基因步移在分离蚊虫细胞色素P450启动子中的应用及意义

[目的]快速扩增出白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP 6N3基因(CYP6N3)上游启动子区序列.[方法]根据本室已获得的白纹伊蚊CYP6N亚家族新成员CYP6N3全长cDNA的5＇-末端核苷酸序列,设计2个反向特异引物(GSP1和GSP2),利用4种限制性内切酶DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和StuⅠ分别消化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株高分子量基因组DNA,消化产物与适配子连接产生4种消化的DNA库(DL1、DL2、DL3及DL4),并分别以此为模板,进行基因步移.用特异引物GSP1与适配子引物AP1进行第1步PCR扩增,然后再以第1步PCR产物为模板、用内部特异引物GSP2与内部适配子引物AP2进行第2次PCR扩增.[结果]第1步PCR结果显示在上述4种消化文库中分别扩增出约806、2190、2 206和3 076bp的特异条带;第2步PCR结果与第1次PCR相类似,但各泳道主带扩增效率明显升高.[结论]本实验已成功地获得了白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6N3上游启动子区核苷酸序列及其4种限制性内切酶图谱.此外还对基因步移法在昆虫细胞色素P450多样性及其参与杀虫剂抗性分子机理研究中的意义进行了讨论.     

蚊虫细胞色素P450基因系列研究

报告中山医科大学寄生虫学教研室医学昆虫学室近5年来有关蚊虫细胞色素P450基因(CYP450)系列研究结果,包括①通过简并引物PCR分别从致倦库蚊、白纹伊蚊及中华按蚊中获得3个、2个、2个CYP4家族成员基因片段;通过简并引物PCR及RT-PCR从白纹伊蚊中获得16个CYP6家族成员基因片段;②利用cDNA末端快速扩增(RACE)法获得了白纹伊蚊CYP6家族3个新的全长cDNA序列及7个超过其全长一半以上的cDNA序列.GenBankaccessionnumber分别为AF283836-AF283838(全长cDNA序列)和AF284782-AF284783(非全长cDNA序列),被国际P450命名委员会正式命名为CYP6N3v1-v3(全长cDNA序列)和CYP 6N3v4、CYP6N4v1-v6,并证实这些新基因同时存在于白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株及敏感株中;③运用基因步移方法从白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株中扩增出CYP6N3上游3 076 bp调控序列;④对白纹伊蚊CYP 6N3、CYP6N4非翻译区序列功能分析显示昆虫CYP450与其它真核mRNA翻译起始及终止机制相似,但具有多态性的特点;⑤对白纹伊蚊CYP6N3上游启动子区序列特征与功能分析显示蚊虫中CYP450转录起始存在着复杂性;⑥证实蚊虫中CYP6存在多样性,并分析讨论了此种多样性形成的可能机制;⑦分析讨论了蚊虫细胞色素P450 CYP6家族分子进化机制;⑧阐明了下一步研究的目标.     

蚊虫细胞色素P450基因系列研究

报告中山医科大学寄生虫学教研室医学昆虫学室近5年来有关蚊虫细胞色素P450基因（CYP450）系列研究结果,包括：①通过简并引物PCR分别从卷库蚊、白纹伊纹及中华按蚊中获得3个、2个、2个CPY4家族成员基因片段;通过简并引物PCR及RT－PCR从白纹伊蚊中获得16个CYP6家族成员基因片段;②利用cDNA末端快速扩增（RACE）法获得了白纹伊蚊CYP3个新的全长cDNA序列及7个超过其全长一半以上的cDNA序列。GenBank accession number分别为AF283836－AF283838（全长cDNA序列）和AF284782－AF2847830（非全长cDNA序列）,被国际P450命名委员会正式命名为CYP 6N3vl-v3（全长cDNA序列）和CYP 6N3v4、CYP6N4vl-v6,并证实这些新基因同时存在于白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株及敏感株中;③运用基因步移方法从白蚊伊蚊溴氰菊酯抗性株中扩增出CYP6N3上游3076bp调控序列;④对白纹伊蚊CYP6N3、CYP6N4非翻译区序列功能分析显示：昆虫CYP450与其它真核mRNA翻译起始及终止机制相似,但具有多态性的特点;⑤对白纹伊蚊CPY6N3上游启动子区序列特征与功能分析显示：蚊虫中CYP450转录起始存在着复杂性;⑥证实蚊虫中CYP6存在多样性并分析讨论了此种多样性形成的可能机制;⑦分析讨论了蚊虫细胞色素P450 CYP6家族分子进化机制;⑧阐明了下一步研究的目标。     

