛋白质免疫印迹实验初步鉴定YAF2蛋白质表达缺失的细胞克隆，提取其基因组DNA，对敲除位点附近的序列进行PCR扩增，将扩增产物克隆至pGEM-T easy载体，通过DNA测序确认YAF2基因纯合敲除的细胞株。结果 成功构建两对针对人YAF2基因第二外显子的pX335-sgRNA质粒；PCR产物测序证明两对重组载体均有YAF2基因敲除活性；得到2株YAF2敲除的HeLa细胞株。结论 利用CRISPR/Cas9技术在HeLa细胞中成功敲除YAF2基因，为在HeLa细胞中研究YAF2的分子功能奠定基础。     

Plaque morphology of Teschen disease viruses and certain pig enteroviruses in primary pig kidney monolayer cultures

Plaque patterns and diameters of four virulent strains and one tissue culture mutant of Teschen disease virus were compared with six pig enteroviruses isolated in the United States. They are described as they were produced in primary pig kidney monolayer cultures. Reproducible plaques, with similar characteristics and class-types of each of the viruses tested were obtained with the application of a 45-minute virus adsorption time. Their morphologic characteristics and the proportion in which the plaque types appeared may assist in the differentiation of these virus strains.     

猪硫酸软骨素的制备和含量测定

目的：建立制备猪硫酸软骨素的最佳实验方案．方法：以稀碱-浓盐法制备猪硫酸软骨素,用红外光谱法和咔唑分光光度法鉴定猪硫酸软骨素的含量和结构．结果：对自制猪硫酸软骨素和商品硫酸软骨素进行红外吸收光谱比较分析发现,其特征吸收峰均在3400,1620,1560,1240,860cm^-1处．自制猪硫酸软骨素质量浓度在0．00～0．25g／L范围内线性关系良好（r=0．9998,n=7）,加样回收率为99．48％,RSD=0．73％．结论：本法简单、快速,结果准确,可作为制备猪硫酸软骨素和检测含量的方法．     

商品猪饲料致皮肤超敏反应实验研究

目的 探讨商品猪饲料对人皮肤的致敏作用.方法 建立豚鼠斑贴试验模型,观察豚鼠局部的超敏反应情况,ELISA法检测血清白细胞介素4（IL-4）、γ干扰素（IFN-γ）水平,苏木精-伊红染色观察受试部位组织病理的改变.结果 高浓度饲料组和低浓度饲料组局部出现超敏反应的阳性率分别为87.5％、80.0％;与阴性对照组相比,高浓度饲料组豚鼠血清IFN-γ和IL-4水平显著升高（P ＜0.001）,低浓度组豚鼠血清IFN-γ和IL-4水平也显著升高（P＜0.01）;病理检查见饲料组局部出现炎症细胞浸润.结论 商品猪饲料具有致敏作用,主要由Ⅰ型和Ⅳ型超敏反应引起.     

SPF巴马小型猪的培育及应用

利用我国自有资源巴马小型猪群,完成了疫病净化,建立了无特定病原体巴马小型猪实验猪群。制定了饲育标准、实验猪遗传学检测标准和微生物质量控制技术标准,制订了黑龙江省地方标准《无特定病原体猪微生物学监测技术规范》,对建立的猪群进行了遗传学和微生物质量控制。建立了猪瘟病毒(CSFV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染巴马小型猪感染模型。扩增了巴马小型猪重要细胞因子及固有免疫相关的重要分子,从分子水平进一步证明巴马小型猪可以代替家猪进行猪病感染实验。目前建立的猪群已广泛应用在猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒等猪重要疫病防控及致病机理的研究,实现了共享利用。本项目的完成解决了实验用猪瓶颈问题,提升了动物疫病研究水平,提供了新型实验动物,实现了优质种质资源共享利用,加速了生命科学研究和生物制品产业发展,推动了农业实验动物的行业进步。     

