siRNA干扰Geminin基因对脑胶质瘤放疗敏感性的影响

目的 观察敲低Geminin对人脑胶质瘤细胞放疗敏感性的影响。方法 利用GEPIA和CGGA数据库分析Geminin在脑胶质瘤组织中的表达及与生存期的相关性。实验分为两组：si-GL2组(对照组)和si-Gem组(干扰组),设计siRNA干扰序列(si-Gem)和阴性对照序列(si-GL2),分别转染脑胶质瘤细胞LN229和U87,qRT-PCR和Western blot检测转染效率及蛋白表达水平。流式细胞术检测碘化丙啶(PI)染色后DNA含量分布,进而分析敲低Geminin对DNA再复制的影响。通过AnnexinⅤ-FITC/PI法,用流式细胞术检测敲低Geminin对细胞凋亡的影响。CCK-8细胞增殖实验检测敲低Geminin对胶质瘤细胞LN229和U87放疗敏感性的影响。Western blot检测Geminin相关分子Cdt1和DNA相关损伤蛋白γ-H2AX的表达水平。结果 脑胶质瘤组织中Geminin的表达水平高于癌旁正常组织,且Geminin表达越高,脑胶质瘤患者预后越差(P<0.05)。与si-GL2组相比,si-Gem组Geminin在LN229和U87细胞中的表...     

Geminin基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)Geminin基因的表达观测VSMCs增殖情况及表型标志物。方法分别利用RT-PCR,Western blot检测VSMCs中Geminin基因、蛋白表达的变化,筛选出干扰效果最为显著的序列用于构建慢病毒包裹的稳定干扰模型。应用[3H]-TdR、EdU掺入试验检测VSMCs增殖的情况;同时使用Western blot分别检测干扰前后相关标志性基因的表达。结果①siRNA转染后,以第1亚组干扰效果最为显著,与另外2个阳性亚组及对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。②[3H]-TdR、EdU掺入实验显示:阳性干扰组的掺入量较两对照组明显升高(P<0.05)。③siRNA转染使Geminin基因表达减弱后,阳性组VSMCs合成型标志物骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达水平显著升高,收缩型标志物平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,α-Actin)表达水平明显降低,与对照组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 RNA干扰介导的Geminin基因沉寂可显著增强VSMCs的增殖能力,并有助于VSMCs的表型由收缩型向合成型转化。     

siRNA靶向抑制PDGFRB对人恶性脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用

目的应用微小RNA干涉从mRNA靶向抑制PDGFRB基因/产物对人恶性神经胶质瘤细胞T98G、U87MG增殖作用的影响。方法脂质体转染法转染PDGFRB特异性siRNA;以传统半定量RT-PCR法及实时定量PCR观察应用特异性siRNA阻断PDGFRB的表达变化;采用MTT法检测恶性脑胶质瘤细胞的体外增殖。结果siRNA(PDGFRB-HSS107758和PDGFRB-B12)可明显抑制PDGFRB的表达(抑制率70%);PDGFRB特异性siRNA可抑制恶性胶质瘤细胞的体外增殖,对U87MG细胞增殖抑制作用显著(P<0.05)。结论PDGFRB特异性siRNA可以抑制恶性脑胶质瘤细胞的体外增殖。     

IL-12siRNA对脑胶质瘤细胞增殖与分化的影响

目的 观察IL-12 siRNA对脑胶质瘤细胞增殖与凋亡的影响.方法将含有IL-12 siRNA的表达质粒稳定转染人脑胶质瘤细胞,应用MTT法及AO/EB染色观察脑胶质瘤细胞的增殖与凋亡情况.结果转染后,MTT法显示IL-12 siRNA组中的细胞生长受抑明显,AO/EB染色显示IL-12siRNA组的凋亡率较阴性对照组及空载体组高.结论 IL-12siRNA靶向干扰了IL-12蛋白的表达,并对脑胶质瘤细胞具有抑制增殖和促进凋亡的作用.     

