地高辛配基标记HBV DNA探针与生物素标记探针用于肝组织原位杂交的探讨

作者应用地高辛配基标记HBV DNA探针进行原位杂交,检测16例(重症肝炎10例、HBsAg阳性3例、非肝脏疾病3例)肝组织标本内HBV DNA。结果表明:HBV DNA阳性物质在肝细胞内的分布有全胞浆型、包涵体型、全胞核型及核仁-核膜型4种方式。进一步说明地高辛配基标记探针原位杂交可以在一定程度上反映HBV DNA在细胞内的存在状态。作者将地高辛配基标记HBV DNA探针原位杂交与生物素标记探针进行比较,结果前者较后者灵敏度高、特异性强、实用性好,是理想的检测HBV DNA的新一代非同位素探针。     

一种检测肿瘤细胞中癌基因表达的简便且敏感的方法(简报)

将肿瘤细胞直接固定在硝酸纤维素膜上,经蛋白酶消化后直接与地高辛配基(digoxigenin)标记的癌基因探针进行DNA-RNA杂交,可检测该细胞中癌基因表达的情况。本法不需提取RNA,操作简便,灵敏度高,重复性好,不需复杂的设备,更由于地高辛配基标记的探针克服了同位素标记探针半衰期短、对人体有害等缺点,有希望得到推广使用。 将肿瘤细胞PLA801-D95(人肺巨细胞癌细胞株,由中国人民解放军总医院提供)制成细胞悬液,按     

用地高辛配基标记DNA探针及其应用(简报)

近年来,非同位素标记技术已广泛用于基因诊断、定位等领域.国内也已开展了本项工作.本文采用国内尚未见报道的一种新的标记法,即用随机引物(random primer)法将地高辛配基标记到DNA上.可提高标记效果及检测灵敏度.本法最小检测灵敏度和最小杂交检出量分别为50fg和0.78Pg.并具有专一的特异性.本法标记3’HVR多拷贝探针和βIVSⅡ单拷贝探针分别检测不同浓度人基因组DNA.经     

用异羟基洋地黄毒甙配基(Digoxigenin)标记cDNA-RNA杂交试验检测登革热病毒的研究

本文用一种新的非同位素标记物异羟基洋地黄毒甙配基(Digoxigenin)通过随机寡核苷酸引物法(RHP)及缺口平移法Biotin标记制成Dig-Den.V-PDW79cDNA探针和Biotin-PDW79-cDNA探针。将已知含量的提纯的Den.V-RNA点NC膜上,分别用Dig探针及Biotin探针与其杂交,Dig探针能测出最小量0.1pg,而Biotin探针仅为10pg。斑点杂交试验结果显示,Dig探针杂交阳性信号明显比Biotin探针强。因此,Dig探针不仅敏感,而且特异并能快速检出登革热病毒和鉴定其型别。     

地高辛标记探针在斑点杂交检测HBV DNA中的初步应用

应用核酸分子杂交检测血清HBV DNA已成为诊断乙肝病毒(HBV),感染及判断其复制状态的重要手段。由于同位素标记探针的半衰期短及放射性污染等缺陷,限制了该技术的推广应用。生物索标记探针的灵敏度和特异性都不十分理想。本文制备地高辛际记的HBV DNA探针,初步应用于血清斑点杂交,是一种适合临床应用的探针检测技术。     

地高辛配基标记HBV DNA探针的制备和应用研究

应用随机引物法制备地高辛配基标记的 HBV DNA 探针,其检测灵敏度为0.1pg;以~(32)P-HBV DNA 探针为金标准,地高辛配基标记探针的敏感性、特异性和准确度分别为96.2％、98.7％和98.1％;在一20℃贮存,地高辛配基标记探针的灵敏度在12月内不变;探针回收重复使用4次效果不受影响;应用于斑点杂交检测1400余份血清标本及原位杂交检测200余份肝组织标本均取得满意效果。     

