利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒

目的:利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒,为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础。方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDNA。将扩增的CAT cDNA与dATP反应,利用Taq DNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CAT cDNA的3′末端加"A"并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CAT cDNA插入至中间载体pGEM-T Easy Vector中,经PCR、限制性酶切分析鉴定重组子pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1,然后酶切鉴定。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经SalⅠ-BglⅡ和XhoⅠ-BamHⅠ双酶切,利用同尾酶(SalⅠ与XhoⅠ,BglⅡ与BamHⅠ)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CAT cDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。结果:获得pET15b-PEP-1-CAT重组子,经测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CAT cDNA序列一致。结论:pET15b-PEP-1-CAT的成功构建为产生融合蛋白H is tag-PEP-1-CAT进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定了基础。     

血红素加氧酶-1融合蛋白PEP-1-HO-1的制备及在大鼠H9c2心肌细胞的转导

目的:制备血红素加氧酶-1(HO-1)融合蛋白PEP-1-HO-1,观察融合蛋白在大鼠H9c2心肌细胞的转导。方法:设计合成hHO-1 PCR引物,扩增hHO-1 cDNA片段;采用PCR靶向克隆法将扩增产物与含有相同酶切位点载体质粒pET15b-PEP-1进行重组,扩增质粒,双酶切鉴定和DNA测序;将测序和鉴定结果正确的重组质粒转化宿主菌Rosetta(DE3)pLysS,诱导表达融合蛋白PEP-1-HO-1,利用表达蛋白N端的组氨酸"标签"(His-tag)进行亲和层析纯化融合蛋白;SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行定性检测,Bradford法定量检测纯化后蛋白;融合蛋白孵育大鼠H9c2心肌细胞,免疫组化法观察融合蛋白在H9c2细胞的转导和分布,分光度法检测蛋白转导后的活性。结果:hHO-1 cDNA与pET15b-PEP-1重组成功,重组质粒pET15b-PEP-1-hHO-1经酶切鉴定含有hHO-1 cDNA,测序分析证实与GenBank提供的原始序列完全一致;重组质粒转化后经诱导和纯化得到了融合蛋白PEP-1-HO-1,浓度达到1.0 g/L;融合蛋白可以穿透H9c2心肌细胞胞膜,进入细胞后主要分布在胞质和胞核内并具有天然活性。结论:成功地构建了pET15b-PEP-1-hHO-1原核表达质粒,获得了可穿透H9c2心肌细胞膜的血红素加氧酶-1融合蛋白PEP-1-HO-1,为应用HO-1治疗缺血性疾病的研究奠定了基础。     

PEP-1肽介导人过氧化氢酶转导入人脐静脉内皮细胞

目的:采用体外培养的人脐静脉内皮细胞株(CRL-1730),研究PEP-1肽介导人过氧化氢酶穿透细胞的能力。方法:构建原核表达质粒pET15b-PEP-1-CAT,将其在基因工程菌中表达出N端带有6个组氨酸“标签”(His-tag)的重组蛋白,并通过金属螯合亲和层析对其进行纯化,然后将纯化得到的PEP-1-CAT融合蛋白加入体外培养的人脐静脉内皮细胞,通过Western blot来分析其转导能力。结果:测序分析证实,原核表达质粒pET15b-PEP-1-CAT重组成功。SDS-PAGE和Western blot结果表明,PEP-1-CAT在E.coli中获得了高效表达,经Ni2+-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.1 U/g。将其加入到体外培养的内皮细胞培养基中,发现它能以剂量依赖及时间依赖的方式转导入细胞内,并能保持酶活性达48 h。结论:PEP-1-CAT融合蛋白能高效地转导入人脐静脉内皮细胞,为防治各种与氧化应激损伤有关的疾病开辟了新的途径。     

PCR产物靶向克隆法构建pET15b-CAT及His-tag-CAT融合蛋白的表达与纯化

目的:将人过氧化氢酶(Catalase,CAT)cDNA的PCR扩增产物定向克隆到pET15b载体上以构建重组质粒pET15b-CAT,并表达和纯化出His-tag-CAT融合蛋白。方法:扩增目的基因的PCR引物的5′端加上与线性化载体同源的碱基序列,以使PCR的扩增产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列。以pZeoSV2(+)-CAT为模板进行靶向克隆所需的人CAT cDNA扩增。将纯化的人CAT cDNAPCR产物与经XhoⅠ和BamH Ⅰ酶切的线性化载体pET15b以6∶1摩尔数之比混合于含重组酶的反应液中,25℃反应30min,将PCR产物定向克隆于目标载体pET15b上,获得重组质粒pET15b-CAT。重组质粒经PCR,XhoⅠ酶切和DNA测序鉴定。pET15b-CAT转化BL21(DE3)宿主菌,用IPTG诱导表达出His-tag-CAT融合蛋白,采用Ni2+-NTA树脂进行亲和层析。结果:人CAT cDNA的PCR扩增产物与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b发生了同源重组反应,经鉴定采用PCR产物靶向克隆法成功构建了pET15b-CAT。SDS-PAGE和Western blot结果表明,转化了pET15b-CAT的宿主菌表达出了His-tag-CAT融和蛋白,经Ni2+-NTA树脂亲和层析得到了纯化的His-tag-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶的活性,活性值为80.23U/g。结论:采用PCR产物靶向克隆法成功地构建了pET15b-CAT,并表达和纯化出了His-tag-CAT融和蛋白,为采用外源性CAT防治与氧化应激损伤相关性疾病奠定了基础。     