猪神经肽的测序

目的 :为了解从猪脑中分离出的一种猪神经肽的肽链序列 ,对其进行了测序分析。方法 :自动蛋白测序仪法。结果 :猪神经肽为一种小分子二肽。它由Asp和Ala连接而成。结论 :猪神经肽与Cheung于 1979年分离的猪神经二肽完全相同     

清醒豚鼠的耳蜗电图

在面神经管内长期植入电极记录清醒豚鼠的耳蜗电图，测量了耳蜗电图中各项指标的正常值。耳蜗微音器电位的波幅以短纯音２ｋＨｚ刺激时为最大，其次是０．５、１、４ｋＨｚ，以８ｋＨｚ时为最小。面神经管法记录的总和电位（ＳＰ）的极性均为负性，在短声刺激时ＳＰ／ＡＰ为０．０８４±０；０４３。动作电位（ＡＰ）Ｎ，波的反应阈值在短声刺激时为２．６±４．２ｄＢ，在０．５和ｌｋＨｚ短纯音刺激时分别为５３．２±５．４和４２．４±７．３ｄＢ。在０．５、１．２、４ｋＨｚ短纯音刺激时均可见频率跟随反应，在０．５和１ｋＨｚ时，其波幅大于同频率ＡＰ（Ｎ１）波幅，其反应阈值低于同频率ＡＰ（Ｎ１）反应阈值。     

家猪心脏二尖瓣复合体的形态学观测

目的　观测家猪心脏二尖瓣复合体 ,为心脏研究和心脏移植积累资料。方法　甲醛固定的家猪心脏 35例 ,解剖并观测二尖瓣复合体。结果　家猪心脏二尖瓣复合体由瓣环、瓣膜、腱索和乳头肌构成 ,瓣环周长为 :73.0 0± 9.71mm ;前瓣、后瓣、前外侧连合、后内侧连合的高度分别为 17.45± 1.99mm ,16 .33± 2 .2 2mm ,5 .6 8± 1.37mm ,5 .35± 1.11mm ,前外侧连合和后内侧连合的宽度分别为 4.31± 0 .80mm ,4.40± 0 .6 3mm ;腱索起始前乳头肌 ,后又附着于前瓣 ,后瓣和后内侧连合的条数为 4.0 0± 1.30mm ,5 .2 1± 1.84和 2 .44± 1.16 ,起始后乳头肌 ,附着于前瓣、后瓣和前外侧连合的条数为 3.76± 1.78,5 .38± 2 .2 0和 2 .12± 0 .91。结论　家猪心脏二尖瓣复合体中各结构与人类相似 ,但大小有一定差异     

Guinea Pig Maximization Test for Trichloroethylene and Its Metabolites

Objectives To study the contact allergenic activities of trichloroethylene (TCE) and its three metabolites trichloroacetic acid, trichloroethanol and chloral hydrate. Methods A modified guinea pig maximization test (GPMT) was adopted. The skin sensitization (edema and erythema) was observed in trichloroethylene, trichloroacetic acid, trichloroethanol, chloral hydrate and 2,4-dinitrochlorobenzene. Results The allergenic rate of TCE, trichloroacetic acid and 2,4-dinitrochlorobenzene was 71.4%, 58.3% and 100.0% respectively, and that of trichloroethanol and chloral hydrate was 0%. The mean response score of TCE, trichloroacetic acid and 2,4-dinitrochlorobenzene was 2.3, 1.1, 6.0 respectively. The histopathological analysis also showed an induction of allergenic transfomation in guinea pig skin by both TCE and trichloroacetic acid. Conclusion TCE appears to be a strong allergen while trichloroacetic acid a moderate one. On the other hand, both trichloroethanol and chloral hydrate are weak sensitization potentials. Immunologic reaction induced by TCE might be postulated as the pathological process of this illness. Consequently, it is suggested that in the mechanism of Occupational Dermatitis Medicamentose-Like (ODML) induced by TCE, the chemical itself might be the main cause of allergy. As one of its metabolic products, trichloroacetic acid might be a subordinate factor.