脂质体介导c—myc反义核酸对HL—60细胞作用的研究

原癌基因ｃ－ｍｙｃ参与调控细胞的增殖、分化和凋亡过程,在白血病细胞株ＨＬ－６０ 中有很高的表达。ｃ－ｍｙｃ通过扩增活化或基因重排而异常激活,在白血病的发生和发展中可能起着重要的作用。　目的　通过脂质体介导ｃ－ｍｙｃ反义核酸转染ＨＬ－６０ 细胞,观察其抑制细胞生长增殖、促进分化、诱导凋亡,降低ｃ－ｍｙｃｍ ＲＮＡ 和蛋白表达水平,探讨反义核酸的抗肿瘤作用机制。　方法　ＨＬ－６０ 细胞在３７℃、５％ＣＯ２ 条件下,培养于１０％ 小牛血清１６４０ 培养液中,细胞接种密度为４×１０７／Ｌ,反义核酸终浓度为１μｍ ｏｌ／Ｌ,反义核酸与脂质体比例为１ μｍ ｏｌ（６．５ μｇ）∶１０ μｇ,无血清转染６ ｈ。实验同时设置空白组、无义组、反义组、脂质体组、脂质体无义组等对照组。连续培养４ 天。通过锥虫蓝拒染实验测定细胞的生长能力;ＮＢＴ还原实验和瑞特－姬姆萨染色测定细胞的分化能力;免疫细胞化学染色检测ｃ－ｍｙｃ蛋白表达;ＲＴ－ＰＣＲ法检测ｃ－ｍｙｃ ｍ ＲＮＡ 水平;吖啶橙／溴化乙锭染色观察凋亡细胞形态;流式细胞仪检测凋亡率;ＤＮＡ抽提及电泳观察凋亡细胞ＤＮＡ降解片段的形成。　结果　脂质体转染ｃ－ｍｙｃ反义核酸的作用：（１）抑制ＨＬ－６０     

反义寡核苷酸抑制血管平滑肌细胞增殖

目的 证实反义ｃ－ｍｙｃ,ＰＣＮＡ寡核苷酸阻遏血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖的效应。方法 人工合成正义、反义及错配反义ｃ－ｍｙｃ,ＰＣＮＡ寡核苷酸,转入体外培养的ＶＳＭＣ中,分别于作用后１～５ｄ进行细胞计数和＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定。结果加入反义ｃ－ｍｙｃ,ＰＣＮＡ寡核苷酸的ＶＳＭＣ增殖受到抑制,崦正义和错配反义寡核苷酸对ＶＳＭＣ增殖没有明显影响。结论 反义ｃ－ｍｙｃ,ＰＣＮＡ寡核苷酸可有效阻遏     

N—ras和C—myc反义寡核苷酸与p53和p16基因联合抑制人肝 …

目的：研究反义癌基因与抑癌基因联合抑制肝癌细胞生长的效果。方法：利用基因重组方法构建携带ｐ１６基因、ｐ５３基因的融合表达载体（ｐｃＤＮＡ１６￣５３）,利用基因合成仪体外合成Ｎ－ｒａｓ、Ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸、并将Ｎ－ｒａｓ,Ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸与ｐｃＤＮＡ１６￣５３融合表达载体转染到人肝癌细胞系ＳＭＭＣ７７２１细胞中,观察肝癌细胞生长情况及软琼脂集落形成能力。结果：联合治疗组肝癌细胞增殖速度最慢     

Lipofectin介导DNA聚合酶α反义寡核苷酸抑制人胃癌细胞生长

目的 研究阳离子脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｐ）介导的ＤＮＡ聚合酶α（ＤＮＡ－ｐｏｌα）反义寡核酸（ＡＳＯＤＮ）体外抑制人胃癌细胞的生长。方法 合成与人ｐｏｌα催化亚基ｍＲＮＡ翻译起始区１８个碱基互补的寡核苷酸（ＯＤＮ）,与Ｌｉｐ混合制备Ｌｉｐ＋ＯＤＮ复合物,作用于ＭＧＣ－８０３、ＳＧＣ－７９０１人胃癌细胞２４ｈ后,细胞换液,继续培养２４ｈ,用噻唑蓝（ＭＴＴ）比色法测细胞存活状态,流式细胞术（     