CDK4和Geminin在胶质瘤中的表达及其与预后的关系

目的：探讨细胞周期依赖性激酶4（cyclin-dependent kinase 4,CDK4）和Geminin在胶质瘤中的表达及其临床病理意义。方法：采用免疫组织化学方法,检测70例胶质瘤中CDK4和Geminin的表达,分析CDK4和Geminin的表达和其相关性,以及二者与胶质瘤临床病理因素及生存时间的关系。 结果：CDK4、Geminin在胶质瘤中的总阳性率分别为70.0%（49/70）、75.7%（53/70）;Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中CDK4阳性率分别为52.8%（19/36）、84.6%（22/26）、100.0%（8/8）,Geminin阳性率分别为58.3%（21/36）、92.3%（24/26）、100.0%（8/8）,CDK4和Geminin在不同级别胶质瘤中的表达有显著差异（P＜0.05）。且二者表达呈正相关;CDK4、Geminin阳性表达与肿瘤大小及细胞核分裂像多少有关（P＜0.05）,与患者年龄、性别以及肿瘤组织有无坏死无关（P＞0.05）;Kaplan-Meier单因素统计分析结果显示 CDK4、Geminin阳性表达组的患者术后生存时间明显短于CDK4、Geminin阴性表达组（P＜0.001）。结论：CDK4和Geminin表达与胶质瘤的分级、预后有关,联合检测CDK4和Geminin有助于判断胶质瘤恶性程度及评估预后。     

RNA干扰沉默Bmi-1基因观察胶质瘤细胞凋亡状况的初步研究

目的:初步探讨Bmi-1基因对胶质瘤细胞凋亡状况的影响?方法:采用siRNA技术干扰沉默U251胶质瘤细胞中Bmi-1基因,RT-PCR法检测干扰效果,流式细胞仪检测U251细胞的凋亡状况, one way ANOVA 和t检验进行统计学分析?结果:RT-PCR显示U251细胞RNA干扰组Bmi-1 mRNA凝胶电泳条带呈弱阳性, 阴性对照组和未处理组Bmi-1 mRNA条带呈强阳性,灰度比统计分析,差异具有统计学意义,siRNA可以明显降低U251细胞中Bmi-1基因的表达;流式细胞仪显示干扰组U251细胞的凋亡率为(32.53±6.33)%,高于阴性对照组的凋亡率(21.91±5.63)%,统计分析其差异具有统计学意义?结论:Bmi-1基因可以抑制胶质瘤细胞的凋亡,有可能促进了胶质细胞瘤的发生?发展?     

干扰RNA沉默tpd52基因对胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的 探究沉默tpd52基因表达后对胶质瘤U87细胞增殖、周期及凋亡的影响.方法 将携带着shRNA-tpd52(抑制tpd52的核苷酸序列)、shRNA-NC(阴性对照的核苷酸序列)的慢病毒体外转染胶质瘤细胞系U87.在转染48 h后荧光显微镜下观察表达GFP细胞数量,采用荧光定量PCR、Western blot分别检测TPD52 mRNA及蛋白表达量,MTT检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞周期分布,Annexin V和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡.结果 U87细胞转染率>90%,与shRNA-NC组及空白对照组相比较,shRNA-tpd52组细胞TPD52 mRNA及蛋白表达量明显减少(P<0.01),而且细胞增殖能力明显下降,差异有统计学意义(P<0.05);细胞周期被阻滞在G0/G1期、细胞凋亡比例明显增加(P<0.05).结论 沉默胶质瘤细胞中tpd52基因表达后,可以有效抑制细胞增殖,阻滞细胞周期,促进细胞凋亡.     

