新生大鼠肝干细胞的分离、培养与鉴定

目的体外分离、培养新生大鼠肝干细胞（HSCs）,并对其生物学特性进行鉴定。方法采用剪碎加酶消化法分离新生大鼠肝干细胞,用体积分数10%胎牛血清的H-DMEM培养液培养。以MTT法检测细胞的增殖情况,以RT-PCR检测肝干细胞特异性标记分子的表达。结果分离的新生大鼠肝干细胞体外培养24h已贴壁,3d左右可见克隆形成,呈铺路石样分布,光镜下细胞为方形或多角形,边缘清楚,细胞核及核仁明显,表达细胞角蛋白CK18、CK19、CK8、甲胎蛋白（AFP）等肝干细胞特异性标记分子,低度表达白蛋白。结论成功分离、鉴定出了新生大鼠肝干细胞,并可在体外条件下进行传代扩增培养。     

大鼠表皮干细胞的定位、分离和体外培养

目的：定位大鼠的表皮干细胞,探讨表皮干细胞分离和体外培养的方法。方法：用免疫组化法定位表皮干细胞。用胶原酶冷、温消化和胰蛋白酶联合消化新生鼠皮肤,获得单细胞悬液。选取在鼠尾胶原上快速贴壁的细胞为目的细胞,未快速贴壁的细胞为对照组,二者在相同条件下培养,适时传代,测定细胞克隆形成率．免疫学方法鉴定表皮干细胞。结果：毛囊隆突区细胞胞浆表达角蛋白15（K15）随年龄的增长,K15阳性细胞出现在毛母质细胞区和表皮基底层。体外培养的细胞能形成大克隆,克隆形成率为14．06％,传至第4代,细胞形态无明显改变,细胞浆内表达K15。结论：表皮干细胞位于毛囊隆突区,此研究所用的方法可以分离、纯化和培养表皮干细胞。     

人胎脑神经干细胞的体外分离、培养与鉴定

目的探索人胎脑神经干细胞的体外分离培养条件,从而在体外大量增殖神经干细胞,并观察神经干细胞增殖和分化的特点。方法采用含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清培养技术,从14周自愿水囊引产人胎脑海马皮质中分离出神经干细胞,并进行培养、传代、分化观察,应用免疫荧光细胞化学技术对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果从14周人胎脑皮质中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续增殖能力,可传代培养,表达神经巢蛋白抗原（Nestin）;在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞表达神经元细胞和胶质细胞的特异性抗原。结论在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,从人胎脑能分离培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞,并能在体外扩增,可进一步用于基础及临床研究。     

人胎肝干细胞的分离、培养和鉴定

为探讨人胎肝中干细胞的存在并对其生物学特性进行鉴定 ,采用原代分离法培养人胎肝细胞集落 ,免疫组化鉴定细胞集落分子标志物的表达。结果 :从人胎肝组织中成功分离表达甲胎蛋白 (AFP)、白蛋白、波形蛋白等标志物的胎肝干细胞集落。证实人胎肝中同样存在具有干细胞特性的原始细胞。这一发现为肝干细胞的生物学特性的深入研究奠定了良好的基础     

大鼠表皮基底层干细胞体外分离与培养

目的建立简单、可靠的大鼠表皮基底层干细胞体外分离培养方法。方法取新生大鼠背部皮肤,采用胰酶两步消化法获得单细胞悬液,Ⅳ型胶原差速贴壁法富集干细胞,将慢黏附细胞作为对照组细胞,均以角质形成细胞无血清培养基培养。以β1-整合素和角蛋白19(K19)双重荧光染色鉴定细胞表型,克隆形成实验检测细胞体外增殖能力。结果分离培养的细胞为多角形、呈铺路石样排列,倍增时间约为24h,细胞形态和生长规律符合基底层干细胞的特征。免疫荧光鉴定显示细胞共表达β1-整合素和K19,基底层干细胞克隆形成能力显著强于对照细胞。结论两步消化联合Ⅳ型胶原差速贴壁法获取基底层干细胞简易可行,培养的细胞活力好、表型可靠。     