PCR产物靶向克隆法构建原核表达载体pET15b-CAT

目的:将人过氧化氢酶(Catalase,CAT)cDNA的PCR扩增产物定向克隆到pET15b载体上以构建重组质粒pET15b-CAT.方法:扩增目的基因的PCR引物的5′端加上与线性化载体同源的碱基序列,以使PCR的扩增产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列.以pZeoSV2( )-CAT为模板进行靶向克隆所需的人CAT cDNA扩增.将纯化的人CAT cDNA PCR产物与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b以6:1摩尔数之比混合于含重组酶的反应液中,25℃反应30 min,将PCR产物定向克隆于目标载体pET15b上,获得重组质粒pET15b-CAT.重组质粒经PCR,XhoⅠ酶切和DNA测序鉴定.结果:人CAT cDNA的PCR扩增产物与经Xho Ⅰ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b发生了同源重组反应,经鉴定采用PCR产物靶向克隆法成功构建了pET15b-CAT.结论:PCR产物靶向克隆法是一种简便、高效地将PCR产物定向克隆于目标载体的方法,而无需对PCR产物进行酶切、末端抹平、载体去磷酸化及连接反应,适用于任何载体、任何插入片段和任意酶切位点.     

PEP-1肽介导入过氧化氢酶转导入人脐静脉内皮细胞

目的：采用体外培养的人脐静脉内皮细胞株（CRL-1730），研究PEP-1肽介导入过氧化氢酶穿透细胞的能力。方法：构建原核表达质粒pET15b—PEP-1-CAT，将其在基因工程菌中表达出N端带有6个组氨酸“标签”（His—tag）的重组蛋白，并通过金属螯合亲和层析对其进行纯化，然后将纯化得到的PEP-1-CAT融合蛋白加入体外培养的人脐静脉内皮细胞，通过Western　blot来分析其转导能力。结果：测序分析证实，原核表达质粒pET15b—PEP-1-CAT重组成功。SDS—PAGE和Western blot结果表明，PEP-1-CAT在E．coli中获得了高效表达，经Ni^2＋ -NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了融合蛋白PEP-1-CAT，并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性，活性值为77．1U／g。将其加入到体外培养的内皮细胞培养基中，发现它能以剂量依赖及时间依赖的方式转导入细胞内，并能保持酶活性达48h。结论：PEP-1-CAT融合蛋白能高效地转导入人脐静脉内皮细胞，为防治各种与氧化应激损伤有关的疾病开辟了新的途径。     

pET15b-EGFP原核表达载体的构建及其表达和纯化

目的:利用中间载体pGEM-T easy vector构建表达型载体pET15b-EGFP,在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白EGFP并将其纯化。方法:以质粒pLEGFP-C1为模板采用聚合酶链反应(PCR)的方法特异性扩增EGFP cD-NA序列,利用Taq DNA聚合酶的非模板依赖性末端转移酶活性催化PCR扩增的EGFP序列和三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,在EGFP序列两3’端加“A”,将纯化后的EGFP序列与中间载体pGEM-T easy vector连接后转化感受态大肠杆菌DH5α,经蓝白筛选,挑取白色单菌落进行扩增、酶切鉴定,正确重组的质粒命名为pGEM-T-EGFP。用XhoI和BamH I分别双酶切pGEM-T-EGFP和pET15b,低熔点琼脂糖回收EGFP cDNA和线性化的pET15b片段后将两片段相连,转化感受态大肠杆菌DH5α并对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序,获取正确重组的表达型质粒并命名为pET15b-EGFP。将正确重组的质粒pET15b?EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。利用表达蛋白N端的组氨酸“标签”(H is-tag)进行N i2+-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE和W estern b lotting鉴定纯化蛋白质。结果:经测序证实重组质粒pET15b-EGFP中的EGFP cDNA序列与从C lontech公司购买的质粒pLEGFP-C1中的EGFP cDNA序列完全一致,从而成功构建了表达型重组质粒pET15b-EGFP。pET15b-EGFP转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)并经诱导后得到高效表达,表达量可达66 mg/100 m l菌液,SDS-PAGE和W estern b lotting显示纯化蛋白为目的蛋白EGFP。结论:表达型重组质粒pET15b-EGFP的成功构建和表达、纯化为细胞穿透肽-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。     

