加强病毒性肝炎的基础研究

我国乙型肝炎病毒（HBV）感染者占总人口约9．09％,丙型肝炎病毒（HCV）感染者占总人口约3．2％,严重危害我国人民的健康。慢性乙型肝炎（CHB）的抗病毒治疗药物主要包括普通干扰素仅、聚乙二醇化干扰素、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦,未来的发展方向是新型核苷类似物的研发;慢性丙型肝炎（CHC）的抗病毒治疗药物主要是普通干扰素α、聚乙二醇化干扰素与利巴韦林的联合治疗,未来的发展方向是针对NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂和针对NS5B的RNA依赖性RNA聚合酶的抑制剂的研制,但是,这些领域都是国外研究主导的,     

丙型肝炎治疗新药替拉瑞韦

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）是一种高度变异的正链RNA黄病毒,具有慢性转化率高、病变率高等特征。有研究表明,NS3/NS4A多功能蛋白酶是HCV复制所必须的,因而NS3/NS4A蛋白酶抑制剂在HCV治疗中的意义备受关注。替拉瑞韦（Telaprevir）是一种可逆的HCV NS3/NS4A蛋白酶抑制剂,动物试验和临床试验都表明它可以有效地直接攻击HCV并阻断其复制,对HCV的抑制作用持久,将成为丙型肝炎病毒的新型治疗药物。     

NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂——Telaprevir

Telaprevir是美国Vertex制药公司开发的一种丙型肝炎病毒（HCV）NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂，能抑制HCV的病毒复制。在欧洲和美国开展的国际多中心、双盲、对照III期临床试验结果显示，本品具有提高HCV感染患者持续病毒学应答（sustained viral response，SVR）的作用，确定了其治疗HCV感染的有效性及耐受性。2011年5月23日，美国FDA批准本品与聚乙二醇干扰素α和利巴韦林联用，用于治疗成人慢性丙型肝炎，商品名“Incivek”。     

丙型肝炎病毒NS5B RNA聚合酶抑制剂研究进展

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是引起慢性肝炎并进而发展为肝硬化和肝细胞癌的主要病原体之一。目前,临床上采用α-干扰素(IFN-α)和利巴韦林(RBV)联合用药治疗丙型肝炎,但有效率仅为40%~50%。寻找HCV特定靶向抗病毒治疗药物是抗HCV研究的重要方向,相应靶点包括NS2 和 NS3 蛋白酶,NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B,其中以NS5B RNA依赖性RNA聚合酶(NS5B RdRp)为靶标的抗HCV药物研究近年来颇受关注。本文在介绍NS5B及NS5B RdRp结构和功能的基础上,总结归纳以NS5B RdRp为靶点的HCV特定靶向抗病毒治疗药物研究的主要策略,以及近年来相关NS5B RdRp抑制剂的研究进展。     

HCV蛋白酶研究中病毒适应与免疫逃逸的关系

背景：丙型肝炎病毒（HCV）可在非结构性（NS）3／4A蛋白酶的人白细胞抗原（HLA）-Ⅰ限制性免疫优势表位发生突变，从而逃逸细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的识别，使病毒感染持续。然而，该突变并非不受限制，有时甚至完全缺如，实验室亦未能确定病毒突变的影响因素。目的：探讨在NS3蛋白酶1073—1081残基处CTL免疫优势表位的突变是否受病毒适应性的限制。患：获取慢性HCV感染6例（4例为HLA—A2＋）和急性丙肝感染1例（HLA—A2＋）静脉血。方法：扩增血清NS3／4A基因片断，克隆入真核生物表达质粒，然后测序并表达。应用人全血CTL和遗传免疫的HLA—A2转基因小鼠CTL，来确定在HLA—A2限制性NS3表位处CTL识别逃逸的突变是自然发生的还是人工诱导的。同时应用HCV复制子来检测逃逸突变对HCV蛋白酶活性及RNA复制的影响。     

