小鼠耳蜗组织NT3基因的克隆及其原核表达鉴定

目的：克隆小鼠耳蜗组织中重要神经营养因子NT3的基因,并对其进行原核表达鉴定,为进一步研究该基因对内耳听觉功能的影响以及对耳聋的基因治疗提供基础。方法：根据所设计的引物用RT－PCR方法扩增目的基因,克隆人pUC19载体,行酶切鉴定和测序;然后进一步克隆人原核表达载体pDH,温度诱导表达,SDS－PAGE检测表达产物。结果：RT－PCR得到长度为777bp的基因片段,克隆后酶切鉴定正确,测序结果经BLAST对比,与GenBank中小鼠NT－3序列完全一致。成功构建了原核表达载体,经温度诱导表达出NT3蛋白。结论：从耳蜗组织中能获得正确的NT3基因克隆以及稳定的原核表达,为后续实验提供了保证。     

SOX9慢病毒表达载体的构建及其在LNcap细胞中的稳定表达

目的 构建SOX9基因慢病毒表达载体, 建立稳定表达SOX9的LNCa P细胞株.方法 PCR扩增SOX9基因, 将其克隆到慢病毒表达载体p LVX-IRES-Puro中, 双酶切和测序鉴定重组质粒.用HEK293细胞包装重组病毒颗粒并感染LNcap细胞, 经puromycin筛选获得稳定转染细胞株.q RT-PCR和Western Blot分别检测SOX9 m RNA水平及蛋白表达.结果 经双酶切和测序鉴定证实目的片段已插入到慢病毒表达载体上.重组质粒转入LNCa P细胞后经puromycin抗性筛获得稳定表达的细胞株, q RT-PCR检测到SOX9基因在转录水平的表达, Western blot分析显示SOX9蛋白高表达.结论 慢病毒表达载体p LVX-IRES-FLAG-SOX9构建成功, 实现了SOX9在LNcap细胞中的外源性表达.     

植烷酸氧化酶真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的 构建小鼠植烷酸氧化酶(Phyh)真核表达载体,并观察其在NIH 3T3细胞中的表达定位情况.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到Phyh编码序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH 3T3细胞;使用细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HA.Phyh在NIH 3T3细胞中的表达及蛋白定位进行分析.结果 PCR、双酶切和测序鉴定表明,pcDNA3/HA-Phyh真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH 3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞质中.结论 成功构建了带HA标签的小鼠Phyh真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH 3T3中表达,为进一步研究Phyh的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具.     

组织蛋白酶L基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的:构建组织蛋白酶L(CTSL)基因的真核表达质粒并进行表达鉴定.方法:采用RT-PCR技术从人卵巢癌组织总RNA中逆转录CTSL基因的cDNA全长,克隆到pMDl8-T载体上;亚克隆至pcI)NA3.1载体,重组阳性克隆进行酶切及测序鉴定,重组质粒瞬时转染HO8910细胞,RT-PCR和westeIn-blot检测CTSL基因和蛋白表达.结果:PCR克隆出CTSL cDNA全长,成功克隆人pMD18-T载体,亚克隆至pcDNA3.1载体,重组阳性克隆酶切及测序鉴定证实CTSL基因已正确插入pcD-NA3.1载体.RT-PCR和Western-blot结果证实CTSL基因能够在HO8910细胞中正确表达.结论:成功构建了CTSL基因的真核表达质粒,为下一步探讨CTSL基因在卵巢癌中的作用提供了实验基础.     

CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体的构建及体外表达的研究

目的 构建钙网织蛋白/黑素瘤抗原基因-A3(CRT/MAGE-A3)双基因重组腺病毒载体,并进行体外表达研究.方法 从表达质粒pcDNA3/CRT中切取目的片段CRT,定向克隆至穿梭载体pShuttle-GFP-CMV.根据Genbank中提供的黑素瘤基因序列,设计并合成引物,以人肺癌组织cDNA文库为模板采用RT-PCR技术扩增人黑素瘤抗原基因-A3基因片段,测序后将黑素瘤抗原基因-A3基因片段定向克隆至穿梭载体,进而将穿梭载体克隆至Pac Ⅰ限制性内切酶线性化的腺病毒载体pAdxsi.结果 目的 片段CRT转入穿梭载体后,酶切鉴定pShuttle-(△GFP)-CRT正确.人肺癌组织经RT-PCR扩增出大小约950 bp的基因片段,测序证实为MAGE-A3 DNA后,克隆至穿梭载体pShutde-(△GFP)-CRT构建穿梭载体pShuttle-CRT-MAGE-A3,酶切鉴定证实构建正确.酶切穿梭载体将双基因片段克隆至腺病毒载体pAdxsi得到Ad-CRT/MAGE-A3病毒载体,酶切鉴定证实构建成功.转染293LP细胞并用Western blot检测到其体外表达.结论 成功构建CRT/MAGE-A3重组腺病毒载体并证实其能在体外有效表达CRT蛋白及MAGE-A3蛋白.     

