Beclin1基因与恶性肿瘤的研究进展

细胞的死亡方式包括凋亡和坏死,而自噬是细胞程序性死亡的另一种方式。它与肿瘤的关系已经成为近年的研究热点。Beclin1是细胞进行自行吞噬的必需基因,其与肿瘤的发生和发展有密切联系。Beclin1基因是通过对细胞自噬的调节,从而在肿瘤的发展过程中起重要作用。多种肿瘤因缺失Beclin1基因,能够逃避自噬性死亡,故导致肿瘤的发生、发展。随着Beclin1基因在肿瘤中作用机制的进一步揭示,将对各种恶性肿瘤的诊断及治疗具有深远的临床意义。     

Beclin1与肿瘤关系的研究进展

Beclin1是酵母自噬基因Atg6/Vps30的同系物,也是哺乳动物参与自噬的特异性基因,与肿瘤的发生发展密切相关。本文通过介绍Beclin1的基本结构、相关作用蛋白及其相关自噬机制,总结了Beclin1与自噬、凋亡及其肿瘤的关系,并探讨其在肿瘤治疗领域中的潜能。     

自噬基因Beclin 1与肿瘤关系的研究进展

Beclin 1是第一个被克隆的自噬相关基因,在肿瘤发生、发展中扮演重要角色.Beclin 1不仅促进真核细胞自噬,同时也参与细胞凋亡调节.研究表明,Beclin 1可抑制肿瘤的发生和发展,但也有研究表明,Beclin 1可以通过诱导适当的自噬使肿瘤细胞得以存活.笔者就Beclin 1及其在肿瘤发生、发展中的作用作一综述.     

Beclin1基因在消化道肿瘤发生发展中的作用及其影响因素研究进展

自噬是一种高度保守的溶酶体降解的过程,其能降解细胞中受损的细胞器和错误折叠蛋白,以维持细胞内环境稳定,自噬对肿瘤具有双重作用,其既能为肿瘤细胞提供营养和保护,又可抑制或杀伤肿瘤细胞,而Beclin1是重要的自噬相关基因,其在肿瘤的发生发展中可调节自噬状态,其表达改变可影响肿瘤发生发展,并与化疗耐药相关。了解Beclin1的结构、作用机制、影响因素以及与消化道肿瘤的关系,将会为消化道肿瘤的检测、诊断、治疗、预后提供新策略。     

自噬基因Beclin1在卵巢癌中的研究进展

妇科恶性肿瘤中卵巢癌的发病率排名第三,但是死亡率排名第一。自噬是指细胞在缺乏营养和能量等刺激时受损的生物大分子和细胞器被溶酶体包裹降解的过程,自噬参与了细胞的生理和病理过程,近来研究表明自噬对肿瘤的生物学有着复杂且重要的作用。Beclin1是自噬的正向调控基因,Beclinl与肿瘤之间的关系正如自噬与肿瘤之间的关系。自噬基因Beclin1对卵巢癌的发生、发展、治疗和预后有何影响,本文就此作一综述。     

自噬基因Beclin1启动子细胞自噬模型的建立

【目的】构建自噬基因Beclin1启动子报告基因细胞自噬模型,为筛选出以Beclin1为靶标的中药提供新的细胞模型。【方法】采用瞬时转染双荧光素酶报告基因测定法,确定最佳转染浓度、时间等条件,及Beclin1基因启动子转录活性细胞自噬模型的建立和验证,观察血清饥饿、过氧化氢氧化损伤及自噬激活剂雷帕霉素3种自噬刺激因素对Beclin1基因启动子转录活性PC12细胞自噬模型的影响。【结果】血清饥饿诱导12 h,Beclin1基因启动子转录活性是体积分数10%血清组的1.8倍,而血清饥饿诱导18、24 h与诱导12 h比较其转录活性无明显变化;300μmol/L过氧化氢诱导9 h,Beclin1基因启动子转录活性是0μmol/L过氧化氢组的1.3倍;雷帕霉素在浓度0.1、1 nmol/L可上调Beclin1基因启动子转录活性,并呈浓度依赖性,而5 nmol/L及更高浓度的雷帕霉素可下调Beclin1基因启动子转录活性。【结论】成功建立用Beclin1基因启动子报告基因检测Beclin1基因启动子转录活性特异性的细胞发生自噬模型,血清饥饿、过氧化氢、自噬激活剂雷帕霉素3种自噬刺激因素可诱导Beclin1基因启动子的转录活性。     