三氧化二砷对NCI-H69肺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨三氧化二砷（ＡＳ２Ｏ３）对肺癌细胞株ＮＣＩ－Ｈ６９的增殖抑制和诱导凋亡作用。方法：ＭＴＴ法观察不同浓度ＡＳ２Ｏ３作用不同时间后的ＮＣＩ－Ｈ６９生长的产殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）单抗ＬＳＡＢ免疫组化染色－流式细胞仪检测ＰＣＮＡ阳性细胞百分比;ＦＴＩＣ－ＴＵＮＥＬ法－流式细胞仪检测细胞凋亡指数。结果：随ＡＳ２Ｏ３浓度增加和作用时间延长,ＮＣＩ－Ｈ６９肺癌细胞的细胞活度渐下降。随ＡＳ２Ｏ３浓度增     

反义核酸对人白血病HL—60细胞中c—myc基因表达的抑制

研究两个反义核酸（１８ｍｅｒ，２１ｍｅｒ）对人白血病ＨＬ－６０细胞中ｃ－ｍｙｃ基因表达的抑制作用。用ＨＬ－６０活细胞计数，ＲＮＡ含量的ＲＴ－ＰＣＲ测定和ｃ－ｍｙｃ基因蛋白的免疫组化染色检查，结果：两个反义核苷酸都以抑制ＨＬ－６０细胞的增殖，增殖抑制率为１１－７５％。反义核酸还抑制ｃ－ｍｙｃＲＮＡ和Ｍｙｃ蛋白的表达，而对ｃ－ｍｙｃ基因正常表达的红白血病细胞Ｋ５６２的增殖和ＰＨＡ刺激的人淋巴细胞的增殖     

急性白血病c—myc反义核酸基因治疗的实验研究

ｃ－ｍｙｃ基因是调控细胞增殖与分化的癌基因,在急性白血病细胞株及急性白血病、恶性淋巴瘤患者细胞中出现高表达,是影响这些恶性肿瘤发生、发展的重要基因之一。反义核酸治疗恶性肿瘤在技术上具有高效、简便、不需载体等特点,原理是根据碱基互补,将具有特异序列的反义寡核苷酸导入肿瘤细胞与靶基因上的相应部位结合,抑制和阻断相应基因的转录表达。　目的　应用针对ｃ－ｍｙｃ基因的两个反义核酸１５ｍ ｅｒ和１８ｍ ｅｒ作用于急性白血病细胞株和原代细胞,研究反义核酸对白血病细胞的生长、增殖,ｃ－ｍｙｃ ｍ ＲＮＡ 表达以及Ｐ６５ ｃ－ｍｙｃ蛋白表达率的改变,以及对细胞凋亡、分化方面的影响。　方法　采用锥虫蓝染色法测定细胞的拒染率,绘制细胞的生长曲线,用０．８％ 甲基纤维素半固体培养法进行克隆形成试验;用流式细胞仪检测在反义核酸作用前后的Ｐ６５ ｃ－ｍｙｃ 蛋白及凋亡率;用ＲＴ－ＰＣＲ 法检测ｃ－ｍｙｃｍ ＲＮＡ 的表达相对水平;电镜观察凋亡细胞的超微结构;ＤＮＡ 电泳分析凋亡片段;光镜下瑞特染色、ＮＢＴ染色观察细胞分化水平,流式细胞仪检测分化抗原表达,同时ＲＴ－ＰＣＲ检测分化细胞的ｍ ＲＮＡ 表达;ＭＴＴ 法检测反义核酸与化疗药物对细胞联合作用后对     

反义人PCNA基因真核表达载体pDR－PCNA的构建及鉴定

反义人ＰＣＮＡ基因真核表达载体ｐＤＲ－ＰＣＮＡ的构建及鉴定戴林，张学庸，惠宏襄，赵永同，王成济（西安西京医院消化内科西安７１００３３西安生物化学教研室）关键词ＰＣＮＡ基因；反义核酸；真核细胞；表达载体中图号Ｑ５２７．５增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）是ＤＮ...     

