利用PCR产物快速构建免HPRT基因无启动子打靶载体

目的探讨构建兔HPRT基因打靶载体的方法,为下一步获得兔HPRT基因敲除动物模型和转基因兔奠定基础。方法首先在已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HPRT）基因BAC克隆（LBNL1-304M19）的基础上,利用Red重组系统,从此克隆上将一段12．5kb无启动子的HPRT基因组片段克隆到pKS-质粒上,产生pKS—rHPRT质粒。然后基于pKS-rHPRT和pIGCN21质粒,通过PCR的方法获得两个不同的带有50bp HPRT基因同源序列的IRES-eGFPCre—Frt／Neo／Frt同源重组片段,最终构建HPRT基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体。结果PCR、限制性内切酶及DNA序列测定,表明载体构建成功。结论成功快速地构建了HPRT基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体。同时对利用同源重组技术敲除或插入DNA片段的效率进行了研究。     

弓形虫GRA1基因变异及真核表达载体的构建

目的：构建弓形虫致密颗粒抗原1（ GRA1）基因真核表达质粒。方法：根据GRA1基因已知序列,设计一对引物。用PCR技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA1基因片段,插入pcDNA3质粒,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经酶切及PCR鉴定、测序。结果：从弓形虫RH株基因组中扩增出775 bp的GRA1基因,测序显示该基因存在一135 bp的插入序列,使得所得PCR产物分子量大于预期值（628 bp）。该插入序列造成GRA1基因移码突变。结论：首次报道了变异的弓形虫RH株GRA1基因并构建了该变异基因的重组表达质粒。     

利用PCR产物快速构建兔HPRT 基因无启动子打靶载体

目的 探讨构建兔HPRT基因打靶载体的方法,为下一步获得兔 HPRT基因敲除动物模型和转基因兔奠定基础.方法 首先在已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HPRT)基因BAC克隆(LBNL1-304M19)的基础上,利用Red重组系统,从此克隆上将一段12.5 kb无启动子的HPRT基因组片段克隆到pKS-质粒上,产生pKS-rHPRT质粒.然后基于pKS-rHPRT和pIGCN21质粒,通过PCR的方法获得两个不同的带有50 bp HPRT 基因同源序列的IRES-eGFPCre-Frt/Neo/Frt同源重组片段,最终构建 HPRT 基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体.结果 PCR、限制性内切酶及DNA序列测定,表明载体构建成功.结论 成功快速地构建了HPRT 基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体.同时对利用同源重组技术敲除或插入DNA片段的效率进行了研究.     

卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体的构建及鉴定

目的 构建卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体.方法 体外培养卡片介苗菌株并提取基因组DNA,扩增Hsp16.3基因两侧序列5′-Hsp16.3和3'-Hsp16.3,分别插入到pKO质粒载体预定位点中构建Hsp16.3基因置换型打靶载体,筛选并进行PCR、双酶切鉴定及测序鉴定.结果 构建的卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体,经PCR、双酶切鉴定及测序证实pKO质粒中的2个插入片段为所需目的基因.结论 成功构建出卡介苗菌株Hsp 16.3基因打靶载体.     

弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因的克隆、鉴定与生物信息学分析

目的 克隆并鉴定弓形虫PRU株表面抗原SAG2C基因序列和cDNA序列,对比不同毒力弓形虫株(PRU、RH、ME49)中SAG2C基因序列,进行生物信息学分析.方法 根据SAG2C基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从Prugniaud(PRU)株弓形虫基因组DNA和总RNA中扩增SAG2C基因,克隆入pMD19-T载体并进行序列测定.应用DNAMAN软件、NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析3种虫株之间SAG2C基因的同源性;利用生物信息学网站ExPASy(http://us.expasy.org/)对获得的基因及推导出的氨基酸序列进行生物信息学分析.结果 PCR扩增得到弓形虫PRU株SAG2C基因及其全长cDNA序列,酶切及PCR鉴定获得了正确的重组质粒,测序结果表明,获得SAG2C基因序列1 225 bp,全长cDNA序列1 095 bp.编码364个氨基酸.同源性分析显示,弓形虫Prugniaud株和RH株SAG2C基因同源性为97.14%:Prugniaud株与ME49株cDNA序列同源性为96.89%;编码氨基酸序列同源性为92%.N端为信号肽,C端疏水序列预测它为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白,存在13个潜在抗原表位及多个保守功能区域.结论 成功克隆了弓形虫缓殖子期特异抗原SAG2C基因序列及其全长cDNA序列,序列分析显示其为糖基磷脂酰肌醇固着蛋白.     