真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1的构建及其对子宫内膜癌HEC细胞增殖的影响

目的:构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1,检测人子宫内膜癌HEC细胞转染pcDNA3.1-Beclin1后,外源性基因Beclin1在蛋白水平的表达,并观察其对HEC细胞增殖的影响。方法:通过RT-PCR和T/A克隆等方法,构建自噬基因Beclin1的真核表达载体pcDNA3.1-Beclin1,并通过脂质体介导的方法将外源性Beclin1基因导入人类子宫内膜癌细胞株HEC中,通过实时PCR检测转染后Beclin1在HEC中表达的情况,并设立实验组(转染pcDNA3.1-Beclin1真核载体)、空质粒对照组(转染pcDNA3.1空载体)、空白脂质体对照组,用Western blot法检测子宫内膜癌HEC细胞中Beclin1的表达情况,MTT法检测Beclin1对HEC细胞体外生长的影响等,研究Beclin1基因与子宫内膜癌的关系。结果:经限制性内切酶鉴定及测序,证明Beclin1基因真核质粒的序列完全正确,将其转染HEC细胞,转染后的HEC细胞在体外能继续增殖,但增殖能力明显下降。结论:Beclin1基因pcDNA3.1-Beclin1真核表达载体构建成功,并能在HEC细胞中表达,转染HEC细胞体外增殖能力明显降低,Beclin1基因用于子宫内膜癌基因治疗具有重要靶向价值。     

自噬基因Beclin 1 shRNA表达质粒的构建及其对宫颈癌细胞HeLa生长的作用

目的 构建自噬基因Beclin 1小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,探讨Beclin 1抑制后对宫颈癌HeLa细胞生长的作用.方法 根据人Beclin 1 mRNA编码序列,设计RNA干扰靶点,构建Beclin 1 shRNA表达质粒,脂质体法转染人宫颈癌HeLa细胞,通过荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blot检测其对HeLa细胞自噬基因Beclin 1 mRNA及蛋白表达的影响.MTT法分析其对细胞增殖、流式细胞仪检测其对细胞周期和细胞凋亡的影响.结果 构建的shRNA表达载体可以使HeLa细胞中自噬基因Beclin 1的mRNA及其蛋白含量降低,转染质粒的细胞生长增殖速度加快,凋亡率降低.结论 成功构建了针对自噬基因Beclin 1的shRNA表达载体,通过转染HeLa细胞,可有效抑制细胞中Beclin 1的表达,并促进细胞生长,抑制凋亡.     