PCR制备地高辛配基标记的探针检测登革病毒核酸

用聚合酶链反应(PCR)技术,以重组质粒PDEⅡ305 DNA为模板,在底物中补充标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(DIG-dUTP),经扩增反应制备了地高辛配基标记的登革病毒2型(DEN_2)cDNA探针。DNA-RNA斑点杂交表明该探针有DEN_2型特异性,可检出0.1Pg DEN_2-RNA。PCR扩增标记只用10 ng模板DNA,数小时内可制备约Iug标记的cDNA探针,而用六聚核苷酸随机引物(RHP)标记,从质粒DNA酶切、片段回收到标记获得探针,至少需数10 h。可见PCR技术直接制备地高辛配基标记的cDNA探针较方便,快速、标记率高、特异性强,具有一定的应用前景。     

PCR制备地高辛配基标记的探针检测登革病毒核酸

用聚合酶链反应(PCR)技术，以重组质粒PDEⅡ305 DNA为模板．在底物中补充标记的脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(DIG-dUTP)，经扩增反应制备了地高辛配基标记的登革病毒2型(DEN2)cDNA探针。DNA-RNA斑点杂交表明该探针有DEN2型特异性，可检出0．1pgDEN2-RNA。PCR扩增标记只用10ng模板DNA，数小时内可制备约1ug标记的cDNA探针，而用六聚棱苷酸随机引物(RHP)标记，从质粒DNA酶切、片段回收到标记获得探针，至少需数10h。可见PCR技术直接制各地高辛配基标记的cDNA探针较方便，快速、标记率高、特异性强，具有一定的应用前景。     

体外转录法制备地高辛标记cx43cRNA探针

原位杂交常用探针种类较多。检测组织细胞中mRNA，首选cRNA探针。与DNA探针不同，它是单链探针，杂交时无需变性，也没有互补链的干扰，敏感度比cDNA探针要高；与寡脱氧核酸探针比较，其敏感度也要高出许多；并且cRNA探针杂交形成RNA-RNA双链核酸比RNA-DNA和DNA-DNA双链核酸更稳定，从而允许多次洗涤，提高杂交信号，降低背景染色。但也有一些缺点，探针要求条件高，严防RNA酶污染；粘性强，与组织有较高的非特异性结合，需要多次漂洗。用地高辛标记cRNA探针，既克服了同位素探针的一些缺点，如受半衰期的限制，污物处理困难等．又避免了生物素标记探针时受内源性生物素的干扰。所以我们制备地高辛标记的cRNA探针原位杂交检测宫颈组织中的connexin43(CX43)mRNA。     

非同位素标记pAW101探针作人流胚胎组织的亲权鉴定

DNA限制性片段长度多态性(RFLPs)技术的经典方法是用酚抽提DNA,同位素标记探针。本文研究选用N_aCI盐析分离DNA的技术,结合地高辛配基标记pAW101探针方法,作了11例无争议的胚胎组织的亲权鉴定,同时测定4种同Ⅰ酶型,在不违反孟德尔遗规律的前提下,按Essen-Moller公式计算父权概率(均>99.73％),达到确定亲生关系的标准。本方法简单、易于掌握,结果稳定可靠,适宜于一般实验室开展工作。     

PCR检测细粒棘球蚴及DIG标记DNA杂交诊断技术的建立

目的：该项研究旨在探讨聚合酶链反应（PCR）技术在细粒棘球蚴检测和诊断中的应用，同时建立Digoxinum(DIG）标记DNA杂交诊断技术。方法：根据细粒棘球蚴基因片断克隆与序列分析，设计了一对特异性引物，P15‘－GGAATGGAGAGAAGTTAC－3‘，P25’－GCAACCTCCGGAACTTGC－3’。以棘球蚴的囊液、子囊及原头蚴为模板，经PCR扩增获得471bp特异性区带。将扩增产物纯化后，用DIG标记DNA，制备成功特异性核酸探针并用于细粒棘球蚴检测。结果：经对大肠杆菌、痢疾杆菌、结核分枝杆菌、猪囊尾蚴、健康人白细胞进行PCR扩增和DIG标记DNA探针斑占交，只有细粒棘球蚴出现单一471bp特异性区带。PCR的灵敏性为可检出单个原头蚴及100-10fg水平的DNA，而斑点杂交的特异性为2500fg。异源性DNA即使提高点膜量，亦不呈现阳性反应。结论：配以DIG标记的PCR技术在细粒棘球蚴的检测中具有特异、敏感、快速、准确的特点。为包虫病的早期诊断和流行病学调查可提供科学依据。     

