小鼠PRL-3原核表达载体的构建

目的:构建小鼠PRL-3基因的原核表达载体,并在感受态细菌BL21中表达。方法:提取小鼠黑色素瘤B16F10细胞的总RNA,经RT-PCR扩增小鼠PRL-3基因,并将其克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,阳性克隆经限制性内切酶BamHI、EcoRI酶解及测序鉴定后,转化感受态细菌BL21,经IPTG诱导表达GST-mPRL-3融合蛋白。结果:获得全长为522bp的小鼠PRL-3基因片段,构建重组质粒pGEX-4T-1-mPRL-3,转化感受态细菌BL21后,经IPTG诱导,表达出分子质量约为46KD的GST-mPRL-3蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以可溶性形式存在于E.coli BL21的胞质中。结论:成功地构建了原核表达载体pGEX-4T-1-mPRL-3,为抗体的制备筛选和肿瘤的相关研究奠定了实验基础。     

人β细胞素基因原核表达载体的构建

目的构建人BTC基因的原核表达载体。方法以人胰岛细胞瘤CDNA为模板，采用聚合酶链式反应（PCK）扩增BTC基因成熟蛋白编码区的全部序列，克隆入原核细胞表达载体PET32a（＋）中，经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。结果PCK扩增的特异性片段长度为240bp，以此构建的重组质粒PET32a（＋）-BTC，经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后显示5．9kb和250bp左右的两条片段，测序结果与Genbank中的人BTC基因eDNA（Genbank序列号NM_001729）序列一致。证明人BTC基因已成功克隆到了原核细胞表达载体PET32a（＋）中。结论成功构建了PET32a（＋）-BTC重组原核表达载体。     

抗人膀胱癌单克隆抗体轻链可变区基因的克隆及其原核表达载体的构建

目的 克隆抗人膀胱癌单克隆抗体轻链可变区基因(VL)，并构建其原核表达载体。方法 从能分泌抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞BDI-1中提取总RNA，通过RT-PER扩增出VL cDNA。用HindⅢ和Xho Ⅰ酶切纯化的RT-PER产物和原核表达载体pET28a( )，在LDNA连接酶作用下室温连接，重组质粒经酶切鉴定，阳性克隆测序并进行序列分析。结果 扩增出VL cDNA片段，大小约为340bp，重组质粒的酶切鉴定结果与预期一致。VL基因序列长度为324bp，编码108个氨基酸。VL基因属于鼠免疫球蛋白κ轻链Ⅳ亚类。结论 成功克隆出抗人膀胱癌单克隆抗体轻链可变区基因．并成功构建其原核表达载体。     

靶向克隆法构建pET15b-VP3原核表达载体

目的探索利用PCR产物靶向克隆法构建能够表达凋亡素的pET15b-VP3原核表达载体。方法以PGEX-6P-1/TAT-VP3质粒为模板,PCR扩增VP3基因的366bp片段,应用靶向克隆酶,将VP3基因插入到线性pET15b,得到重组表达载体pET15b-VP3,经过筛选,挑选出阳性克隆进行XhoⅠ和BamHⅠ双酶切,图谱分析和重组质粒核苷酸序列分析以鉴定所构建的原核表达载体。结果 PCR产物经过电泳鉴定可见366bp特征性的VP3片段,重组质粒经双酶切电泳获得了一个大小为366bp的VP3片段,重组质粒测序证实VP3cDNA编码区成功地插入了pET15b,且其序列与GeneBank中VP3cDNA序列完全一致。结论靶向克隆法可快速,高效地构建pET15b-VP3原核表达载体,为进一步研究VP3药用价值奠定了基础。     

人PRL-3基因真核表达载体构建及相关蛋白生物信息学分析

目的克隆人PRL-3基因并构建其真核表达载体，并运用生物信息学方法对PRL-3的相互作用蛋白进行预测分析。方法运用RT—PCR技术，从人大肠癌细胞系SW480细胞中扩增出人PRL-3 cDNA，经T—A克隆，枸建人PRL-3基因的真核表达载体pcDNA3-PRL-3，通过双酶切鉴定及测序确认，并利用生物信息学方法预测分析其相互作用蛋白。结果成功扩增出人PRL-3全长cDNA，构建pcDNA3-PRL-3真核表达载体，测序结果表明PRL-3全长cDNA与GeneBank中PRL-3序列完全一致。利用模式生物果蝇相互作用蛋白数据库DIP，利用基于保守的蛋白相互作用分析方法，预测认为肌动蛋白家族成员ARP6和功能尚不清楚的小G蛋白家族ARL-3可能是PRL-3的相互作用蛋白，提示PRL-3可能是联系信号分子和细胞骨架系统的重要桥梁，参与构建了一条独特的结直肠癌转移信号途径。结论成功克隆PRL-3基因全长cDNA并构建其真核表达载体，并利用生物信息学方法，初步预测PRL-3的相互作用蛋白，为进一步深入研究PRL-3在大肠癌发生发展中的作用奠定了基础。     