肌钙蛋白Ⅰ的可溶性表达及纯化研究

目的: 提高肌钙蛋白Ⅰ(troponin Ⅰ,Tn Ⅰ)在大肠杆菌中的可溶性表达并进行分离纯化.方法和结果: 将质粒CBD-intein/pTWIN1和Tn Ⅰ/pET28a分别用Nco Ⅰ及Xho Ⅰ双酶切,回收.回收后的载体CBD-intein/pTWIN1与Tn Ⅰ片段用T4 连接酶连接,得到重组质粒CBD-intein-Tn Ⅰ/pTWIN1.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达得到融合蛋白CBD-intein-Tn Ⅰ.经chitin亲和层析和intein介导的融合蛋白自我裂解,纯化得到重组Tn Ⅰ.结论: 通过CBD-intein融合表达系统一步式裂解分离纯化能方便快捷地获得可溶性的Tn Ⅰ.     

~1PEP-1-p27mt融合蛋白的原核表达及纯化

目的:构建融合蛋白PEP-1-p27mt的原核表达质粒,并进行诱导表达和蛋白纯化。方法:通过PCR方法自pORF9-hp27mtv21质粒中扩增p27mt基因,克隆入中间载体pGEM-TEasy Vector。经XhoI和BamH1双酶切后,构建原核表达载体pET15b-pep-1-p27mt,经测序证实构建成功后转化EcoliBL21(DE3)pLysS,表达PEP-1-p27mt融合蛋白,经Ni-NTA树脂亲合层析,纯化产物进行SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定。结果:成功构建PEP-1-p27mt融合蛋白原核表达载体,表达并纯化了相对分子量为32×103的PEP-1-p27mt融合蛋白。结论:PEP-1-p27mt融合蛋白表达载体的构建及目的蛋白的表达纯化,为体内应用细胞周期抑制蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的研究提供了理论基础。     

细胞穿透肽PEP-1介导人过氧化氢酶转导入在体大鼠心肌组织

目的：观察PEP-1介导CAT转导人心肌组织的能力,检测转导的CAT是否具有天然活性．方法：用基因工程手段表达并纯化出PEP-1-CAT和CAT融合蛋白．以生理盐水为对照,分别从SD大鼠尾静脉注射500μg PEP-1-CAT和CAT融合蛋白,在0．5,1,2,4,8,24h时将其处死,取其心脏,免疫荧光及Western Blot检测CAT的转导能力,用试剂盒检测心肌CAT的酶活性．结果：SDS—PAGE和Western Blot证实目的蛋白PEP-1-CAT和CAT得到了高表达,且纯度在90％左右．生理盐水组及CAT组,荧光显微镜下均未见到绿色荧光,Western Blot亦未检测到目的蛋白;PEP-1-CAT各组均可观察到绿色荧光,且8h时强度最大,同时Western Blot也检测到了目的蛋白,8h时量最多;酶活性检测显示,CAT组与生理盐水对照组差别无统计学意义,而PEP-1-CAT组随着时间的延长,心肌组织中CAT的活性逐渐增加,在8h时达到峰值,为对照组的4．20倍．结论：PEP-1能够介导CAT以天然活性方式转导入大鼠心肌组织,且其转导呈时间依赖性．     

PEP-1介导过氧化氢酶对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的:研究细胞穿透肽PEP-1携带过氧化氢酶(CAT)穿透大鼠离体心肌的能力,并探讨PEP-1-CAT融合蛋白预处理对大鼠离体心肌缺血-再灌注损伤的保护作用及其机制。方法:建立大鼠离体心脏Langendorff灌流模型,随机分为5组(n=10):缺血-再灌注组(I/R组)行平衡30 min、停灌30 min与再灌注60 min,CAT组、PEP-1-CAT融合蛋白预处理组(A、B、C、D组)在平衡15 min后依次以10,5,10,20μmol/L的融合蛋白预处理15 min,停灌、复灌与I/R组相同。记录各组左室舒张末压(LVEDP)、左室收缩压(LVSP)、左室内压最大变化速率(±dp/dtmax)及冠脉流量(CF)变化,测定平衡15 min时、再灌注15 min时冠脉流出液乳酸脱氢(LDH)活性。测定再灌注60 min时心肌丙二醛(MDA)含量。结果:PEP-1-CAT融合蛋白能高效转导入离体心肌组织并呈现剂量依赖性。在平衡15 min末,各组LVEDP、LVSP、±dp/dt max以及LDH活性比较差异无统计学差异(P>0.05)。与I/R组比较,B、C、D组在再灌注后各时间点LVEDP降低(P<0.01),LVSP、±dp/dt max以及CF升高(P<0.01),灌注15 min时冠脉流出液LDH活性降低(P<0.01),再灌注后60 min心肌MDA含量降低(P<0.01)。CAT处理组所有结果和对照组相比无统计学意义(P>0.05)。结论:PEP-1-CAT融合蛋白能高效转导入离体心肌织并对大鼠离体心肌缺血-再灌注损伤具有明显的保护作用,将为其治疗心肌缺血再灌注损伤奠定坚实的实验基础。