丙型肝炎患者抗—NS5抗体与α—干扰素疗效关系的研究

目的：探讨丙型肝炎患者IgG抗－NS5抗体与α-干扰素疗效的关系。方法：以重组HCV抗原及NS3、NS5区段多肽作为抗原,以ELISA法检测丙型肝炎患者α-干扰素治疗前血清IgG抗－NS3、抗－NS5、抗－HCV抗体及其滴度。结果：α－干扰素治疗有效组的抗－NS5抗体的阳性率为80％（8／10）,无效组为20％（2／10）,两组比较有显著差异（P＜0．05）;有效组抗－NS5抗体滴度显著性高于无效组（P＜0．05）;有效组和无效组抗－NS3、抗－HCV本阳性率及抗体的滴度无明显差异（P＞0．05）。结论：治疗前血清IgG抗-NS5抗体可以作为α-干扰素疗效的一个预测指标。     

抗病毒治疗新希望

2011年,美国肝病研究学会（AASLD）在对慢性1型丙型肝炎病毒感染治疗指南的更新中,将两种口服抗病毒药物特拉波维（telaprevir）和博赛泼维（baceprevir）加入到丙型肝炎治疗的一线药物中,这两种药物是丙型肝炎病毒的特异性蛋白酶抑制剂,它们的应用使得人类在与丙型肝炎病毒的斗争中又多了一个新的强有力武器。     

慢性丙型肝炎患者对NS3／4A蛋白酶抑制剂预存耐药的研究

目的对我国南方184例无抗病毒治疗史的慢性丙型肝炎患者进行NS3／4A蛋白酶抑制剂相关耐药位点检测。方法NS3／4A蛋白酶抑制剂相关的耐药位点分析采用自行设计型别特异性引物行巢式PCR．PCR产物经纯化后采用直接测序法鉴定。结果184例样本中有162例扩增成功,其中125例（77．16％）患者共检出266个变异位点。HCVlb型A156S变异率为18．33％,V170I为16．67％;HCV2a型V36L、Q80G、V170I变异率为100％,A156S为64．29％;HCV6a型Q80K变异率为95．45％,V170I为98．86％。结论未使用抗病毒药的慢性丙型肝炎患者对NS3／4A蛋白酶抑制剂也存在预存耐药,变异率因HCV基因型而不同。1b型发生变异较少,HCV2a型及6a型普遍发生变异。     

稳定表达丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶的HepG2细胞克隆的建立

目的：构建丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶（scNS4A／NS3）的真核表达载体；建立重组质粒稳定转染的HepG2细胞克隆．方法：根据文献报道设计扩增scNS4A／NS3编码基因的引物，从HCV阳性患者血清中提取病毒RNA，RT-PCR方法扩增出scNS4A／NS3基因片段，BamH Ⅰ／HindⅢ双酶切后连接到经同样酶切的真核表达载体pcDNA3，1（-），转化菌株JM109感受态细胞，获得重组质粒pcDNA3．1（-）～scNS4A／NS3，经酶切鉴定及序列测定．将阳性重组质粒用脂质体法转染HepG2细胞，经持续G418压力选择和克隆化获得稳定转染的细胞系，用RT-PCR，IFA，Western-blot证实该稳定细胞系可以表达单链丝氨酸蛋白．结果：成功构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-scNS4A／NS3；建立了稳定转染的HepG2细胞克隆，命名为scpHepG2．结论：获得稳定的scpHepG2细胞克隆可表达单链丝氨酸蛋白，为下一步建立以细胞为基础的评价抗HCV丝氨酸蛋白酶药物系统奠定基础．     

慢性丙型肝炎直接抗病毒药物耐药研究进展

丙型肝炎病毒感染是导致肝硬化、肝细胞癌以及肝衰竭的主要原因之一。应用目前的标准治疗仅有约一半的患者可以清除病毒。现有多种直接抗病毒药物正在进行Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床试验,其作用靶点包括NS3蛋白酶、NS5A蛋白、NS5B RNA依赖的RNA聚合酶,它们通过与宿主细胞蛋白相互作用起到抑制丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)复制的作用。由于HCV具有高度异质性且复制快速,单一应用直接抗病毒药物极易发生耐药。本文就直接抗病毒药物研发现状、耐药特征以及影响因素做一介绍。     

酶联免疫吸附试验检测HCV NS3-4A蛋白酶活性

目的 建立一种检测丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ３－４Ａ丝氨酸蛋白酶的酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）方法,用于筛选ＨＣＶ蛋白酶抑制剂。方法 将闰ｐＭＡＬ－ｃ２／ＮＳ３－４Ａ转化到大肠杆菌Ｋ１２ＴＢ１中,经ＩＰＴＧ诱导表达,亲和层析柱纯化后得到麦芽糖结合的ＮＳ３／ＮＳ３－４Ａ融合蛋白,用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析其免疫学活性,并以酶联免疫吸附试验检测其生物学活性。结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析并用考马     