ADAMDEC1对人脑胶质瘤U87细胞生物学行为的影响

目的 研究解聚素金属蛋白酶家族癸蛋白1(ADAM-DEC1)对人脑胶质瘤U87细胞增殖、黏附、侵袭、迁移和凋亡的影响及可能机制.方法 实验组(ADAMDECl-RNAi)人脑胶质瘤U87细胞用携带特异性siRNA的慢病毒感染来下调ADAMDEC1的表达,对照组(CONTROL-RNAi)用阴性对照慢病毒感染,通过观察GFP荧光的表达情况来判定转染效率,采用Real-time PCR和Western blot法分别从mRNA和蛋白质水平检测稳定转染的U87细胞ADAMDEC1基因的表达情况,CCK-8法检测下调ADAMDEC1表达后细胞增殖及黏附能力的变化,Transwell法检测细胞侵袭及迁移能力的变化,流式细胞技术检测细胞凋亡的变化.结果 与CONTROL-RNAi相比,ADAMDECl-RNAi mRNA及蛋白表达水平均明显降低(P<0.01) ;CCK-8法检测结果显示下调ADAM-DEC1表达能够显著抑制U87细胞的增殖(P< 0.05)和黏附能力(P<0. 01) ;Transwell检测结果显示下调ADAMDEC1表达能够显著抑制U87细胞的侵袭和迁移能力(P<0. 01);流式细胞术检测结果显示下调ADAMDEC1表达能够促进 U87细胞的凋亡(P<0.01).结论 在体外细胞培养试验中,下调ADAMDEC1表达能够显著抑制U87细胞的增殖、黏附、侵袭、迁移能力,促进U87细胞的凋亡.     

RNA干扰沉默claudin-4基因表达对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响

目的:采用RNA干扰技术沉默claudin-4基因在子宫内膜癌细胞Ishikawa中的表达,探讨claudin-4表达下调对Ishikawa细胞增殖力和侵袭力的影响;比较RNA干扰前后差异表达的蛋白质,探讨claudin-4基因在子宫内膜癌发病机制中的作用。方法:设计靶向claudin-4的小干扰RNA(si RNA),转染人子宫内膜癌细胞Ishikawa。采用CCK分析法检测干扰前后细胞增殖能力的变化,Transwell小室实验检测干扰前后细胞侵袭能力的变化。应用双向凝胶电泳和质谱分析检测RNA干扰前后蛋白质表达的差异。结果:claudin-4基因沉默可以显著降低子宫内膜癌细胞的增殖能力和侵袭能力(P<0.05)。应用蛋白质组学技术比较claudin-4 si RNA干扰前后蛋白质表达的差异,共鉴定出5种差异蛋白质。结论:claudin-4基因具有促进子宫内膜癌细胞增殖和细胞侵袭的作用,这种作用可能通过改变差异蛋白的表达得以实现。     

RNA干扰技术用于survivin基因表达的研究

目的：构建pSUPER-SVV表达载体,并在真核细胞中进行表达,验证survivin基因表达是否受到抑制。方法：设计特异性以survivin基因为靶序列的寡核苷酸序列,退火后将其连接于pSUPERbasic载体中,经测序鉴定插入序列的正确性。以脂质体转染方法将pSUPER-SVV干扰质粒转染人类宫颈癌（HeLa）细胞,应用流式细胞术和RT-PCR方法检测survivin基因的表达情况。结果：成功构建survivin的RNAi表达载体。该载体可以使HeLa细胞中survivin基因在mRNA转录水平明显降低,与转染空质粒组相比差异具有显著性（P<0.05）。利用流式细胞术检测蛋白表达水平,转染pSUPER-SVV组抑制率可达31.62%,与转染空质粒组相比差异具有显著性（P<0.001）。结论：成功构建干扰survivin基因表达的载体,转染HeLa细胞后survivin基因在mRNA转录水平、蛋白表达水平均受到明显抑制。     

RNA干扰抑制胰岛素样生长因子-1表达并诱导胶质瘤细胞凋亡

目的研究RNA干扰效应对胶质瘤C_6细胞株胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因表达的抑制作用及其对C_6细胞凋亡诱导的作用。方法体外化学合成靶向IGF-1基因的小干扰RNA(siRNA),采用脂质体法将siRNA以不同浓度梯度转染C_6细胞株,设非特异的siRNA阳性对照组和未转染siRNA的阴性对照组;同时使用绿色荧光素标记的siRNA异硫氰酸荧光素(FITC)-siRNA转染细胞,于荧光显微镜下观察siRNA转染效率;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)半定量检测siRNA对IGF-1基因表达的抑制作用;流式细胞术检测siRNA诱导细胞凋亡作用。结果荧光显微镜下荧光素标记的siRNA转染组可见到细胞内清晰的绿色荧光,脂质体Oligo- fectamine~(TM)2000的转染效率可＞95%;化学合成的siRNA明显抑制IGF-1 mRNA的表达,各特异性siRNA不同浓度转染组IGF-1 mRNA表达水平可下调约40%～70%,流式细胞术检测转染IGF1-siRNA细胞凋亡率为14．14%,明显高于对照组的0．95%。结论在细胞水平上,化学合成的靶向IGF-1的siRNA可明显抑制IGF-1基因的表达,引致胶质瘤细胞凋亡率明显上升,为进一步利用RNA干扰进行胶质瘤的基因治疗研究奠定基础。     