小鼠IDO基因重组腺病毒载体的构建表达和鉴定

目的 构建携带小鼠IDO基因的重组腺病毒载体,以期进一步进行研究其免疫学效应.方法 酶切含有小鼠全长IDOcDNA的PCOUS-2质粒,亚克隆至穿梭质粒pAdtrack-CMV上,在BJ5183细菌中和AdEasy-1进行同源重组,筛选阳性克隆,酶切、测序鉴定正确后,脂质体法转染AD-293细胞进行包装,扩增,氯化铯密度梯度离心纯化病毒并检测其滴度.RT-PCR和荧光显微镜鉴定和检测重组腺病毒转染AD-293细胞后IDO的表达,同时进行野生型腺病毒的检测.结果 经酶切及测序证实IDO基因重组腺病毒载体构建成功,RT-PCR检测到转染后AD-293细胞内IDO的表达,且无野生型腺病毒的产生.结论 成功构建了含小鼠IDO基因的重组腺病毒载体,为探讨IDO的生物学功能奠定了基础.     

iASPP真核表达载体的构建及其对NIH3T3细胞增殖的影响

目的：构建iASPP真核表达载体,稳定转染小鼠成纤维细胞（NIH3T3）并检测其表达,观察其对NIH3T3细胞增殖的影响。方法：设计引物以源克隆PCMV-iASPP为模板PCR扩增其中的CDS区,亚克隆入FLAG-pcDNA3.0,将该重组质粒转化DH5α感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆,经酶切、测序鉴定后,用脂质体介导转染NIH3T3细胞,G418加压筛选28 d,RT-PCR、West-ern blotting检测基因、蛋白表达;MTT法观察细胞增殖能力。结果：重组质粒鉴定正确,筛选所得阳性克隆中可以检测到iASPP基因的转录和表达,且该iASPP阳性表达细胞株增殖能力明显增强。结论：成功构建iASPP真核表达载体并成功构建稳定表达iASPP的NIH3T3细胞株,证明该基因的稳定表达在体外能显著增强NIH3T3细胞增殖能力。     

HEPC1和HEPC2真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建小鼠HEPC1和HEPC2基因的真核表达载体,并观察其分别稳定转染NIH3T3细胞后的表达情况.方法从小鼠肝组织中分离总RNA,采用RT-PCR获得小鼠HEPC1和HEPC2基因全长cDNA,分别将其克隆至真核表达载体pcDNA3上,酶切和测序鉴定后,用脂质体将重组子分别转染至NIH3T3细胞中,G418进行长期筛选,然后用RT-PCR和dot-ELISA检测HEPC1和HEPC2的表达.结果RT-PCR获得预期大小的片段,重组子pcDNA3-HEPC1和pcDNA3-HEPC2酶切正确,测序表明HEPC1有1个碱基与GenBank中报告的不同,但其位于密码子的第3位在此不改变编码的氨基酸,HEPC2则完全与GenBank中报道的一致,经RT-PCR和dot-ELISA检测HEPC1和HEPC2在其稳定转染的NIH3T3细胞中均有表达.结论成功构建了小鼠HEPC1和HEPC2基因的真核表达载体,HEPC1和HEPC2在其稳定转染的NIH3T3细胞中获得了表达,为下一步探讨HEPC1和HEPC2的功能及作用机制奠定了基础.     

mic2/CD99基因克隆及在霍奇金淋巴瘤L428细胞株中表达

目的克隆mic2/CD99基因并表达于L428细胞株。方法通过PCR及双酶切方法,从Jurkat细胞基因组RNA中获得mic2/CD99全长基因编码序列,克隆到pcDNA3.1（＋）质粒载体上,构建包含mic2/CD99全长基因载体;用脂质体转染法将mic2/CD99全长基因载体转染至L428细胞系;并从分子水平验证其存在。结果RT-PCR方法扩增出大小为558bp片段,序列测定其编码序列正确,酶切鉴定亚克隆序列正确。结论成功构建了mic2/CD99全长基因载体,并稳定转染于L428细胞株中。     

重组VIP腺病毒载体的构建及其在293细胞的表达

目的 构建血管活性肠肽重组腺病毒载体,以期用于体内实验研究.方法 利用RT-PCR扩增小鼠大脑VIP mRNA,亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,在pAdeasy内同源重组,筛选阳性克隆,酶切、测序鉴定正确,线性化后脂质体法转染293 细胞进行包装、扩增,利用报告基因EGFP对病毒滴度进行监测.PCR、免疫荧光鉴定pAdeasy-VIP感染293 细胞后VIP基因的表达,ELISA检测重组病毒转染后293细胞上清中的表达.结果 测序、酶切证实VIP基因重组腺病毒载体构建成功.RT-PCR,免疫荧光检测pAdeasy-VIP病毒感染的293细胞,均有VIP的表达.与对照组相比,重组病毒转染后293细胞上清中VIP多肽的表达明显增高.结论 成功构建了含小鼠VIP基因的重组腺病毒载体,并成功表达VIP多肽.     