人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定

目的：进行人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定,为组织工程的进一步研究提供实验依据。方法：将剪碎的人脂肪组织加入Ⅰ型胶原酶消化,离心。将细胞悬液置于6孔培养板中,37℃、5%CO₂培养箱中培养,细胞达80％融合时进行传代。选取第3代细胞,进行免疫组织化学染色,检测细胞表面抗原标记物;选取第3代细胞,分为成骨诱导组和成脂诱导组,每组又分为诱导组（加入相应诱导培养基）及对照组（未经诱导的细胞）。成骨诱导72 h后进行碱性磷酸酶（AKP）含量检测,8 d后进行茜素红染色,检验细胞内是否出现钙沉积;成脂诱导2周后进行油红O染色,检测细胞内是否形成脂滴。结果：培养细胞均有CD44、CD49d抗原阳性表达,不表达CD45、CD106抗原;成骨诱导72 h后,诱导组细胞内AKP含量(0.488 3 U•g^-1prot)较对照组(0.063 2 U•g^-1prot)明显增高（P<0.05）;8 d后诱导组茜素红染色阳性,对照组阴性;成脂诱导2周后油红O脂肪颗粒染色为阳性,对照组为阴性。结论：利用原代细胞培养技术可成功地从人脂肪组织中分离出脂肪干细胞。     

大鼠表皮干细胞的分布与体外分离培养

目的 研究大鼠表皮干细胞的分布与体外分离培养.方法 用免疫组织化学技术研究大鼠表皮干细胞的分布;用DispaseⅡ、胰酶二步法消化新生大鼠皮肤,获得单细胞悬液,Ⅳ型胶原筛选,体外培养大鼠表皮干细胞,进行免疫组化鉴定,荧光标记流式细胞仪分析.结果 在表皮基底层、毛囊外根鞘区α 6-integrin、K15等表皮干细胞标记物染色阳性,而分化指标CD71染色阴性;CD34在表皮基底层阴性表达,而在毛囊隆突区阳性表达;体外分离的基底层表皮干细胞生长良好,具有较高的克隆形成率;干细胞标记物α 6-integrin、 K15呈阳性表达,流式细胞仪检测α 6-integrin达到84%,说明较为成功地体外分离培养出大鼠表皮基底层干细胞.结论 在表皮基底层、毛囊外根鞘区存在表皮干细胞.     

人牙髓干细胞的体外分离、培养及鉴定

目的 体外分离、培养及鉴定人牙髓干细胞,构建人牙髓干细胞系.方法 采用组织块酶消化法获取原代细胞,通过有限稀释克隆法纯化细胞;流式细胞仪检测细胞表面标记物;分别进行矿化诱导和成脂诱导,观察诱导后细胞矿化结节和脂滴形成情况.结果 原代培养后5～7d有细胞从组织边缘爬出,有限稀释法获得相对纯化均一的牙髓干细胞;流式细胞仪分析细胞表面抗原,CD29、CD90、CD105、CD146、STRO-1表达阳性,CD34及CD45表达阴性;矿化诱导的细胞茜素红染色镜下见矿化结节形成,成脂诱导的细胞油红O染色镜下见脂滴形成.结论 分离所得的细胞具有人牙髓干细胞的生物学特性,成功构建人牙髓干细胞系.     

大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养及初步鉴定

目的探讨并建立一种简便有效的体外分离纯化及扩增大鼠骨髓间质干细胞的方法,并研究其生物学特性,对其进行初步鉴定,为进一步诱导分化为胃黏膜上皮细胞奠定基础。方法利用贴壁培养法分离纯化SD大鼠骨髓间质干细胞,体外培养,传代扩增,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化,并用免疫组化方法鉴定骨髓间质干细胞表面CD29,CD44,CD34的表达。将加入成骨、成脂肪诱导剂的骨髓间质干细胞体外培养2～3周,观察细胞形态变化,并做油红0染色,鉴定成骨及成脂肪分化的结果。结果原代培养8—10d后可分离得到骨髓间质干细胞,且骨髓间质干细胞体外培养生长状况良好,呈均一的成纤维细胞样,传代周期为3～4d。免疫组化显示90％以上的骨髓间质干细胞CD29、CD44阳性,CD34阴性,且可以将其定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞。结论利用贴壁培养法可分离培养出大量大鼠骨髓间质干细胞,且此方法简便易行。     