小鼠耳蜗组织NT3基因的克隆及其原核表达鉴定

目的：克隆小鼠耳蜗组织中重要神经营养因子NT3的基因,并对其进行原核表达鉴定,为进一步研究该基因对内耳听觉功能的影响以及对耳聋的基因治疗提供基础。方法：根据所设计的引物用RT－PCR方法扩增目的基因,克隆人pUC19载体,行酶切鉴定和测序;然后进一步克隆人原核表达载体pDH,温度诱导表达,SDS－PAGE检测表达产物。结果：RT－PCR得到长度为777bp的基因片段,克隆后酶切鉴定正确,测序结果经BLAST对比,与GenBank中小鼠NT－3序列完全一致。成功构建了原核表达载体,经温度诱导表达出NT3蛋白。结论：从耳蜗组织中能获得正确的NT3基因克隆以及稳定的原核表达,为后续实验提供了保证。     

家蚕蚕蛹过敏原几丁质酶基因的克隆和原核表达载体的构建

目的 克隆、表达家蚕蚕蛹过敏原几丁质酶基因,并构建其原核表达载体.方法 提取家蚕的总RNA,RT-PCR克隆家蚕过敏原几丁质酶的全长基因,设计简并引物,扩增家蚕几丁质酶基因的完整开放阅读框,与pET-28a载体连接,构建原核表达载体.结果 成功克隆家蚕主要变应原几丁质酶基因并构建其原核表达载体.该基因含有长度为1 668 bp的开放阅读框,编码555个氨基酸.该蛋白质的相对分子质量为61 500,电点为5.78,编码序列与数据库中已知的家蚕几丁质酶基因的同源性为99%.结论 成功克隆家蚕蚕蛹主要过敏原几丁质酶基因并构建了原核表达载体,为家蚕蚕蛹过敏原几丁质酶的重组表达和免疫活性鉴定等奠定了基础.     

人CDC2基因的克隆和原核表达及鉴定

目的：从人肝癌组织中克隆出人细胞分裂周期基因2（ CDC2）,并在大肠杆菌中表达CDC2蛋白。方法：从人肝癌组织中提取RNA,采用RT-PCR法扩增CDC2 cDNA,用DNA凝胶回收试剂盒纯化并回收RT-PCR产物,将RT-PCR产物插入pET28a(+)载体NdeⅠ和 XhoⅠ两酶切位点之间,转化大肠杆菌BL21(DE3);IPTG诱导表达人CDC2蛋白。结果：RT-PCR扩增出约894 bp的DNA片段,与GenBank中的CDC2基因序列完全一致。经限制性内切图谱和测序鉴定,成功构建了pET28a(+)/CDC2原核表达载体。SDS-PAGE分析结果显示人CDC2蛋白在大肠杆菌中得已表达。结论：从人肝癌组织中成功地扩增出CDC2基因,并在大肠杆菌中表达。     

Migfilin基因的克隆和真核表达载体的构建

目的 克隆Migfilin全长cDNA,构建Flag-migfilin真核表达载体并进行序列测定,为研究migfilin与疾病的关系奠定基础.方法 根据人全长migfilin cDNA序列,设计PCR引物,以人前列腺癌cDNA文库为模板,利用PCR技术克隆migfilin全长cDNA.将扩增出的目的基因克隆至pCR 2.1载体,经Xba I/Hind Ⅲ双酶切后进行重组质粒鉴定,DNA序列测定.将测序正确的目的基因克隆至Flag载体并鉴定.结果 成功克隆了migfi-lin全长cDNA,序列测定表明与已知migfilin基因序列一致.在此基础上,构建了flag-migfilin真核表达载体并进行了鉴定.结论 Flag-migfilin真核表达载体构建成功,为深入探讨migfilin在大肠癌中的作用奠定了基础.     

人肥胖基因的克隆与原核表达载体的构建

目的：克隆人肥胖基因瘦素蛋白（leptin）编码区cDNA序列，并构建其原核表达载体。 方法：在人体脂肪组织中提取mRNA，利用RT-PCR扩增人肥胖基因，将其插入pMD18-T载体，经双酶切、鉴定后将肥胖基因片段亚克隆入pET-28a表达载体，提取质粒。将阳性重组质粒转化表达受体菌E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导肥胖基因表达产物,以聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测产物蛋白。 结果：经测序证实获得的肥胖基因序列与相关文献报道一致，其表达产物的相对分子质量约为20 000。 结论：利用pMD18-T克隆载体和pET-28a表达载体可以有效地在原核生物中表达重组人类瘦素蛋白。     

人β-防御素3的cDNA克隆和表达载体的构建

目的 克隆人β-防御素3(hβD-3)cDNA并构建其原核表达载体，为更深入的抗菌肽活性研究及制备新型肽类抗生素创造条件。方法 从人扁桃体组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增编码hβD-3成熟肽的cDNA序列，将其克隆至pUC18载体进行序列测定，然后构建于新型原核表达载体pQE-80L中。结果 RT-PCR扩增得到约135bp的目的DNA片断，序列分析与GenBank中报道的编码hβD-3成熟肽的cDNA序列完全一致。结论 hβD-3eDNA的克隆和原核表达载体的构建，为进一步制备抗耐药菌的肽类抗生素奠定了基础。     