抗丙肝病毒药物研发的最新进展

丙型肝炎病毒(HCV)是引起慢性肝脏疾病的主要病因.目前尚无疫苗预防HCV感染.长效聚乙二醇Ⅰ型干扰素(pegIFN-α)和利巴韦林(RBV)联合应用是近十年来治疗丙肝的最佳药物,但仍有一半以上基因1型HCV感染者对该联合抗病毒治疗无效,并且IFN和RBV的毒副作用较大且疗程长达1年,因此极大地限制了其在临床上的应用....     

New hepatitis C therapies in clinical development

With the current standard of care for the treatment of chronic hepatitis C, a combination of pegylated interferon alfa and ribavirin, sustained virologic response rates can be achieved in approximately 50% of patients only. - Improved understanding of the viral life cycle has led to the identification of numerous potential targets for novel, direct-acting antiviral compounds. Inhibitors of the NS3/4A protease are currently the most advanced in clinical development. Recently completed phase 3 studies of the two protease inhibitors telaprevir and boceprevir, each given in combination with standard of care, yielded sustained virologic response rates in the range of 66-75% in treatment-naive patients and 59-66% in treatment-experienced patients with HCV genotype 1 infection. Studies of second-generation protease inhibitors, with the potential advantage of improved potency, drug metabolism and pharmacokinetics profile, are already underway. - Inhibitors of the HCV NS5A protein and NS5B polymerase are potentially active across different HCV genotypes and have shown promising antiviral efficacy in early clinical studies. Other emerging mechanisms include silymarin components and inhibitors of cell proteins required for HCV replication. - While improved formulations of current HCV therapies are also being developed, future hopes lie on the combination of direct-acting antivirals with the eventual possibility of interferon-free treatment regimens.     

氨基端不同二级结构的丙型肝炎病毒NS3/4A 复合体的丝氨酸酶活性差异研究

目的 探讨表达不同氨基端二级结构的丙型肝炎病毒非结构蛋白3/4A(HCV NS3/4A)各亚型丝氨酸酶活性及其对宿主细胞功能抑制作用的差异.方法 以pSG5/M-H05-5/4A为模板(A1-1),构建表达不同氨基端二级结构NS3/4A的点突变质粒,并分别命名为A1-2,A2-1,A2.2,B1-1,B1-2,B2-1,B2-2.Western印迹检测所有构建质粒的表达及各亚型顺式及反式NS3蛋白酶活性的差异.荧光素酶报告试验检测pSG5/M-H05-5/4A各个二级结构亚型对干扰素-β(IFN-β)产生及p53依赖的荧光素酶基因的转录活性的抑制作用以及各亚型之间抑制作用的差异.结果 Western印迹显示所有构建质粒均成功表达,而且A2-1和B2-1亚型NS3/4A存在不完全切割现象.表明与其他亚型相比,A2-1和B2-1顺式NS3丝氨酸蛋白酶活性较弱.与其底物NS5A/5BAC共表达后,A2-1和B2-1亚型未切割NS5A5B明显多于其他亚型,而切割 NS5A 则明显少于其他亚型.说明与其他亚型相比,A2-1和B2-1 亚型的反式NS3蛋白酶活性亦较弱.荧光素酶试验结果显示,所有亚型M-H05-5/4A均显著抑制IFN-β启动子活性(P＜0.01)和p53依赖的荧光素酶基因的转录活性(P＜0.01),A2-1和B2-1亚型的抑制作用显著弱于其他亚型(P＜0.05).结论 氨基端不同二级结构的HCV NS3/4A复合体具有不同的丝氨酸酶活性和宿主细胞功能抑制作用.     