增殖细胞核抗原和血管内皮生长因子反义核酸基因治疗肝癌的实验研究

选择增殖细胞核抗原 (PCNA)和血管内皮生长因子(VEGF)作为靶基因 ,设计针对 PCNA m RNA和 VEGFm RNA的两种反义核酸作用于人肝癌细胞株及裸鼠肝癌模型 ,观察人肿瘤细胞增殖情况及生物学行为的变化 ,及对裸鼠致瘤的抑制效应。1.增殖细胞核抗原反义核酸抑制人肝癌细胞体外增殖的影响目的　根据 PCNA c DNA 序列设计合成与 PCNAm RNA AU G起始密码子后的 18位碱基序列互补的 PCNA反义寡核苷酸 ,作用于人肝癌细胞株 ,观察对肝癌细胞体外增殖的影响及生物学特性的改变。　方法　利用体外培养技术 ,通过细胞生长曲线测定、MTT…     

反义C—myc寡核苷酸对人肝癌细胞SMMC—7721的生长抑制

针对Ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ第二外显子起始妈ＡＵＧ及下游４个密码子设计合成了反义、正义及锚配寡核苷酸（ＯＤＮｓ）、并对合成的ＯＤＮｓ进行 硫代磷酸化修饰。在人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１培养体系中，对反义寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ）抑制细胞增殖的作用进行了研究。发现（１）与正义和错配ＯＤＮｓ相比较，反义Ｃ－ｍｙｃＯＤＮ有明显抑制人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１生长的作用；（２）该生长抑制作用随ＡＳＯＤＮ剂量增加而增     

增殖细胞核抗原反义寡核苷酸对裸鼠肝癌生长的影响

目的 探讨增殖细胞核抗原（PCNA）反义寡核苷酸对裸鼠人肝癌生长的抑制作用。方法 接种传代培养的人肝癌细胞于裸鼠皮下,接种后24h内局部注射PCNA反义寡核苷酸进行治疗。观察裸鼠的体重变化、瘤体大小,计算抑瘤率。HE染色观察肝癌组织结构和细胞形态改变。结果 PCNA反义寡核苷酸治疗组裸鼠肝癌的生长受到抑制,抑瘤率为72．8％。瘤重、肿瘤体积明显小于正义寡核苷酸治疗组及对照组。镜下见PCNA反义寡核苷酸治疗组肝癌细胞部分细胞形态呈梭形,核分裂相较少见,细胞的异型性较小。结论 PCNA反义寡核苷酸能显著抑制裸鼠肝癌的生长。     

反义PCNA基因片断抑制胶质瘤U251细胞增殖

目的 研究反义PCNA基因片断对胶质瘤细胞株U251的细胞增殖的抑制作用。方法 用脂质体介导寡核苷酸转染培养的U251胶质瘤细胞，以MTT法检测细胞增殖活性，RT-PCR、原位杂交和免疫组织化学方法分别检测相关基因和蛋白的表达，通过流式细胞仪检测细胞周期和TUNEL法检测细胞凋亡。结果 不同浓度的反义寡核苷酸对肿瘤细胞的增殖活性均有抑制作用，且有一定的剂量依赖性。PCNA反义寡核苷酸能够诱导胶质瘤细胞凋亡，且与反义寡核苷酸浓度和作用时间有关。结论 反义PCNA寡核苷酸片断能有效地抑制胶质瘤细胞的体外增殖，且能够诱导胶质瘤细胞的凋亡。     