小鼠肥大细胞瘤P815特异抗原P1A的克隆与表达

目的 克隆小鼠肥大细胞瘤Ｐ８１５细胞株的ＰＩＡ基因以制备肿瘤ＤＮＡ疫苗,方法 用ＲＴ－ＰＣＲ方法制备ＰＩＡ基因,以哺乳细胞高效表达质粒ｐＣＩ－ｎｅｏ为载体,构建重组ＤＮＡ疫苗。重组体用克隆位点上游和下游的Ｔ７和Ｔ１３启动了序列为测序引物,用自动测序仪测定鉴定克隆的正确性。再将鉴定过的重组质粒用磷酸钙法转化２９３细胞,用ＲＴ－ＰＣＲ法鉴定转化细胞中ＰＩＡ基因的表达。结果 正确构建了ＰＩＡ／ｐＣＩ－ｎ     

稳定表达人G250基因小鼠renca细胞株的建立

目的建立能够稳定表达人G250基因的renca细胞株。方法采用PCR扩增出人G250基因编码区长度的互补序列,根据DNA重组技术定向插入到pIRES-neo真核表达载体中,得到重组表达质粒pIRES-neo-G250。用阳离子脂质体介导法将该质粒稳定转染到renca小鼠细胞中,通过调整G418的浓度筛选出阳性的克隆,蛋白免疫印迹和免疫荧光测试验证人G250基因转染小鼠renca细胞株后的表达情况。结果经过限制性内切酶鉴定和序列分析发现pIRES-neo-G250重组质粒构建正确,蛋白免疫印迹结果表明,可以从稳定转染pIRES-neo-G250的小鼠renca细胞中检测到G250的蛋白条带,流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测结果表明,稳定转染pIRES-neo-G250的renca细胞用人的G250特异性抗体检测到有高效的荧光表达。结论成功建立了稳定、高效表达pIRES-neo-G250分子的人G250基因renca细胞株,为后续的肾癌疫苗研究奠定了基础。     

神经营养素4前导序列介导Exendin-4表达质粒的构建及鉴定

目的：构建神经营养素4前导序列介导的可分泌表达Exendin-4的重组腺伴病毒载体,为探究Exendin-4用于2型糖尿病临床治疗提供实验基础。方法：使用互补引物/模板法及Ｔ载体克隆法扩增Exendin-4的cDNA克隆,连接于NT4前导肽序列的3′端,融合基因NT4- Exendin-4亚克隆于穿梭质粒pSSHG,转染HEK-293细胞,包装病毒,斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果：经酶切、测序证实克隆出Exendin-4 cDNA,成功构建同一开放读码框ORF的NT4前导肽-Exendin-4cDNA克隆,得到高滴度（2.5×10⁹ pfu·L^-1） 的重组腺相关病毒。结论：通过分子克隆技术成功制备了Exendin-4的重组腺伴病毒载体pSSHG /NT4- Exendin-4并成功包装了较高浓度的重组病毒,为进一步研究Exendin-4功能及应用于临床打下基础。     

稳定表达神经营养素-3的NIH3T3细胞建立及鉴定

目的：建立稳定表达NT3的NIH3T3细胞株，通过体外共培养实验观察其对耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响．方法：以阳离子脂质体作为载体，将携带有外源性基因NT3的重组真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3转染小鼠成纤维细胞，进行RT-PCR，Western-blot分析及免疫组化鉴定，并与耳蜗螺旋神经节细胞进行共培养实验．结果：得到抗G-418的阳性细胞克隆；RT-PCR的产物约为744 bp；Western-blot可见一清晰的蛋白条带，与NT3的蛋白分子量相符合．NT3免疫组化染色结果显示转染NT3-cDNA的NIH3T3细胞胞质呈棕黄色着色．NT3转染组细胞与耳蜗螺旋神经节细胞共培养2wk后，与对照组相比，耳蜗螺旋神经节细胞无明显减少．结论：成功建立了稳定表达NT3的NIH3T3细胞株；该细胞对耳蜗螺旋神经节细胞有很好的营养支持作用．     