多重PCR检测HBV和HCV方法的建立

目的:建立可同时检测血清HBVDNA和HCVRNA的多重PCR。方法:利用已知的基因序列设计了对于不同亚型HBV保守的C基因区的一对引物HBV-P623及对于不同亚型HCV高度保守的位于5’端非编码区(5’-NCR)的两对引物HCV-P289和HCV-P174,扩增经基因释放剂(Genereleaser)处理的HBV和HCV阳性血清。结果:多重引物、逆转录套式PCR反应体系可同时扩增HBV DNA和HCV RNA,分别在623bp和174bp处出现特异DNA扩增带。该反应体系具有较高的特异和敏感性,受检血清中仅含有10fgHBV DNA和5CID HCV RNA即可检出。血清标本不需要提取核酸,可直接进行PCR。用此体系检测30例输血后病人血清,其中15例为HBV感染,8例为HCV感染,7例为阴性。结论:多重PCR检测HBV及HCV的方法具有简便性和实用性。     

聚合酶链反应结合生物素探针杂交检测HBV DNA的应用

本研究将聚合酶链反应和生物素探针点杂交相结合,可直接从5μl 血清中检测到10fgHBV DNA。应用此方法检测20例 HBsAg 和 HBeAg 阳性病例,HBVDNA 均阳性;20例 HBsAg 阳性、HBeAg 阴性病例中,有8例阳性;20例健康献血员中,亦有1例检出 HBV DNA。结果表明这是一种灵敏可靠,适合于基础及临床广泛使用的 HBV DNA 非同位素检测法。     

基因扩增法检测军团杆菌DNA的研究

采用聚合酶链式反应建立检测军团菌 DNA 的实验诊断方法。结果显示,采用军团菌属5 SrRNA 编码区特异性引物进行扩增,11种军团菌(包括八种嗜肺军团菌)均可见104bp 的阳性扩增带;采用嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强(mip)基因编码区特异性引物扩增,所有八种嗜肺军团菌均可见650 bp 的特异性扩增带,所有三种非嗜肺军团菌扩增结果为阴性。检测敏感性为60 fg 左右。     

聚合酶链反应检测患儿尿标本中的巨细胞病毒DNA

本文建立了聚合酶链反应(PCR)检测人巨细胞病毒(HCMV)方法,探讨了该方法的某些实验条件。用PCR检测24例临床患儿尿标本。证明PCR方法特异、敏感、简便而快速。同科不同属病毒如HSV、EBV等以及人源正常细胞均无假阳性结果:最小检出量可达0.1fg DNA,相当于6个基因拷贝;用水浴箱手控时间即可进行PCR循环,30次循环仅需97min30s;PCR和DNA杂交检测尿标本中HCMV阳性例数分别为20和14例。该结果证明HCMV感染儿童的广泛性和严重性,初步表明儿童肾病综合症与HCMV有关。     

Evaluation of a new real-time PCR assay for detection of Mycoplasma pneumoniae in clinical specimens

Objective To establish and evaluate a real-time PCR assay to detect Mycoplasma pneumoniae (M.pneumoniae) in clinical specimens.Methods By analysing the whole p1 gene sequence of 60 M.pneumoniae clinical isolates in Beijing of China,an optimized real-time PCR assay (MpP1) using p1 gene conserved region was designed.The specificity and sensitivity of this assay were evaluated and compared with other two reported assays (RepMp1 and Mp181) using 40 positive and 100 negative clinical specimens.Results The detection limit of the new assay was 8.1 fg (about 1～3CFU) M.pneumoniae DNA.The sensitivity of Mpp1,RepMp1,and Mp181 assays appeared to be 100％,100％,and 85％,respectively.Conclusion MpP1 assay is suitable for the detection of M.pneumoniae in Chinese clinical specimens.     