白纹伊蚊细胞色素P450 CYP6N3基因分子进化机制初探

为了初步探讨白纹伊蚊细胞色素P450 CYP6家族新基因分子进化机理,根据已获得的白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株一新的细胞色素P450CYP6基因cDNA片段,设计反向引物,进行5’-cDNA末端快速扩增（rapid　amplification　of　cDNA　ends,RACE）;以正向引物进行3’-RACE。然后分别进行克隆、测序和鉴定。根据获得白纹伊蚊CYP6家族新成员全长cDNA序列,运用PC/GENE软件分析其5’-UTP区DNA序列相似性及编码区氨基酸残基相似性、构建系谱树。结果获得的3个全长序列中5’-UTP区DNA序列完全相同;编码区氨基酸残基相似性为3/497或4/497个氨基酸差异,而且此种差异均位于蛋白质功能非保守的基因区域;构建的系谱树显示CYP6N3基因与冈比亚按蚊CYP6N1-2亲缘关系最近,而与致倦库蚊的CYP6E1、CYP6F1亲缘关系较远。说明白纹伊蚊CYP6N3基因较致倦库蚊的CYP6E1、CYP6F1基因更为古老;白纹伊蚊CYP6N3各等位基因变异体是通过整个CYP6N3基因座的新近复制而产生。     

2种PCR方法扩增盐藻肌动蛋白基因3'旁侧序列比较

目的：比较扩增盐藻肌动蛋白基因3’旁侧序列的2种PCR方法。方法：用pvuⅡ、EcoR Ⅴ和StuⅠ3种限制性内切酶消化盐藻基因组DNA后，供2种PCR用，一种是连接介导法PCR(LMPCR)，与用人工合成的适配子相连并用适配子引物和盐藻肌动蛋白基因特异引物扩增未知序列；另一种是反向PCR(IPCR)，酶切后的DNA自身环化做模板，用2对基因特异引物反向扩增。结果：2轮PCR后，LMPCR中得到大量的非特异扩增产物，测序结果发现许多产物是由适配子引物AP2单独扩增引起。而反向PCR在得到pvuⅡ和Stu Ⅰ消化的自连文库中扩增得到2．5kb特异产物，经测序发现，片段两侧为基因特异引物，部分序列与已知序列相一致。Southern也进一步证实了IPCR扩增片段来源于盐藻基因组DNA。结论：IPCR技术在克隆基因旁侧序列时优于LMPCR方法。     

白纹伊蚊实验室抗溴氰菊酯品系筛选及其形态变化和钠通道基因分析

目的揭示实验室内白纹伊蚊溴氰菊酯抗性汰选中蚊抗性发展趋势、形态表型和蚊击倒抗性相关钠离子通道(VGSC)结构域Ⅲ基因片段(Kdr)的变化。方法实验室严格控制饲养条件,用溴氰菊酯汰选白纹伊蚊至30代,计算幼虫半数致死浓度(LC50)并获得抗性倍数(RR),成蚊接触筒法计算成蚊死亡率。随机选取汰选白纹伊蚊抗性株及敏感株的雌蚊,测量成蚊的体长等8个形态学指标,并对所测形态指标数据进行统计分析。PCR扩增抗性株及敏感株雌蚊钠通道结构域Ⅲ基因片段,TA克隆,测序,进行序列分析。结果经过汰选,抗性株的LC50由0.020 mg/L变成0.048 mg/L,其抗性倍数为2.4倍。幼虫生物测量结果显示抗性株具有低度抗性,成蚊抗药性生物测试表明R-20代白纹伊蚊为抗性群体,且抗性级别为R。18代白纹伊蚊抗溴氰菊酯株(R)与敏感株(S)的体长、前腿长、中腿长、后腿长、翅长、翅宽、触角长和喙长均数差异有统计学意义(P0.05)。随着代数的增加,白纹伊蚊抗性株在形态学各方面指标的均数呈现降低的趋势。测序显示,Kdr第96、132、204个位点碱基敏感株为C,而抗性株则突变为T;第111位敏感株碱基为A,抗性株则为G;第534位抗性株碱基由T突变为C。然而,敏感株及抗性株均未发现上述位点的氨基酸序列突变,未影响其蛋白质的表达。结论实验室内采用溴氰菊酯抗性汰选抗性白纹伊蚊模型成功。溴氰菊酯汰选抗性白纹伊蚊形态表型发生变化,溴氰菊酯汰选抗性白纹伊蚊的19代、20代蚊Kdr基因一些位点发生碱基突变,但对应的氨基酸序列没有改变。     

