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1.
目的 观察CD3εY171/P171点突变及bcl-2基因对T淋巴细胞凋亡的影响,方法 通过电穿孔对CD78阴性的人JurkatT(JK)淋巴细胞转染CD3εY171/P171点突变的CD8ε融合分子,对表达野生型CD8ε融合分子的人TJK转染bcl-2基因分别获得稳定表达细胞株(T1JK,TJK/bcl-2),利用CD8ε单克隆抗体刺激细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 CD3εY171/P1 相似文献
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目的 观察CD3εY171/P171 点突变及bcl- 2 基因对T 淋巴细胞凋亡的影响。方法 通过电穿孔对CD8 阴性的人Jurkat T(JK) 淋巴细胞转染CD3εY171/P171 点突变的CD8ε融合分子,对表达野生型CD8ε融合分子的人TJK 转染bcl- 2 基因分别获得稳定表达细胞株(T1JK,TJK/bcl- 2),利用CD8ε单克隆抗体刺激细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果CD3εY171/P171 点突变或bcl-2 表达增强后,细胞凋亡率均明显降低。结论 本文结果表明CD3εY171/P171 是CD8ε激活诱导细胞凋亡过程中的一个关键位点,bcl- 2 对CD8ε激活诱导细胞凋亡有抑制作用 相似文献
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为提高外周血造血干细胞动员、采集、和移植后造血重建的效率,作者从1997 年4 月至1999 年6月,进行了22 例异基因或自体外周血造血干细胞移植,对外周血造血干细胞动员、采集和移植后造血重建方案(HX-97 方案)作了系统观察。HX-97方案的主要内容是:①外周血造血干细胞动员,采用rhG-CSF300μg/天,皮下注射,共6 天,第6 剂在干细胞采集前90分钟用; ②自体外周血造血干细胞动员采用大剂量化疗加造血刺激因子,化疗强度务必使外周血WBC计数< 1.0×109 /L,待外周血WBC计数从最低点刚显示回升时,开始使用rhG-CSF;③移植后恢复造血序贯使用rhGM-CSF和rhG-CSF。造血干细胞动员后用COBESpectra 血细胞分离机连续采集外周血单个核细胞。结果:22 例移植中16 例一次采集即成功,6 例作了第二次采集。按受者体重计,采集后计数MNC细胞数2.5~10.7×108/kg;CD34+ 细胞2.5~20.0×106/kg;CD34+ CD33- 早期造血干细胞1.8~7.5×106/kg;CD34+ CD33+ 晚期造血祖细胞0.7~12.5×106 /kg;CFU-GM 集落3.5~6.3× 相似文献
4.
目的:探讨造血干细胞移植后7例白血病患者骨髓重建的血象变化规律。方法:采髓,应用百特CS-300分离外周血干细胞,动态观察移植后血象,骨髓象。结果:(1)移植后1-2周骨髓呈极度抑制,第3周出现恢复征象,5-6周骨髓造血恢复正常。(2)红系中最先出现中,晚幼红细胞,粒系以原始,早幼粒先出现,巨核系统恢复最慢;(3)平均血小板体积在处理后明显下降,随着造血功能恢复而逐步回升,早幼粒细胞数,血小板数回 相似文献
5.
目的:分析反义bcl-2对HL-60细胞凋亡的作用,为进一步研究凋亡机制打基础.方法:我们用lipofectin将插有反义bcl-2基因片段的重组逆转病毒载体pDOR-AB转染HL-60细胞,用核酸打点杂交方法检测转染效果和载体表达效果,用流式细胞仪检测bcl-2的改变及细胞周期的变化,用光镜和电镜观察转染细胞的形态学改变,并用转染的细胞对足叶乙甙敏感性的变化间接证明反义bcl-2的作用.结果:pDOR-AB转入HL-60细胞并表达bcl-2反义RNA;细胞内Bcl-2蛋白含量明显下降;细胞周期分析可见凋亡峰;电镜下可见凋亡细胞;DNA凝胶电泳出现梯状电泳带.结论:反义bcl-2瞬时表达可促进HL-60细胞的凋亡,bcl-2在HL-60细胞凋亡的调节中起重要作用 相似文献
6.