慢性丙型肝炎治疗临床预测因素研究进展

慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染仍然是一个十分严重的全球公共卫生问题,并且其感染率有逐年上升的趋势。聚乙二醇干扰素联合利巴韦林(Peg-IFN/RBV)是当前慢性HCV感染推荐的标准治疗方案,由于其昂贵的治疗费用、严重的副作用以及一部分患者无效甚至病毒耐药而使得其在临床应用中受到一定的限制。随着新的治疗药物如HCV NS3/4A蛋白酶抑制剂的即将批准上市,新的治疗策略有可能很快用于治疗无应答的患者。因此,在初始治疗前或者在治疗早期能够准确地预测出哪些患者更有可能获得持续病毒学应答将具有重要的临床意义,这不但有利于个体化治疗决策的制定,而且有利于最佳治疗持续时间的优化。本文主要参照2010年公开发表的一篇相关英文文献,对目前慢性丙型肝炎治疗的临床预测因素研究进展进行综述。     

Direct-acting Antiviral Agents Resistance-associated Polymorphisms in Chinese Treatment-na?ve Patients Infected with Genotype 1b Hepatitis C Virus

Background:

It has been reported that several baseline polymorphisms of direct-acting antivirals (DAAs) agents resistance-associated variants (RAVs) would affect the treatment outcomes of patients chronically infected with hepatitis C virus (CHC). The aim of this study is to investigate the prevalence of DAAs RAVs in treatment-naïve GT1b CHC patients.

Methods:

Direct sequencing and ultra-deep sequencing of the HCV NS3, NS5A, and NS5B gene were performed in baseline serum samples of treatment-naïve patients infected with genotype 1b hepatitis C virus (HCVs).

Results:

One hundred and sixty CHC patients were studied. Complete sequence information was obtained for 145 patients (NS3), 148 patients (NS5A), and 137 patients (NS5B). Treatment-failure associated variants of DAAs were detected: 56.6% (82/145) of the patients presented S122G for simeprevir (NS3 protease inhibitor); 10.1% (14/148) of the patients presented Y93H for daclatasvir and ledipasvir (NS5A protein inhibitors); 94.2% (129/137) of the patients presented C316N for sofosbuvir (NS5B polymerase inhibitor). Nearly, all of the DAAs RAVs detected by ultra-deep sequencing could be detected by direct sequencing.

Conclusions:

The majority of genotype 1b CHC patients in China present a virus population carrying HCV DAAs RAVs. Pretreatment sequencing of HCV genome might need to be performed when patients infected with GT1b HCV receiving DAAs-containing regimens in China. Population sequencing would be quite quantified for the work.     

Clinical application and analysis of hepatitis C virus NS3 antigen detection by ELISA in human serum

Background Hepatitis C virus （HCV） core antigen assays have been produced to exclude infectious donations collected during the preseroconversion window phase （PWP）. For the same purpose, we evaluated the specificity and sensitivity of a novel hepatitis C virus NS3 antigen detection immunoassay and the application of this assay in clinical diagnosis. Methods Samples from 77 healthy subjects, 173 anti-HCV positive patients and 3708 hepatitis patients other than HCV positive were tested with the HCV NS3 antigen assay. Some HCV NS3 antigen positive samples were further validated with HCV-RNA, neutralization and immunodot assays. Twenty-five sequential samples from 11 HCV NS3 antigen positive patients were subjected to kinetic study. Results Only 48 （1.3%） of 3708 anti-HCV negative samples were positive for HCV NS3 antigen. Among them, 44 of 3030 samples from patients only infected with HBV were HCV NS3 antigen positive, 4 of the 445 samples from patients infected with other type hepatitis were HCV NS3 antigen positive. In addition, 42 （24.3%） of 173 anti-HCV positive samples were HCV NS3 antigen positive and all 77 samples from healthy subjects were negative to HCV NS3 antigen assay. Of the 15 HCV NS3 antigen positive samples, 9 （60%） were HCV-RNA positive. The neutralization and positive percentage of immunodot assay for 23 HCV NS3 antigen positive sera were 87.0% （20/23） and 69.6% （16/23） respectively. Of the 25 sequential samples from 11 HCV NS3 antigen positive patients, there was a negative correlation between the OD values and the duration of test （r=-0.989, P〈0.05）, and there were correlations among their HCV NS3 antigen, HCV-RNA and anti-HCV Utres. The anti-HCV antibodies of two sera were detected while their OD values of HCV NS3 antigen decreased gradually. Conclusions The HCV NS3 antigen detection assay showed perfect specificity and high sensitivity. Thus, it would be useful and economical as a routine test in laboratories for early diagnosis of HCV infection and prevention.