自噬在不同分割方案放疗联合化疗中对肺癌细胞的杀伤作用及其机制

目的：通过离体实验、在体实验观察不同放疗方案以及顺铂增敏放疗对肺癌细胞的杀伤效应,探讨自噬在这一过程中发挥的作用及其机制。方法：采用人肺癌细胞A549,以不同浓度(0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 μmol?L-1)顺铂进行处理;40只C57BL/6小鼠随机分为对照组(n=10)、常规分割照射组(n=10)、超分割照射组(n=10)和联合组(n=10),建立C57BL/6小鼠肺癌异位移植模型。MTT法检测A549细胞存活率,Western blotting法检测各组小鼠自噬相关基因MAPLC3和Beclin1蛋白的表达。采用游标卡尺测量各组小鼠肿瘤体积;免疫组织化学法检测肿瘤组织中自噬相关基因MAPLC3Ⅱ、PI3KⅢ和Beclin1的表达水平。结果： 顺铂药物浓度>5.0 μmol•L-1时A549细胞的存活率呈剂量依赖性下降;与对照组(0 μmol?L-1顺铂)比较,10.0、20.0和40.0 μmol?L-1顺铂组细胞存活率降低（P<0.05）。与对照组比较,其他各组小鼠自噬相关基因MAPLC3Ⅱ和Beclin1蛋白表达水平明显升高;超分割照射组小鼠肿瘤体积<联合组<常规分割照射组<对照组;与对照组比较,其他各组肿瘤体积均减小（P<0.05）。肿瘤组织切片染色,与对照组比较,其他各组自噬相关基因MAPLC3Ⅱ、PI3K-Ⅲ和Beclin1表达水平均明显升高（P<0.05）,且在联合组达到最高值。结论：顺铂协同增敏放疗对肺癌细胞的杀伤作用,自噬可能参与其调控。     

细胞自噬对紫杉醇诱导宫颈癌CaSki细胞死亡的影响

目的：通过对自噬基因Beclin1的表达调节来观察细胞自噬对紫杉醇诱导人宫颈癌CaSki细胞株死亡的影响,并探讨在该过程中自噬与凋亡之间的相互作用及关系。方法：利用脂质体法将Beclin1的过表达质粒pcDNA3.1-Beclin1和RNA干扰质粒pSUPER-Beclin1分别体外转染CaSki细胞并筛选稳定表达株后,电镜下观察细胞内自噬囊泡的形成,Western 印迹检测转染前后Beclin1与LC3蛋白的表达变化。上述细胞株经紫杉醇作用后MTT法检测细胞增殖情况的改变,流式细胞仪检测自噬细胞与凋亡细胞的百分率。结果：在Beclin1基因过度表达的CaSki细胞株中,电镜观察到细胞内存在大量的自噬囊泡;Beclin1与LC3蛋白的表达在pcDNA3.1-Beclin1转染细胞株中被上调。MTT法检测提示Beclin1过表达细胞株存活细胞明显少于未转染对照细胞株。流式细胞仪检测提示经紫杉醇作用后与空白对照组比较,Beclin1过表达组自噬细胞与凋亡细胞百分率均有明显增加,其中凋亡增加尤其明显;而Beclin1干扰组自噬细胞与凋亡细胞百分率均有所减少。结论：在紫杉醇对宫颈癌CaSki细胞株的杀伤过程中细胞自噬与凋亡均发挥了作用,在Beclin1基因过度表达的CaSki细胞株中可通过增加紫杉醇诱导的细胞凋亡来增强药物对肿瘤细胞的杀伤作用。     

自噬基因Beclin 1在宫颈鳞癌中的蛋白表达及其临床意义

目的探讨自噬基因Beclin 1在宫颈鳞癌中的蛋白表达以及与肿瘤发生发展的关系。方法采用免疫组化SP法检测81例宫颈鳞癌、20例宫颈上皮内瘤样病变（CIN，Ⅱ～Ⅲ级）和20例正常宫颈组织中自噬基因Beclin 1的蛋白表达。结果宫颈鳞癌组织中Beclin 1阴性、弱阳性、强阳性表达率依次是43．2％（35／81）、34．6％（28／81）、22．2％（18／81），与正常宫颈和宫颈上皮内瘤样病变组相比，Beclin 1在宫颈鳞癌中的表达显著下调（P=0．011）。宫颈鳞癌中Beclin 1的表达在不同FIGO分期、年龄、宫颈肌层浸润深度、宫颈肿瘤大小、大体类型间的差异无统计学意义。但在有无盆腔淋巴结转移、不同肿瘤分化程度间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论自噬基因Beckn 1在宫颈鳞癌中蛋白表达下调，并与宫颈鳞癌盆腔淋巴结转移和肿瘤分化程度有关。     