Bcl-2抑制CD3ε分子介导的T淋巴细胞凋亡 总被引:5,自引:0,他引:5
目的 研究Bcl-2过量表达对人Jurkat T淋巴细胞凋亡的影响。方法 采用电穿地将bcl-2基因表达载体转ε阳性的人Jurkat T淋巴细胞(TJK),获得稳定Bcl-2的细胞株(TJK/Bcl-2)后,用抗CD8单克隆抗体刺激和流式细胞仪检测细胞凋亡结果 Bcl-2过量表达可显著抑制TJK细胞凋亡。结果 Bcl-2参与CD3ε介导的T淋巴细胞凋亡的调控 相似文献
7.
朱春柳 《福建医科大学学报》1998,(2)
目的人白血病细胞系HL-60细胞高表达凋亡抑制基因bcl-2蛋白,是研究细胞增殖、凋亡的良好模型。通过脂质体转染bcl-2反义核酸,观察其对细胞增殖的抑制,对bcl-2蛋白表达影响,及诱导细胞凋亡出现。方法HL-60细胞在37℃、5%CO2条件下,培养于含15%小牛血清及含青、链霉素(每毫升各100U)的RPMI1640完全培养基中,细胞接种密度为107/L,反义核酸终浓度为5μmol/L,反义核酸与脂质体比例为1.0OD:50μl。脱离小牛血清转染24h,同时设置空白组、无义组、反义组、脂质体组、脂质体+无义组,再连续培养4天,做免疫组化,检测bcl-2蛋白表达。提取总RNA,行RT-PCR分析bcl-2mRNA表达,以及透射电镜检查,观察细胞凋亡情况及脂质体转染情形。结果脂质体转染bcl-2反义核酸的作用:(1)抑制HL-60细胞增殖,在转染后第五天最明显,经统计学处理,反义组与空白及无义对照组有显著性差别,脂质体转染反义核酸组与其余组均有统计上显著性差别。(2)降低bcl-2蛋白表达水平,处理前bcl-2免疫组化阳性率为62±1.48%,经转染bcl-2反义核酸处理后,bcl-2表达率为32.5±1. 相似文献
8.
反义bcl—2RNA促进HL—60细胞的凋亡 总被引:3,自引:2,他引:1
目的:分析反义bcl-2对HL-60细胞凋亡的作用,为进一步研究凋亡机制打基础,方法:我们用lipofectin将插有反义bcl-2基因片段的重组逆转病毒载体pDOR-AB转染HL-60细胞,用核酸打点杂交方法检测转染效果和载体表达效果,用流式细胞仪检测bcl-2的改变及细胞周期的变化,用光镜和电镜观察转染细胞的形态学改变,并用转染的细胞对足叶乙甙敏感性的变化间接证明反义bcl-2的作用,结果:p 相似文献
9.
目的:观察bcl2对K562细胞凋亡的影响。方法:用真核表达质粒p290bcl2转染K562细胞,用RTPCR和Westernblot检测bcl2mRNA和蛋白表达;用MTT实验检测K562细胞对化疗药物足叶乙甙的敏感性变化;用DNA“ladder”检测bcl2对凋亡的影响。结果:转染bcl2后K562的bcl2蛋白表达增高,细胞存活率明显提高,在足叶乙甙低于125μmol/L时检测不到凋亡梯形DNA;而K562细胞在足叶乙甙为32μmol/L时就能检测到凋亡梯形DNA。结论:若把bcl2导入正常造血干细胞,从而增强干细胞对化疗药物的耐受性,这将对化疗具有重要意义。 相似文献
10.