新靶点CyclinE干扰RNA对人脑胶质瘤侵袭能力的影响

目的：构建人CyclinE新靶点的干扰RNA真核表达载体,观察CyclinE表达受抑制后的人脑胶质瘤细胞的侵袭能力的变化。方法构建4个新靶点CyclinE干扰RNA的真核表达载体后,用双酶切和碱基序列测定,转染载体到胶质瘤U251细胞株,将其分为U251组、PNC-U251组、PCyclinE-1-U251组、PCyclinE-2-U251组、PCy-clinE-3-U251组、PCyclinE-4-U251组。通过RT-PCR的结果检测各组CyclinE mRNA的表达量,将干扰效果最好的一组用Transwell小室法检测侵袭能力的变化。结果成功构建了新靶点CyclinE干扰RNA真核表达载体即PCyclinE-1、PCyclinE-2、PCyclinE-3、PCyclinE-4,而且CyclinE mRNA表达受到抑制,其中PCyclinE-1-U251组的穿膜细胞数为（45.4±2.7）个,U251组和PNC-U251组的穿膜细胞数分别为（75.2±2.9）个和（74.4±3.5）个,U251组和PNC-U251组的穿膜细胞数比较,差异无统计学意义（t =1.23,P=0.31）,PCyclinE-1-U251组和U251组的穿膜细胞数比较,差异有统计学意义（t =15.00,P=0.00）,PCyclinE-1-U251组和PNC-U251组的穿膜细胞数比较,差异有统计学意义（t =13.81,P=0.00）。结论本实验构建了新靶点CyclinE干扰RNA真核表达载体,PCyclinE-1-U251细胞侵袭能力减弱。     

小干扰RNA体外抑制HBs-GFP融合基因的表达

目的:利用增强型绿荧光蛋白(EGFP)和小发夹RNA(shRNA)表达载体技术,建立一种行之有效且相对经济的验证siRNA的方法.方法:将HBV S基因融合到EGFP中,建立HBs-GFP融合基因表达载体;同时构建带U6 27 RNA转录启动子的shRNA表达载体pAVU6 4sh357.二载体共转染HepG2细胞后,流式细胞仪检测HBs-GFP蛋白的荧光强度;同时RT-PCR和实时定量PCR法检测HBs-GFP mRNA水平的改变.结果:小干扰RNA有效抑制目的基因的表达,共转染后第72 h荧光蛋白抑制率为55.4%;HBs-GFP 融合基因的RNA表达受到显著抑制,抑制率达到90%.结论:载体法表达的小干扰RNA体外显著抑制HBs-GFP融合基因的表达.     

应用RNA干扰抑制目的基因在小鼠体内表达

目的研究RNA干扰(RNAi)对体外和体内基因表达的沉默作用。方法以PCR方法从基因组DNA中克隆出依赖于RNA聚合酶Ⅲ的H1启动子,并用于驱动RNAi片段的合成;构建特异性针对目的基因(绿色荧光蛋白,GFP)的RNAi载体(Pi)。将RNAi干扰载体和GFP载体转染NIH3T3细胞,应用荧光显微镜观察、RT-PCR、流式细胞技术(FACS)分析上述细胞中RNAi对目的基因GFP表达的抑制效果,进一步在个体水平将RNAi载体注入小鼠体内,研究RNAi对GFP表达的抑制情况。结果RNAi能有效地使NIH3T3细胞中GFP表达量降低约60%以上,并能有效地抑制GFP在转基因小鼠体内的表达。结论RNAi技术能抑制目的基因在体内外的表达,是一种有效的基因治疗工具。     