沉默Beclin1基因对β-榄香烯抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖与诱导自噬的影响

目的探讨Beclin1基因对β-榄香烯抗人胃癌SGC-7901细胞增殖及自噬诱导的影响。方法用前期实验构建成功的GV112-Beclin1-shRNA1(short hairpin RNA,短发夹RNA)慢病毒载体感染人胃癌SGC-7901细胞。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测β-榄香烯对SGC-7901细胞增殖的抑制作用,以及沉默Beclin1基因后对β-榄香烯抗增殖能力的影响。免疫蛋白印迹(Western blot)检测自噬相关蛋白LC3-II、P62的表达,评价β-榄香烯作用SGC-7901后的自噬水平和Beclin1基因沉默对β-榄香烯诱导自噬的影响。结果 MTT法显示,β-榄香烯能够抑制胃癌SGC-7901细胞增殖,抑制作用随浓度的增加而递增(浓度为20、50、100μg/mL比0μg/mL时,抑制率为21.5%、31.7%、37.4%比0,P<0.05);沉默Beclin1基因后β-榄香烯抑制胃癌SGC-7901细胞抑制率增加(42.3%比36.1%,P<0.05)。Western blot法显示,β-榄香烯能诱导SGC-7901细胞发生保护性自噬,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达上调,P62蛋白表达下降,沉默Beclin1基因可抑制β-榄香烯对SGC-7901细胞保护性自噬的增强,LC3-Ⅱ蛋白表达水平下降,P62蛋白表达增加。结论β-榄香烯可诱导胃癌SGC-7901细胞发生保护性自噬,下调Beclin1基因有助于降低保护性自噬的发生,从而增强β-榄香烯的抗癌效果。     

营养剥夺诱导的脂肪细胞自噬及与Beclin1的关系

目的探讨3T3-L1脂肪细胞在营养剥夺状态下自噬的发生及自噬相关基因Beclin1的变化。方法培养3T3-L1脂肪细胞至不同诱导分化时期,对照组不做特别处理,营养剥夺组以Hanks液代替细胞完全培养液3 h,形成营养剥夺状态。采用透射电镜观察自噬体;转染携带微管相关蛋白1轻链3(LC3)的绿色荧光蛋白慢病毒(LC3-GFP-LENTIVIRAL)质粒系统,病毒扩增后感染3T3-L1靶细胞,荧光显微镜下观察LC3-GFP点状聚集;蛋白免疫印迹分析检测自噬抗体LC3以及Beclin1的变化;双荧光素酶报告基因检测Beclin1基因转录区(Promoter)及3′非编码区(3′UTR)的变化。结果营养剥夺组自噬体数量较对照组增多;营养剥夺组较对照组LC3-GFP点状聚集增多;营养剥夺组LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表达较对照组升高;与对照组相比,营养剥夺组Beclin1-Promoter及Beclin1-3′UTR相对荧光单位呈倍数增高,差别有统计学意义(P<0.01)。结论营养剥夺可以诱导3T3-L1脂肪细胞发生自噬;营养剥夺诱导的自噬与Beclin1相关,可同时影响Beclin1基因的转录与mRNA稳定性。     