小鼠β2m基因打靶载体的构建及序列分析

目的 采用分子生物学技术，构建小鼠β2m基因打靶载体，为进一步进行胚胎干细胞基因敲除、建立β2m基因缺陷型干细胞奠定基础。方法 通过设计和合成引物，经PCR从小鼠β2m-pSV2ΔHXgpt基因组克隆分别扩增小鼠β2m的4.2kb和0.8kb片段作为同源臂，将其分别插入载体pPNT的neo基因两侧，构建小鼠β2m基因替换型打靶载体pPNT-β2m。结果 经过PCR、限制性酶酶切鉴定，以及DNA序列分析，证实此两条同源臂为包含小鼠β2m前三个外显子在内的基因片段，证明载体构建成功。结论 PCR法构建基因打靶载体是新颖、简便而可靠的方法。     

刚地弓形虫SAG3基因体外扩增及生物信息学分析

目的获取刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株表面抗原SAG3目的基因片段,对其结构和功能进行生物信息学分析,预测其编码蛋白作为候选抗原基因的可行性。方法提取弓形虫的基因组DNA,自行设计一对寡核苷酸引物,PCR体外扩增SAG3基因,用生物信息学方法对SAG3蛋白的理化性质、结构和功能进行预测。结果扩增出的基因片段约1174bp,测序后鉴定其为弓形虫RH株SAG3基因片段。预测SAG3蛋白相对分子质量约为41785.2,能形成两个功能结构域,氨基酸序列的前38(或39)位为信号肽序列。通过多种预测方法分析SAG3氨基酸序列抗原表位可能位于第10、50、80、95、160、180、220、250、300、330和360位点内或附近。结论成功获得SAG3基因,为深入研究该基因结构奠定了基础。     

弓形虫SAG1、SAG3基因的克隆和复合基因SAG1/SAG3真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫表面抗原SAG1、SAG3复合基因的真核表达重组质粒,为弓形虫疫苗的研制作准备。方法提取弓形虫基因组DNA;用PCR技术扩增出表面抗原SAG1、SAG3的基因,再分别重组入pGEM-T克隆载体;将pGEM-SAG1和pGEM-SAG3重组质粒分别经酶切、纯化后定向亚克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体,经PCR、酶切及测序等方法对重组子进行鉴定。结果从弓形虫基因组DNA中扩增出SAG1、SAG3基因;构建了pGEM-SAG1、pGEM-SAG3克隆质粒;成功构建pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3真核表达复合基因质粒,测序表明目的基因定向正确连接。结论构建了pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3复合基因表达质粒,为今后研制弓形虫复合多价疫苗提供候选抗原奠定了实验基础。     

小鼠锌指蛋白基因Znf230条件基因打靶载体的构建

目的 构建用于小鼠锌指蛋白基因Znf230条件基因打靶的载体,为产生Znf230基因敲除的小鼠模型准备条件.方法 设计和合成引物,经PCR从小鼠的基因组中扩增出5'同源臂、3'同源臂及锚定序列,长度分别为4,4,1 kb的片段,反向插入pBS载体的neo基因的两侧,从而构建小鼠Znf230条件基因打靶载体Znf230-pBS(5).结果 经过限制性内切酶及DNA测序鉴定,证实该条件基因打靶载体含有的同源序列与Genebank公布的基因序列一致,表明载体构建成功.结论 PCR技术和定向克隆技术是构建条件基因打靶载体简单而可靠的方法.运用该技术可获得小鼠锌指蛋白基因Znf230的条件基因打靶载体.     