PRL-3基因RNA干扰慢病毒载体的构建及在SW480细胞中的表达

目的 构建PRL-3基因慢病毒干扰载体及建立PRL-3基因稳定干扰的结直肠癌细胞亚系.为PRb-3基因功能研究奠定基础.方法 设计PRL-3基因特异性RNAi靶序列,与pENTRTM/U6线性载体定向连接,构建pENTRTM/U6真核入门表达载体.通过与pENTRTM/U6 entry clone与pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST载体进行重组,获得pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体.利用包装细胞293FT获得重组的慢病毒,感染大肠癌细胞株SW480细胞,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰PRL-3基因的细胞亚系.结果 成功构建PRL-3 pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为6×105U/L.RT-PCR、Western blotting结果 表明,克隆1 PRL-3mRNA及蛋白显著降低.结论 成功构建人PRL-3基因特异性的慢病毒干扰载体,获得PRL-3基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系.     

克隆人膀胱癌UROC28基因及其原核表达

目的：克隆人膀胱癌UROC28基因并在原核细胞中表达．方法：用RT—PCR从人膀胱癌患组织中扩增UROC28基因cDNA,并克隆到载体pUC-19中．经测序证实后,用HindⅢ／EcoRⅠ双酶切,亚克隆到原核表达载体pGEX—4T—1,并转化E．coli DH5α菌株．取工程菌,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS—PAGE鉴定．结果：①经RT—PCR、测序和酶切鉴定,成功地克隆了人膀胱癌UROC28基因;②经IPTG诱导的重组质粒pGEX4T—UROC28表达出Mr约为42000的融合蛋白,与预期的结果相符．结论：成功克隆到人膀胱癌UROC28基因,并在E．coli DH5α中表达出GST—UROC28融合蛋白。     

人KiSS-1基因克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆转移抑制基因KiSS-1的不含信号肽的表达序列,构建人KiSS-1基因的真核表达载体.方法:从人正常胰腺组织中提取总RNA,经RT-PCR得到KiSS-1基因开放阅读框cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建真核表达质粒pcDNA3/KiSS-1.结果:经PCR、酶切鉴定和基因序列测定,证实重组入载体pcDNA3的片段为目的基因开放阅读框的核苷酸序列.结论:重组质粒pcDNA3/KiSS-1的成功构建,为该基因相应蛋白质的表达和其抗体的制备研究提供基础.     

人羧肽酶A1活性中心基因的克隆及原核表达

目的：克隆人羧肽酶A1(carboxyrpeptidase A1，CPA1)活性中心基因，构建重组表达载体并对其进行诱导表达。方法：通过RT-PCR方法扩增出正常胰腺组织中CPA1活性中心基因，克隆入载体pGEM-Teasyr，测序分析．将该目的基因亚克隆于表达载体pGEX-4T-1，测序证实序列正确后转化大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导表达重组蛋白。结果：获得了人CPA1活性中心基因，构建了重组表达质粒，表达的蛋白以SDS-PAGE分析，在Mr约46000处出现一条新生蛋白带，经凝胶薄层扫描检测，表达量约占菌体总蛋白的22．1％。结论：成功克隆人CPA1活性中心基因并得到了其原核表达产物，为获得分子量小而具有相似活性的蛋白奠定了基础。     

人谷氧还蛋白1基因克隆及真核表达载体的构建

目的 从ECV304细胞中克隆谷氧还蛋白1(glutaredoxin1,Grx1)的cDNA序列并构建真核表达载体pcD-NA3.1( )-Grxl.方法 利用Trizol一步法从ECV304细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术从中获得Grx1的cD-NA,将质粒pcDNA3.1( )进行双酶切、CIP处理并回收纯化,与纯化后的Grx1cDNA连接构成重组表达载体pcD-NA3.1( )-Grx1,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆鉴定并进行测序分析.结果 经RT-PCR和测序鉴定,成功地克隆了人Grx1cDNA.结论 从ECV304细胞中获得Grx1的cDNA,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1( )-Grx1,对Grx1在体外表达、进一步研究其在氧化应激中的作用及其作用机制具有重要意义.     

人类TAP2基因克隆及真核表达质粒的构建

目的 克隆抗原处理相关转运体亚基TAP2基因片段并构建真核表达载体。方法 从EB病毒刺激的人B淋巴母细胞系(B-LCL)中提取总RNA,用RT-PCR从中扩增出TAP2 cDNA。将TAP2 cDNA插入表达载体pcDNA3．1／VS-His-TOPO中,构建重组表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO-TAP2,并进行测序分析。结果 经RT-PCR和测序鉴定,成功地克隆了人TAP2 cDNA。结论 获得了人TAP2 cDNA并构建了重组真核表达载体,对TAP2基因产物在体外表达、进一步研究TAP2分子在肿瘤基因治疗方面的作用具有重要的意义。