靶向Cyclin D1基因RNA干扰对肝癌细胞增殖和Mdm2等基因表达影响的研究

目的 探讨Cyclin D1表达下调对Mdm2等基因表达及人肝癌细胞增殖的影响.方法 用脂质体将Cyclin D1-siRNA转染人肝癌细胞株Hep3B细胞.实验分为空白对照组、阴性对照siRNA组、Cyclin D1-siRNA组.采用RT-PCR和Western blot检测Cyclin D1、Mdm2、Mdm4、P53和P21表达,流式细胞仪检测细胞周期,MTT检测细胞活力,TUNEL检测细胞凋亡.结果 与空白对照组和阴性对照siRNA组相比,Cyclin D1-siRNA组P53和P21表达上调(P＜0.05),Cyclin D1、Mdm2和Mdm4表达下调(P＜0.01);3组细胞周期G1、S及G2期均无明显差异(P＞0.05);Cyclin D1-siRNA组较其他两组细胞活力明显减弱(P＜0.01),细胞凋亡明显增强(P＜0.01).结论 Cyclin D1表达下调能抑制Mdm2和Mdm4的表达,并能上调P53和P21的表达;Cyclin D1表达下调能抑制肝癌细胞的增殖并促进其凋亡.     

RNA干扰抑制肝癌细胞KDR基因表达的实验研究

目的 通过研究RNA干扰(RNAi)对肝癌细胞激酶功能区受体(kinase domain receptor,KDR)基因表达的抑制,为肝癌基因治疗提供理论依据.方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测KDR在肝癌细胞系HHCC、HepG2、Hep-6及正常肝细胞L-02的表达情况,筛选KDR高表达细胞株.设计构建针对KDR的靶向小干扰RNA(siRNA)质粒载体,通过脂质体转染高表达细胞株HHCC,观察其干扰效果.细胞计数法观察KDR-siRNA对HHCC细胞生长的影响.结果 酶切鉴定、DNA测序分析证实重组质粒构建成功,分别命名为KDR-siRNA1、KDR-siRNA2和KDR-siRNA3.荧光定量PCR结果显示:3个KDR-siRNA转染的HHCC细胞株KDR的表达明显受到抑制,抑制率分别为68.86%、82.63%和64.47%,其中KDR-siRNA2抑制作用最为明显;转染阳性和阴性对照组载体的HHCC细胞和未转染的HHCC细胞生长趋势较为一致,且生长速度明显高于转染3种KDR-siRNA表达载体的HHCC.从接种第2天开始,KDR-siRNA转染组与对照组比较,细胞增殖明显受到抑制(P＜0.01).结论 KDR靶向RNAi重组质粒载体能有效抑制肝癌HHCC细胞KDR基因的表达和细胞增殖,为探索KDR介导的肿瘤基因治疗的新途径奠定了实验基础.     

RNAi沉默中期因子基因表达对胃癌细胞黏附和侵袭力的影响

目的:探讨中期因子(midkine,MK)基因小干扰RNA对胃癌细胞生物学行为的影响.方法:培养人胃癌BGC-823、HGC-27、MGC-803及SGC-7901细胞株,以荧光实时定量PCR方法检测中期因子基因mRNA表达;筛选出中期因子表达最高者.采用中期因子基因小干扰RNA转染胃癌细胞株,分别以荧光实时定量PCR和免疫荧光方法观察中期因子基因mRNA和蛋白水平,然后以四唑蓝(MTT)比色法检测细胞黏附性,以Boyden方法检测癌细胞侵袭力.结果:4株胃癌细胞中,中期因子均有不同程度的表达,以胃癌BGC-823细胞最高;以MK siRNA转染胃癌BGC-823细胞后,癌细胞中期因子基因mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性;转染组细胞黏附数量明显下降,细胞侵袭力明显下降.结论:中期因子基因在胃癌细胞黏附和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染胃癌细胞,可抑制胃癌细胞黏附和侵袭能力.