大鼠海马神经干细胞的分离、培养及鉴定

目的：探寻出生后1～3d和成年大鼠海马分离、培养并鉴定神经干细胞(NSC)的可行性。方法向培养基添加碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子及其他生长因子，采用单细胞克隆技术，分离出生后1-3d和成年SD大鼠海马组织并分别无血清培养；以免疫细胞化学方法对原代和传代培养形成的克隆细胞，以及其分化后的细胞进行鉴定。结果上述条件下培养可形成悬浮生长的表达巢蛋白的神经球，且具有连续克隆的能力；分化后可得到具有网状联系的、分别呈神经元特异性烯醇化酶阳性和胶质纤维酸性蛋白阳性的神经元及胶质细胞。结论新生及成年SD大鼠海马存在神经干细胞．     

胎儿骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的从胎儿骨髓中分离培养纯化骨髓间充质干细胞(MSC),并进行细胞表面标志的检测,探讨MSC的培养方法。方法采用全骨髓培养、贴壁筛选法分离培养MSC,采用差速贴壁培养方法纯化细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面标志,并观察不同方法处理的培养界面对细胞贴壁和生长的影响。结果通过分离纯化培养,光镜下细胞形态以长梭形、不规则多角形为主;IV型胶原包被和Co60照射(照射量6GY)处理的培养瓶更利于MSC的贴壁、生长;流式细胞仪检测结果显示CD44( )、Stro-1( )、CD14(-)、CD34(-)、CD45(-)、CD11b(-)。结论采用贴壁筛选法和差速贴壁法结合可获得较高纯度的MSC,并且细胞生长良好,在体外具有较强的扩增能力。     

胎鼠肝nestin阳性细胞的分离培养和诱导分化研究

目的建立胎鼠肝nestin阳性细胞的体外分离、培养和诱导分化的方法。方法采用机械分离法结合悬滴培养法获得胎肝干细胞,原代培养2d后改变培养基,添加含20%胎牛血清的DMEM(含25ml/L葡萄糖,100U/ml青链霉素,pH值7.6),添加烟酰胺10mmol/L,胰岛素1mg/L,N2添加剂,碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、干细胞因子、白血病抑制因子各20μg/L诱导分化为nestin阳性细胞。结果和结论大鼠胎肝内存在nestin阳性细胞,在体外扩增后加入诱导剂可定向分化为胰岛β细胞。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养和鉴定

目的探讨大鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法取孕14~16 d的SD大鼠胚胎端脑皮层在条件培养基中培养增殖传代分化,用神经干细胞特异性抗体———巢蛋白(Nestin)鉴定克隆细胞,用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。结果获得了大量自我增殖并分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经干细胞。结论成功分离并获得了大鼠胚胎端脑皮层神经干细胞,并连续稳定传代,具有多向分化潜能,可用于进一步的实验研究。     

实验性大鼠肝脏星状细胞的培养

目的完善大鼠肝星形细胞(HSC)的体外分离及培养方法,为肝纤维化的基础实验研究提供技术支持。方法选用Wistar大鼠经消化酶灌注肝脏后,用分离液分离HSC,通过观察其自发荧光及其显著特征性结构的脂肪染色、细胞免疫化学染色等方法鉴定。结果分离得到HSC,细胞得率为2×107/只,存活率为96%。结论通过本法成功分离及培养HSC,且方法经济、简便、稳定,有利于原代大鼠肝星状细胞的生物学研究。     