PCNA的反义寡聚核苷酸抑制子宫颈癌HeLa细胞的研究

目的　检测脂质体介导增殖细胞核抗原 (PCNA)反义寡聚核苷酸抑制子宫颈癌细胞体外增殖活性效果。方法　应用细胞生长曲线和MTT比色法检测细胞增殖活性 ,并采用免疫组织化学方法 (SABC法 )检测PCNA蛋白的表达。结果　反义寡聚核苷酸处理组细胞与对照组比较生长曲线差异有显著性 ,增殖显著受抑 (P <0 0 5 ) ,PCNA蛋白表达完全抑制。而正义寡聚核苷酸组则无此作用 (P >0 0 5 )。结论　提示PCNA反义寡聚核苷酸可以显著抑制子宫颈癌细胞体外增殖活性 ,其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸体外抑制皮肤血管瘤内皮细胞的增殖

目的 观察血管内皮生长因子（VEGF）反义寡核苷酸对皮肤血管瘤内皮细胞体外增殖及生物学特性的影响，并探讨其机制。方法 体外培养皮肤血管瘤内皮细胞；脂质体介导VEGF反义寡核苷酸进行转染；MTT法观察其对内皮细胞生长的抑制；免疫细胞化学技术检测VEGF的蛋白表达；流式细胞仪分析细胞周期变化。结果 VEGF反义寡核苷酸作用后的内皮细胞生长明显受到抑制，作用后48hVEGF蛋白表达明显下降，细胞周期中S期细胞数明显减少，并于72h后抑制效应逐渐减弱。结论 VEGF反义寡核苷酸能显著抑制皮肤血管瘤内皮细胞的生长，其机制是抑制细胞的增殖，而不是促进其凋亡。     

胃癌及癌前病变细胞的凋亡与增殖

目的 了解胃癌及癌前病变中细胞凋亡和增殖状态的变化,探讨其在胃癌发生中的作用。方法 采用脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）技术和增殖细胞核抗原（PCNA）免疫组织化学染色法观察58例胃癌、27例癌前病变和15例正常胃粘膜组织中细胞凋亡和增殖状态。结果 胃癌组织中细胞凋亡指数显著低于胃正常粘膜和胃癌前病变组织（2．8％,6．3％,12％,P＜0．05）;胃癌前病变细胞凋亡指数明显上升,显著高于正常胃粘膜（P＜0．05）;在正常胃粘膜、癌前病变及胃癌组织中凋亡／增殖比率呈递减趋势而细胞增殖指数则呈递增趋势（P＜0．05）;细胞凋亡指数与肿瘤组织类型、分化程度、浸润深度和转移状况无关（P＞0．05）,细胞增殖指数与肿瘤浸润深度和转移状况无关（P＜0．05）。结论 细胞凋亡和增殖的失衡可能是胃粘膜组织恶性转化的重要因素之一。     

PCNA反义寡核苷酸治疗裸鼠骨肉瘤的效应

目的探讨增殖细胞核抗原（PCNA）反义寡核苷酸对裸鼠骨肉瘤生长的抑制作用。方法制备BALC／C裸鼠皮下骨肉瘤模型12只，随机分为PCNA反义寡核苷酸治疗组和对照组，每组6只。接种MG-63人成骨肉瘤细胞后24h内用PCNA反义寡核苷酸皮下注射进行治疗，对照组只注射生理盐水，每周2次，连续4周；观察各组裸鼠肿瘤的生长情况、裸鼠的一般情况与生存期。断颈处死裸鼠，游标卡尺测量肿瘤体积大小，天平称量肿瘤的重量。结果PCNA—ASODN治疗组裸鼠骨肉瘤的生长受到抑制，抑瘤率为46．53％。结论PCNA反义寡核苷酸对骨肉瘤的生长具有抑制作用，通过反义技术可抑制靶基因的表达，从而抑制骨肉瘤细胞的增殖。     

蜂毒素对肝癌细胞BEL-7402的增殖抑制作用

[目的]观察蜂毒素对肝癌细胞BEL-7402的增殖抑制作用。[方法]肝癌细胞BEL-7402体外培养,采用MTT法检测蜂毒素对其增殖抑制作用,流式细胞术测定蜂毒素对细胞增殖核抗原表达和细胞周期的影响。[结果]蜂毒素体外能够抑制BEL-7402肝癌细胞的增殖活性;并抑制细胞增殖核抗原的表达,呈剂量依赖性;干扰细胞周期,使S期细胞增加,G2/M期细胞减少。[结论]蜂毒素具有抑制BEL-7402肝癌细胞增殖的作用,机制可能与抑制细胞增殖核抗原表达和干扰细胞周期有关。     