鸡贫血病毒VP3基因的克隆及在H22细胞中的凋亡诱导状况

目的 :观察CAV、VP3基因在H2 2细胞中的凋亡诱导情况。方法 :用PCR方法扩增了鸡贫血病毒标准株的VP3基因 ,并将其克隆于真核表达载体pcDNA3上 ,构建含VP3基因的重组体 ;在体外 ,利用LipofectAMINETM 介导的基因转染法 ,将pcDNA VP3、pcDNA3分别转入小鼠腹水型肝癌细胞系H2 2中 ,RT PCR法检测VP3基因在细胞中的表达状况。同时利用流式细胞检测术验证VP3基因诱导死亡的方式。结果 :酶切鉴定及测序分析表明 ,插入片段和预期相符 ,阳性重组体被命名为pcDNA VP3;RT PCR结果表明 ,转染后 ,VP3基因在细胞中得到了表达 ;同时DNA直方图也证实鸡贫血病毒的VP3基因确以凋亡的方式诱导细胞死亡。     

SOCS－3基因真核载体的构建及瞬时表达鉴定

目的构建含小鼠细胞因子信号抑制蛋白-3（SOCS-3）基因的重组pcDNA3.1质粒,同时瞬时转染后,鉴定其在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达。方法自小鼠肝脏标本中提取RNA进行RT—PCR,经克隆后获得pUC19-SOCS-3质粒,从中切出目的基因片段克隆至质粒pcDNA3．1中,以构建重组质粒pcDNA3.1-SOCS-3。后将构建完成的质粒瞬时转染COS-7细胞株,并随机分为未转染质粒组（对照组）、转染空质粒组和转染重组SOCS-3基因质粒组,同时采用免疫印迹法测定SOCS-3的表达。结果经测序鉴定证实,SOCS-3与美国国立生物技术信息中心核苷酸序列数据库提供的原始序列完全一致;同时经瞬时转染COS-7细胞后,转染重组质粒组的SOCS-3蛋白表达水平（光密度比值）显著高于对照组和转空质粒组（P〈0．01）。结论成功构建含小鼠SOCS-3基因的真核表达质粒,为进一步研究该基因在脂肪代谢中的抑制调节作用提供了技术平台。     

携带信号肽NT4-GFP-穿膜肽Ant融合基因的重组腺相关病毒载体的构建及意义

目的：构建携带具有穿膜功能的融合报告基因NT4-GFP-Ant基因的重组腺相关病毒载体。方法：应用PCR技术和T载体克隆法克隆绿色荧光蛋白（GFP）基因;用T4 DNA连接酶将测序正确的GFP与已构建成功的Ant基因片段及PBV220/NT4线性质粒载体定向连接,构建PBV220/NT4-GFP-Ant融合载体,酶切获取融合基因,并将其连入腺相关病毒载体PSSHG中,构建PSSHG/NT4-GFP-Ant重组腺相关载体并进行酶切鉴定。结果: T-easy/GFP经EcoRⅠ酶切后,可得到730 bp左右的片段,GFP基因经DNA测序证实与GenBank序列一致;pBV220/NT4-GFP-Ant经BamHI/EcoRⅠ联合双酶切后,得到约为 1 000 bp的基因片段; PSSHG /NT4-GFP-Ant经 BamHI/EcoRⅠ联合双酶切后,得到大小约为1 000 bp长度的基因片段。结论：成功克隆GFP基因,成功构建NT4信号肽-GFP-Ant穿膜肽融合基因和PSSHG/NT4-GFP-Ant重组腺相关病毒载体。     

RNA干扰A549细胞核干细胞因子基因表达

目的探讨A549细胞株NS基因的表达干扰后,A549细胞株的mRNA表达水平及细胞增殖变化。方法构建NSshRNA真核表达载体,转染A549细胞,G418筛选稳定表达细胞克隆,RT-PCR检测NS基因沉默,MTT检测细胞增殖情况。结果构建的NSshRNA真核表达载体经菌落PCR和测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致。RT-PCR检测显示构建的shRNA表达载体转染A549细胞后可显著降低NSmRNA的表达;M1vr结果显示干扰后细胞增殖速率明显减低。结论成功构建了一组针对NS基因的shRNA真核表达载体,转染A549细胞后NS基因表达被特异性沉默,且细胞增殖受到明显抑制,通过RNAi技术实现NS基因沉默可能是一种较有前景的肿瘤治疗方法。     

鼠源TRAIL真核表达质粒的构建及其抑瘤效应的初步观察

采用RT-PCR自小鼠脾细胞RNA中扩增出鼠TRAIL基因的全长cDNA，利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1中获得重组质粒pX1。经酶切鉴定及序列分析，表明成功构建TRAIL的真核表达质粒。通过直接肌肉内注射进行基因转染，pX1具有诱导肝癌细胞凋亡，抑制肝癌生长的作用。表明TRAIL可作为一种直接杀伤机制应用于肝癌的基因治疗。