用HBV DNA二聚体转染高度分化的人肝癌细胞株(HepG2),筛选出具有分泌病毒抗原、核酸以及释放42nm Dane颗粒能力的z7-4细胞株。本实验结果支持3.5KbmRNA是前病毒基因,以它作模板可逆转录成1.6Kb(-)ssDNA,再合成(+)ssDNA,最后装配成4.0Kb和3.2KbdsDNA。在DNA印迹法中位于4.0Kb(D1)和3.2Kb(D2)处是病毒的松驰环状双股DNA(RCDNA),而1.6Kb和1.2Kb处的2条DNA带(S1和S2)均为单股DNA,这些不同位置的DNA带与病毒复制过程中DNA的构型和片断大小不同有关。本实验未能发现2.0KbcccDNA,但提示了负股DNA5’端连接有蛋白质引物。 相似文献
11.
转染bcl-2基因对心肌细胞缺氧耐受性的影响 总被引:4,自引:0,他引:4
目的 探讨转染bcl-2基因能否提高心肌细胞对缺氧的耐受性。方法 ①重组真核细胞表达载体。将含编码人bcl-2cDNA寒带开放阅读框的bcl-2cDNA重组至逆转录病毒载体-pLXSN的EcoRⅠ位点上,用脂质体包裹重度组质粒导入PA317细胞株,并经G418筛选阳性克隆;②用含高滴度重组病毒的上清感染心肌细胞,原位杂交鉴定其转染是否成功;③观察转染心肌细胞在缺氧环境下的生存率。结果 ①重组了含b 相似文献
12.
目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清. 相似文献
13.
目的 为探讨转染醛脱氢酶基因 (ALDH1)和多药耐药基因 (MDR1)的人脐血CD34 细胞能否同吮增强对活性环磷酰胺 ( 4 HC)和P gp转运泵靶药的抗性。方法 构建了同时含ALDH1和MDR1双耐药基因的逆转录病毒表达质粒G1Na ALDH1 IRES MDR1,经LipofectAMINE介导转染GP E86和PA317包装细胞 ,采用含长春新碱 (VCR)和 4 HC的培养基克隆选择后 ,收集重组病毒上清于单向型与双嗜型包装细胞行乒乓交互感染 ,获得PA317重组病毒生产细胞 (最高滴度达 5 6× 10 5CFU ml) ,将含ALDH1和MDR1耐药基因重组病毒上清在细胞生长因子刺激下重复感染人脐血CD34 细胞。结果 经PCR ,RT PCR ,Southernblot,Northernblot,FACS和MTT方法检测显示外源ALDH1与MDR1基因已经整合入转染靶细胞中基因组并获得有效表达 ,同时传递不同的耐药表型。经耐药基因修饰的脐血CD34 细胞对 4 HC和P gp转运泵靶药同时产生抗性 ,其IC50值分别比未转染细胞高 4倍 ( 4 HC) ,5 5倍 (柔红霉素 DNR)和 7 2倍 (VCR)。结论 双功能逆转录病毒载体介导两种不同耐药基因转染人脐血CD34 细胞能增强联合化疗抗性 ,本基因转移系统的建立为开展肿瘤基因治疗的临床研究奠定了实验基础。 相似文献
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含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK的建立 总被引:15,自引:2,他引:13
目的 :研究肿瘤的自杀基因疗法 ,建立含单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSVtk)基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK。 方法 :应用脂质体转移方法将逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,经G4 18筛选阳性克隆细胞后分别用PCR和扫描电镜检测HSVtk基因整合和病毒颗粒分泌情况。 结果 :逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,G4 18后筛选得到阳性克隆细胞 ,命名为PA317/TK。PCR检测PA317/TK细胞出现一特异性 4 0 4bp阳性条带 ,而PA317细胞没有扩增出相应条带。PA317/TK细胞经扫描电镜检测见其表面有颗粒状突起 ,其周围有许多呈团状的病毒颗粒。证实含HSVtk基因重组逆转录病毒存在于包装细胞中。 结论 :成功建立含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞 相似文献
16.