宫外孕组织沙眼衣原体感染的研究

建立检测沙眼衣原体的ＰＣＲ方法，计算机辅助设计的引物位于编码沙眼衣原体主要外膜蛋白（ＭＯＭＰ）的基因区内，扩增产物为１４４ｂｐ。该引物具有高度的特异性和敏感性，其最小检出量为５ｆｇ。应用该引物检测了５２份宫外孕组织中沙眼衣原体ＤＮＡ，测得宫外孕患者沙眼衣原体的阳性率为４０．４％，明显高于对照组的１２．５％（Ｐ＜０．０１），从ＤＮＡ水平证实在宫外孕组织内存在沙眼衣原体     

应用PCR快速诊断小儿结核性脑膜炎的研究

作者报道特异性寡核苷酸引物引导聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测脑脊液中结核杆菌ＤＮＡ。所用引物来自于编码结核杆菌的６５ＫＤａ蛋白质抗原基因，产生特异的３８３ｂｐ片段。对１０倍连续稀释的人型结核杆菌ＤＮＡ进行ＰＣＲ，可检测出１ｐｇ结核杆菌ＤＮＡ，相当于１０～１００个细菌。应用ＰＣＲ检测４２例结脑脑脊液，阳性率为５７．１４％，直接涂片镜检和细胞培养阳性率分别为７．１４％和１４．２８％；４６例非结脑脑脊液中，３种检测结果均阴性。研究结果表明，ＰＣＲ检测脑脊液中结核杆菌ＤＮＡ有较高的敏感性和特异性，它快速、简便，有望成为一种临床常规检测结核杆菌方法。     

应用连接酶链反应检测沙眼衣原体DNA

目的 建立检测沙眼农原体感染的具有高度敏感性和特异性的缺口—连接酶链反应—酶联免疫吸附测定法。方法 根据CT主要外膜蛋白稳定区设计2对互补探针并分别对其两端标记生物素和地高辛，对6种CT标准株、鹦鹉热衣原体标准株和其他细菌进行Gap—LCR反应并以ELISA和EB染色电泳检测扩增产物以比较两者的检测限度。结果Gap LCR可检出6种CT标准株并不与其他细菌发生交叉反应，ELISA可检出10fg DNA模板的扩增产物，较EB电泳法敏感10倍。结论 Gap—LCR—ELISA是一高度敏感特异的检测CT感染的核酸扩增技术，是适宜于我国广大医疗基层单位进行大规模CT分子流行病学研究的极具前景的方法。     

荧光重组酶聚合酶扩增技术快速检测田鼠巴贝虫方法建立及初步评价

目的 建立一类荧光重组酶聚合酶（recombinase polymerase amplification, RPA）扩增的田鼠巴贝虫快速检测方法并对该方法进行评价。方法 选择细胞色素B基因为靶序列,设计3组引物及荧光探针建立田鼠巴贝虫的检测方法并优化引物。设置37 ℃、38 ℃、39 ℃、40 ℃、41 ℃、42 ℃等6个温度梯度进行反应温度条件优化。将基因组DNA稀释至1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL等7个浓度梯度进行该方法的敏感性评价,采集恶性疟及间日疟患者血液样本进行特异性评价。取445 200、89 040、17 808、3 561.6、712.32、142.46、28.49、5.7、1.14、0.23不同田鼠巴贝虫载量的样本进行虫密度最低检测限实验。选取16例临床发热患者的血液样本进行荧光RPA与巢式PCR检测,评价结果一致性。结果 建立的荧光RPA法可特异扩增出150 bp的田鼠巴贝虫目的片段,最佳反应温度为39 ℃。该方法针对基因组DNA的检测敏感性最低可达10 fg/μL,不同田鼠巴贝虫密度样本的最低检测限量为0.23个/μL。该方法在对恶性疟、间日疟患者血液样本的检测中均未出现交叉反应。荧光RPA与巢式PCR各检测16例临床发热患者血液样本,均检出9例田鼠巴贝虫阳性,7例田鼠巴贝虫阴性,结果一致。结论 荧光重组酶聚合酶扩增检测田鼠巴贝虫方法敏感性强、特异性好,有望应用于巴贝虫感染的快速检测及风险监测。