弓形虫RH株和B36株致密颗粒蛋白1基因的克隆和序列分析

目的分析弓形虫2个不同分离株RH株和B36株致密颗粒蛋白1（GRA1）基因的异同．方法应用PCR技术,从弓形虫RH株、B36株分别扩增出致密颗粒蛋白1（GRA1）目的基因片段．将此目的基因片段插入PCR产物克隆专用载体pMD-18-T中,转化大肠埃希菌JM109,PCR鉴定其准确性并测序．DNAstar软件序列分析结果．结果获得弓形虫两个不同分离株RH株、B36株GRA1目的基因片段pMD-18-T／GRA1重组质粒．序列测定表明GRA1目的基因片断与GenBank报道的RH株GRA1基因（注册序列号：EU983103．1）有99％的同源性．经DNAstar5．0软件分析,发现两种虫株GRA1基因序列（R—RH株、B—B36株）有100％的相似性．结论GRA1基因在2个不同分离虫株之间无明湿差异．具有较高的保守性．     

小鼠釉基质丝氨酸蛋白酶基因打靶载体的构建及鉴定

目的：对牙釉质丝氨酸蛋白酶（EMSP1）基因 进行体外扩增，构建基因打靶载体，利用基因打靶技术建立转基因动物模型，研究EMSP1生理功能和病理学意义。方法：根据EMSP1的DNA序列，采用Oligo 6.0软件设计两对引物，以129品系小鼠基因组DNA为模板，分别扩增长为5 000 bp和1 700 bp片段作为同源长短臂。将其分插入通用型基因敲除载体pSSC-9的正向筛选基因neo两侧，用PCR方法、限制性酶切DNA 序列分析进行鉴定。结果：采用双酶切鉴定，阳性重组克隆分别切出5000 bp和1700 bp片段，表明长短臂已克隆于载体中。DNA序列分析表明，成功构建 EMSP1基因打靶载体pSSC-9- EMSP1。结论：成功构建小鼠EMSP1基因打靶载体。     

小鼠Pkhd1条件性基因打靶载体的构建

目的构建小鼠Pkhd1条件性基因打靶载体,为建立Pkhd1条件性敲除小鼠模型奠定基础。方法以正常小鼠(129xl/SvJ)基因组DNA为模板,扩增小鼠包括第6号外显子的Pkhd1基因部分序列,通过引入LoxP和Neo基因等步骤,建立条件性敲除Pkhd1第6号外显子的条件性基因打靶载体。结果经多个限制性核酸内切酶酶切鉴定和测序证实,构建的小鼠Pkhd1基因条件性打靶载体符合设计要求。结论成功构建了小鼠Pkhd1条件性基因打靶载体,为建立Pkhd1基因条件性敲除小鼠打下了基础。     

Protective effect of DNA- mediated immunization with a combination of SAG1 and IL- 2 gene adjuvant against infection of Toxoplasma gondii in mice

Objective To characterize the immune response induced by SAG1 encoding plasmid combined with IL- 2 gene adjuvant in mice and to assess the protective effect of this vaccination against toxoplasmosis. Methods Mice were co- injected intramuscularly with plasmid encoding Toxoplasma gondii SAG1 plus murine IL- 2 expression vector at a dose of 100 μg. Booster immunizations were employed 2 more times at 3- week interval. As controls, mice were inoculated with PBS or empty plasmid pcDNA3. Humoral and cellular responses were assayed using ELISA for the determination of Ab, Ab isotype and IFN- γ, as well as IL- 4. To detect the integration and dissemination of DNA in the injected mice, PCR and in situ hybridization were performed. All mice were then infected with highly virulent RH tachyzoites of Toxoplasma gondii intraperitoneally. Results Significant increases in specific IgG levels were observed in mice after immunization three times with SAG1 expression plasmid. With respect to the IgG isotype, co- inoculation of IL- 2 expression plasmid enhanced the level of IgG2a and the production of IFN- γ. Challenging mice by vaccinating with combined plasmids with RH tachyzoites resulted in prolonged survival. Conclusion Humoral and cytokine responses elicited by SAG1 DNA immunization can be modulated by co- inoculation with IL- 2 expression plasmid. The use of DNA vaccine in combination with an appropriate cytokine gene to prevent T. gondii infection warrants further investigation.     