目的构建带有SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体.方法采用体外重组技术构建带SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体,酶切、测序进行鉴定,脂质体介导转染PA317包装细胞,经G418筛选出抗性克隆,通过NIH3T3细胞测定病毒滴度.结果酶切分析、测序证明重组逆转录病毒载体含有SV40LT抗原基因,且为正向插入.NIH3T3细胞测定病毒滴度为1.3×106CFU/ml.结论成功构建了含SV40LT抗原基因的逆转录病毒载体并包装出了高滴度的假病毒颗粒. 相似文献
17.
乙型肝炎病毒表面抗原单链抗体细胞内免疫抗乙型肝炎病毒基因治疗研究 总被引:3,自引:0,他引:3
目的 :研究乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)人源单链可变区抗体 (ScFv)细胞内免疫抗乙型肝炎病毒(HBV)基因治疗的作用。方法 :用噬菌体表面展示技术筛选特异性的HBsAg人源单链可变区抗体 ,聚合酶链反应(PCR)法扩增HBsAg单链抗体基因 ,并构建表达HBsAgScFv基因的重组逆转录病毒载体pLXSN HBsAgScFv,转染PA317细胞 ,将转染细胞分泌的假病毒颗粒感染 2 2 15细胞 ,酶联免疫吸附法 (ELISA)检测其上清HBsAg和HBeAg ,定量检测HBVDNA。结果 :成功筛选出HBsAgScFv ,PCR扩增出 75 0bp的全基因 ,构建HBsAgScFv基因的逆转录病毒载体 ,转染PA317细胞 ,在上清中检测出含HBsAgScFv假病毒颗粒的存在 ,上清感染 2 2 15细胞后第 3、5、7、14天 ,HBsAg、HBeAg逐渐下降 ,到第 14天时HBsAg已变为阴性 ,DNA定量检测无明显变化。结论 :HBsAgScFv能成功地在逆转录病毒载体中表达 ,并有抑制HBsAg、HBeAg表达的作用 相似文献
18.
mdr—1基因转移可提高肺癌细胞对阿霉素的抗性 总被引:1,自引:0,他引:1
以逆转录病毒介导,将人全长mdr-1cDNA导入人肺腺癌细胞系GLC82中,经G418和阿霉素筛选,挑选出3个阳性克隆。用mdr-1cDNA的一种特异引物在3个克隆中都扩增到1条167bp的带,表明mdr-1基因cDNA已稳定地整合在染色体基因组中。原位杂交显示转染细胞的mdr-1转录升高,免疫细胞化学发现转染细胞中P170糖蛋白呈弱阳性。MTT药敏实验表明3个克隆对阿霉素的抗药性分别是GLC细胞的6.4、7.0和8.8倍。提示在mdr-1基因cDNA转染的细胞中,mdr-1基因低表达足以大大提高细胞对药物的耐受性。 相似文献
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Bioactivities of culture supernatants from retroviral packaging cells carrying the mouse Fas ligand gene 总被引:1,自引:0,他引:1
CD95 ( Fas) ,type transmembrane protein ofTNF and TGF receptor family,is expressed on hu-man multi- organ and some tumor cells besides acti-vated mature T cells and lymphocytes transfected byHTLV- 1 ,HIV and EBV. Fas L is a typical type transmembrane protein,belonging to TNF family.Cells expressing Fas L are limited to activated T cells,cornea and testiculartissues.Fas L is a specific ligandfor Fas antigen.Cross- linking of Fas by Fas L in-duces Fas cellsto undergo apoptosis[1,2 … 相似文献
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HSV1-tk基因重组逆转录病毒载体的构建与表达 总被引:1,自引:0,他引:1
通过DNA重组技术,将HSV1 tk基因片段重组到含有HSV1 tk启动子的pN2A型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组DNA,以磷酸钙法转染ψ2,PA317包装细胞后,经G418筛选,抗性克隆细胞上清能成功地感染NIH3T3,细胞系测定平均滴度为6.2×105CFU/mL,最高可达1.5×106CFU/mL。 相似文献