白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6基因cDNA片段的克隆与鉴定

目的 获得白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6基因家族中的一个cDNA片段。方法 根据家蝇CYP6A1、CYP6D1以及致倦库蚊CYP6E同源区氨基酸序列,设计1对简并引物,进行反转录PCR,获得一大小与设计的细胞色素P450基因片段相符合的cDNA片段。将该片断与pUC19质粒重组,并克隆至JM109大肠杆菌中,经筛选后测序;将推导的氨基酸序列进行同源性分析,并用PC/GENE软件绘制系统树。结果 获得了1条长240　bp的核酸序列;所得序列与昆虫CYP6家族的同源性在36.3%～46.8%之间,但CYP6D1除外,其同源性为29.1%;而与CYP4家族同源性较低,与CYP4C1、CYP4D1、CYP4D2同源性分别为33.3%、32.9%和29.9%;与哺乳动物CYP3A亚家族同源性亦较高;所绘制的系统树显示出与同源性分析相一致的结果。结论 该序列为CYP6家族中某一成员的结构基因片段。     

白纹伊蚊贵州麻尾株垂直传播登革病毒实验研究

目的：研究白纹伊蚊贵州麻尾株对2型登革病毒(DEN—2)的经卵传递能力。方法：用DEN-2 NGC株感染白纹伊蚊贵州麻尾株，收集亲代及子1、2、3代蚊虫标本，提取亲代及子代蚊体内病毒总RNA，通过RT—PCR扩增蚊体内DEN—2病毒核酸，并用限制性核酸内切酶Hinf Ⅰ酶切鉴定。结果：感染白纹伊蚊贵州麻尾株后，子1～3代蚊体内均可检测出病毒核酸。结论：DEN-2能通过白纹伊蚊贵州麻尾株垂直传播，至少可以传3代。     

白纹伊蚊垂直传播登革病毒后E基因区部分序列的变化

目的：通过对登革病毒经垂直传播后亲代和子一代蚊体内病毒基因序列的分析，了解登革病毒在流行过程中的变异性。方法：用登革2型病毒(DEN-2)NGC株感染白纹伊蚊贵州兴义株，提取亲代及子一代蚊体内病毒总RNA，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增蚊体内DEN-2病毒核酸，对阳性聚合酶链反应(PCR)产物进行序列测定和比较。结果：用DEN-2 NGC株感染白纹伊蚊贵州兴义株后，子一代蚊体内扩增的DEN-2 E基因区序列与亲代蚊体内扩增的序列比较，出现3个位点的突变，分别位于第174，215，336位点；亲代蚊体内扩增的DEN-2 E基因区部分序列与DEN-2 NGC株E基因区序列相同。结论：DEN-2在垂直传播后出现病毒E基因区的点突变。     

白纹伊蚊贵州地方株垂直传播登革1型病毒的研究

目的：研究白纹伊蚊贵州地方株对1型登革病毒(DEN-1)的垂直传播能力。方法：用DEN-1感染白纹伊蚊贵州3个地方株(贵阳、毕节、兴义)，收集亲代及子1～3代蚊虫标本，提取蚊体总RNA，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒核酸。并以白纹伊蚊海南株作为对照。结果：感染DEN-1后的白纹伊蚊贵阳株亲代、子1代；白纹伊蚊毕节株亲代、子1代；白纹伊蚊兴义株及海南株亲代、子1～3代的蚊体内均可检测到病毒核酸。结论：DEN-1均能通过白纹伊蚊贵州3个地方株垂直传播。白纹伊蚊贵州不同地方株对DEN-1的垂直传播能力有差别。