大鼠成体肝卵圆细胞分离培养及诱导分化的初步研究

目的 通过成体大鼠肝卵圆细胞分离培养获取纯净的干细胞并观察诱导分化前后从肝卵圆细胞到肝细胞的形态变化.方法 采用AAF/PH肝干细胞刺激模型,胶原酶Ⅳ消化分离和Percoll梯度离心纯化肝卵圆细胞的方法,用地塞米松、DMSO和EGF、HGF、SCF、LIF等生长因子联合应用诱导肝卵圆细胞增殖和分化为肝实质细胞.观察肝卵圆细胞到肝细胞形态变化过程,用免疫荧光技术,Western blotting分析检测了干细胞标志c-kit和RT-PCR分析法检测肝干细胞白蛋白和CK19 mRNA表达鉴定卵圆细胞.结果 分离得到的肝卵圆细胞活度达到90%,细胞形态包括大小和颜色呈不均质,卵圆细胞直径是肝细胞直径的1/4～1/6.诱导后出现大而圆的肝细胞,可见卵圆细胞到肝细胞的中间变化过程,新分离的肝卵圆细胞在生长因子诱导下有向肝细胞分化的特性.经c-kit免疫荧光染色显黄绿色荧光,Western blotting检测肝卵圆细胞有c-kit蛋白条带,而大鼠肝细胞及胆管细胞则未出现条带.PCR分析显示卵圆细胞有CK19和白蛋白mRNA表达.结论 新分离的肝卵圆细胞同时表达c-kit,CK19和白蛋白3种抗原,诱导分化出现一系列从卵圆细胞到肝细胞的形态学变化,这种现象证明分离的肝卵圆细胞就是肝干细胞,经诱导分化可以产生成熟的肝细胞,成为进一步研究肝干细胞生物学特性的基础.     

大鼠神经干细胞分离培养及基因转染研究

目的：建立基因工程化神经干细胞以便为生物医学应用提供材料。方法：（1）分离,培养胚鼠端脑神经干细胞,并用巢素（Nestin)免疫组化染色鉴定;诱导神经干细胞分化,用神经丝－200（NF－200）,胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫组化染色鉴定分化细胞。（2）用含有脑源性神经营养因子（BDNF）的复制缺陷型腺病毒感染神经于细胞,并用原位杂交检测。结果：（1）获得了大量未分化,呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,且能分化为神经元和神经胶质细胞。（2）约80％－90％神经干细胞能被腺病毒感染,且经传代培养12代后仍具有干细胞特性。结论：从胚鼠端脑分离培养的细胞具有自我更新能力和多潜能分化能力,为中枢神经系统的干细胞,经基因工程化及传代后,仍具有干细胞特性,可作为基础研究及神经移植供体,具有广阔应用前景。     

具有双向分化潜能的鼠胎肝干细胞的分离、培养及鉴定

目的：优化体外分离、培养和筛选胎鼠肝脏干细胞（LSC）的方法,并鉴定其双向分化的潜能。方法通过密度梯度离心和细胞差异性贴壁法分离小鼠胎肝干细胞（FLSC）,以细胞平板克隆技术和四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定FLSC的增殖,通过添加二甲基亚砜（DMSO）和 HGF等诱导干细胞分化。结果分离后的FLSC 24 h内贴壁,卵圆形,排列紧密,1～2周内活化, CD133、CD49f、EPCAM的阳性率分别为（97．95±1．21）％、（92．71±3．49）％、和（50．73±3．45）％,表达甲胎蛋白（AFP）、细胞角蛋白19（CK19）;诱导分化后糖原染色（PAS）法染色可见红色糖原颗粒,表达清蛋白（ALB）、肝细胞核因子4α（HNF‐4α）。结论联合密度梯度离心和差异性贴壁法成功分离FLSC ,分离后的FLSC干性强,增殖能力强,具有向肝细胞和胆管上皮细胞双向分化的能力。     

正常大鼠肝脏祖细胞的分离和培养

目的探讨正常大鼠肝脏祖细胞的分离和体外培养方法。方法选择正常Wistar大鼠,以CD90．1为标志物,通过免疫磁珠法分离正常肝脏内的祖细胞。对祖细胞进行体外培养,并诱导分化。结果CD90．1阳性细胞占肝脏非实质细胞的（0．32±0．03）％,流式细胞仪分析显示CD90．1阳性细胞占分离细胞的（98．26±1．37）％。刚分离的CD90．1阳性细胞中,CK-19表达呈强阳性,HNF-4a表达呈阴性;培养8周后,CK-19表达呈阴性,HNF-4a表达呈阳性。结论正常大鼠肝脏内存在祖细胞,可将其诱导分化为肝细胞。