20(S)-原人参二醇对体外培养siha细胞自噬的影响

目的：观察20(S)-原人参二醇（PPD）对人子宫颈癌siha细胞生长的抑制作用及其对自噬基因Beclin 1及MAP1-LC3转录和表达的影响，探讨PPD抑制siha细胞增殖的机制。方法：体外培养人宫颈癌siha细胞分为阴性对照组（乙醇）、阳性对照组（40 μmol·L^-1顺铂）及PPD 10、20和40 μg·L^-1组，分别用乙醇、顺铂和PPD处理细胞24、48、72和96h后，MTT法检测siha细胞增殖抑制率，RT-PCR、Western blotting及免疫细胞化学染色法观察各组siha细胞自噬相关基因Beclin 1及MAP1-LC3的转录及蛋白表达情况。结果：与对照组比较，PPD 10、20和40 μg·L^-1组细胞增殖抑制率明显增加（P<0.05），且随时间延长和剂量的增加而逐渐提高，自噬相关基因Beclin 1及MAP1-LC3的转录水平及蛋白表达水平明显上调（P<0.01）。结论：PPD可抑制体外培养siha细胞增殖，诱导siha细胞发生自噬。其机制可能与上调自噬相关基因Beclin 1及MAP1-LC3表达有关。     

Beclin 1在乳腺浸润性导管癌组织中的表达

目的：探讨Beclin 1在乳腺浸润性导管癌中的表达及临床意义。方法：免疫组织化学EnVision 法、RT-PCR法和Western blot 法检测50例乳腺浸润性导管癌及相应癌旁组织Beclin 1表达,分析其临床意义。结果：三种方法联合检测发现癌组织中Beclin 1阳性率低于癌旁组织,癌组织中Beclin 1相对表达量也低于癌旁组织;癌组织中Beclin 1表达与患者病理分级、临床分期和淋巴结转移情况有关（P＜0．05）,与患者年龄、绝经状况及乳头侵犯状况无关（P＞0．05）。结论：Beclin 1在乳腺浸润性导管癌中存在缺失表达或低表达,并与乳腺癌的发生、发展相关。     

TGF-β1通过促进自噬相关基因Beclin 1表达抑制肝癌细胞增殖

目的：探讨TGF-β1对人肝癌细胞增殖的影响及其与Beclin 1表达的关系.方法：常规培养人肝细胞株L-02和人肝癌细胞株Bel7402,MTT法检测TGF-β1对Bel7402细胞增殖的影响,RT-PCR和Western-blot检测TGF-β1对Bel7402细胞Beclin 1表达的作用.结果：TGF-β1明显抑制了Bel7402细胞的增殖,该作用可被TGF-β1受体阻断剂LY364947解除.Bel7402细胞Beclin 1表达低于L-02细胞,给予TGF-β1后,Bel7402细胞Beclin 1表达明显增加,该作用可被LY364947抑制.结论：TGF-β1抑制肝癌细胞增殖,其机制可能与促进Beclin 1表达有关.     

上皮性卵巢癌中自噬基因Beclin 1的表达及其调控相关信号传导途径的研究

目的 研究自噬基因Beclin 1及其调控相关信号传导途径磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/PKB)与上皮性卵巢癌发生发展之间的关系.方法 用免疫组化的方法对25例正常卵巢组织、25例良性上皮性卵巢肿瘤、19例交界性上皮性卵巢肿瘤及69例上皮性卵巢癌组织进行Beclin 1、Class Ⅰ PI3K (p110α)、Class Ⅲ PI3K(hvps34)及其下游的磷酸化PKB(p-PKB)的表达水平进行检测.结果 Beclin 1、hvps34在正常卵巢组织与良性卵巢肿瘤组织中表达较高,在交界性卵巢肿瘤组织中开始下降,在上皮性卵巢癌中的表达最低(P＜0.05);p110α、p-PKB在交界性卵巢肿瘤组织中开始升高,在上皮性卵巢癌中的表达高于其它3组(P＜0.05).卵巢癌Ⅰ～Ⅱ期、高中分化、淋巴结无转移的卵巢肿瘤组织中Beclin 1的表达分别高于Ⅲ～Ⅳ期、低分化、淋巴结有转移者(P＜0.05),而p110α及p-PKB的表达则分别降低(P＜0.05).结论 自噬基因Beclin 1在上皮性卵巢癌中的表达下调,对自噬起调控作用的PI3K/PKB信号通路中的成分p110α、hvps34、p-PKB存在表达异常,可能与上皮性卵巢癌的发生、发展及临床预后有关.