表皮葡萄球菌luxS基因敲除重组质粒的构建

目的构建1个含有luxS基因上、下游片段、抗卡那霉素基因的重组克隆质粒,用以敲除表皮葡萄球菌luxS基因。方法检索GenBank获得luxS基因序列以设计引物,以生物膜阳性表皮葡萄球菌基因组DNA为模板,采用高保真PCR扩增得到包含luxS基因上游片段、完整的luxS基因和luxS基因下游片段的长片段DNA;以pEASYT4质粒为模板扩增得到抗卡那霉素基因,再用内侧引物分别扩增luxS基因上、下游序列,按luxS基因上游片段＋抗卡那霉素基因＋luxS基因下游片段的顺序重组连接,转化JMl09感受态细胞,通过卡那霉素筛选、酶切分析和PCR一测序验证luxS基因敲除的重组克隆载体。结果经酶切后电泳验证重组质粒中各目的片段插入无误,PCR检测结果证明重组质粒luxS基因缺失,测序结果显示碱基无错配,含目的基因的重组质粒菌株在含卡那霉素培养平板内正常生长,证明插入的抗卡那霉素基因表达良好。结论表皮葡萄球菌luxS基因敲除重组质粒构建成功,为后续luxS基因缺陷株的构建奠定了基础。     

弓形虫复合基因SAG1-BAG1的构建、表达及重组抗原的免疫反应性分析

目的构建并表达弓形虫复合基因SAG1-BAG1及分析重组抗原的免疫反应性。方法利用PCR扩增弓形虫SAG1基因,利用RT-PCR扩增弓形虫BAG1基因,通过酶切连接分别将SAG1、BAG1基因克隆到pET28a表达载体中构建复合基因SAG1-BAG1。将质粒pET28a-SAG1-BAG1转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,Western-blot分析该重组蛋白的免疫反应性。结果复合基因SAG1-BAG1全长约1 407 bp,重组蛋白相对分子质量约为50 000,表达量约占菌体总蛋白的10%,Western-blot分析显示重组蛋白具有良好的免疫反应性。结论成功构建并表达弓形虫复合基因SAG1-BAG1。     

Construction and application of gene targeting replacement vector for mouse coagulation factor IX gene

Embryonicstem(ES)cellgenetargetingisoneofthemostwidelyusedbiotechniquesinmodernbiology.BasedonthehomologousrecombinationbetweentheendogenoushomologoussequencesandthegenomicDNAfragmentsinthevectorintroducedintoEScells,genetargetingallowsprecise,predeterminedchangesormodificationofthestructureorcontentsofthehostgenometobemade[IJ.ThephenotypiceffectsofthetargetedmodificationalsocanbeexpressedonwholeanimalbyES--blastocysttransferringandchimericbreedingprocedures.Theconstructsoftargetingvectori…     

截短形式弓形虫SAG1抗原在大肠杆菌中的可溶性高效表达、纯化及免疫反应性鉴定

目的 在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫SAG1基因的截短片段，并进行纯化及免疫反应性鉴定。方法 利用，VcoI、HindⅢ双酶切，从本室建立的pET-30a( )-SAG1重组质粒中获取SAG1基因的截短片段，并将目的片段连接到经同样双酶切的质粒pET32a中，构建表达重组质粒pET-32a( )-trSAG1。将重组质粒转入E．coli BL21中并进行诱导表达。表达蛋白经Ni—NTA agarose纯化后，Western—blotting分析其免疫反应性。结果 成功构建重组质粒pET-32a( )-trSAG1，通过IPTG诱导得到了以可溶性形式表达的重组SAG1蛋白，相对分子质量40000，Western—blotting结果显示纯化的重组蛋白具有良好的免疫反应性，ELISA试验表明重组SAG1蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别。结论 在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达了弓形虫SAG1基因的截短片段，表达蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别，有望成为一种有价值的诊断抗原。