肾癌增殖细胞核抗原和p53的表达

目的 探讨增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）ｐ５３与肾癌生物学行为的关系。方法 采用免疫组化Ｓ－Ｐ法检测ＰＣＮＡ和ｐ５３在肾癌不同组织学类型，病理分级和临床分期的表达情况，结果 （１）透明细胞癌与颗粒细胞癌间ＰＣＮＡ的表达差异无显著性（Ｐ〉０．０５），梭形细胞癌ＰＣＮＡ表达强阳性；（２）ＰＣＮＡ的表达与肾癌的病理分级及临床分期相关（Ｐ〈０．０５），随着肿瘤分组和分期增高ＰＣＮＡ表达呈上升趋势，高分期组（Ⅲ     

原癌基因蛋白质C—erb B—2及增殖细胞核抗原在结肠癌中的定量检测及临床意

目的 探讨原癌基因蛋白质Ｃ－ｅｒｂ Ｂ－２及增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）在结肠癌中含量及与结肠癌生物学行为的关系。方法 利用免疫组织化学及自动化图像分析技术定量检测Ｃ－ｅｒｂ Ｂ－２及ＰＣＮＡ在１０例正常肠粘膜,３０例结肠腺瘤,５３例结肠癌中的表达。结果 阳性总面积、积分光密度、阳性率１、平均光密度１及半定量测定的阳性率等６个参数值均按正常肠粘膜→Ⅰ级不典型增生腺瘤→Ⅱ级不典型增生腺瘤→Ⅲ级不典型增生腺瘤→腺癌的顺序呈递变趋势,伴有淋巴结转移的腺癌组中,上述各参数值明显增高。结论 Ｃ－ｅｒｂ Ｂ－２及ＰＣＮＡ一起可作为判断肿瘤的恶性程度及评价预后的指标,应用图像分析技术对结肠癌及癌前病变进行多指标多参数的计量分析,具有鉴别诊断的重要意义,为结肠癌的早期诊断提供客观依据。     

c-myc反义核苷酸对淋巴瘤细胞系CA46凋亡的作用

目的 研究c—myc反义核苷酸对体外培养的淋巴瘤细胞系CA46基因表达及诱导凋亡的作用。方法 c—myc反义核苷酸(ASPO)为人工合成的针对c—myc基因的一段外源性基因片段，以无义的寡核苷酸作为对照，导入CA46细胞后观察其基因表达及诱导凋亡的作用。流式细胞仪检测c—myc基因产物表达，荧光染色观察CA46细胞的凋亡形态，流式细胞仪定量检测凋亡百分率，TUNEL检测加用VP16后的CA46原位凋亡。结果 c—myc反义核苷酸(ASPO)作用CA46细胞后，RT—PCR示c—myc mRNA表达降低。荧光染色ASPO组细胞胞体缩小，胞膜完整，核质浓缩，出现黄绿色不规则或局部致密荧光，凋亡细胞约占23．3％，而SPO组及空白组未见明显凋亡细胞，细胞呈均匀绿色荧光。流式细胞仪检测仅用VP16 10mg／L 3d，ASPO作用2d后加VP16 10mg／L 1d及ASPO作用3d均出现凋亡峰，凋亡率分别为16％，72％及52％，而SPO组及空白但均未见凋亡峰。流式细胞仪检测CA46细胞c—myc蛋白为95．3％，经ASPO作用后降为23．7％，同时SPO组c—myc表达率为90．6％，TUNEL检测ASPO组凋亡细胞为25．5％，加用VP16后的CA46凋亡率为36．7％。结论 体外实验中CA46特异地被c—myc反义核酸抑制生长，细胞出现凋亡表现，c—myc mRNA癌基因表达降低。