利用蛋白质A-琼脂糖CL-4B亲和层析柱纯化兔血清免疫球蛋白

本实验利用蛋白质A-琼脂糖CL-4B亲和层析柱从兔血清中一步提纯免疫球蛋白G(IgG)。一步法比多步法简便、快速,同时我们应用放射免疫活性测定、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析、快速蛋白质液相层析方法,对一步法和多步法提纯的IgG进行了比较,结果表明:一步法提纯的IgG在回收量、放射免疫活性及纯度三个方面不亚于多步法所得的产品。     

用2-亚胺生物素-AH-琼脂糖凝胶4B亲和层析纯化抗生物素蛋白

根据抗生物素蛋白和生物素之间的高度的亲和力发展起来的ABC(Avidin-Biotin-Enzyme Complex)技术已在免疫检测及核酸杂交方面得到了广泛的应用,建立一种快速提取高纯度抗生物素蛋白的方法,是促进该项技术发展的重要环节。     

固相(聚苯乙烯珠)放射免疫法检测HBsAg与抗-HBs

自HBsAg与抗-HBs系统发现以来,其检测方法已有很大发展。国内检测HBsAg常用方法有对流电泳(CEP),放射自显影(R-CEP),反向血凝法(RP-HA),固相免疫酶(DASS)。检测抗-HBs常用方法有间接血凝法(PHA)。由于这些方法有的灵敏度不够,操作复杂,有的重复性差等影响了广泛的应用。     

利用细菌荧光素酶建立酶联免疫吸附试验检测抗-HBs的研究

目的利用细菌荧光素酶作为示踪物,建立一种灵敏度高、特异性强、性能稳定、操作简便、无环境污染的生物发光酶酶联免疫检测技术(Bioluminescent enzyme linked immunosorbent assay BELISA)。方法用戊二醛作为交联剂,将细菌荧光素酶标记到乙型肝炎表面抗原上,使酶标记物具有酶和抗原的双重活性,采用双抗原夹心法检测。结果最适的标记条件为:细菌荧光素酶与乙型肝炎表面抗原的比例2:1,pH值7.0,反应温度室温(22℃),反应时间2小时,0.1％戊二醛用量50μl/ml标记物。所建立的生物发光酶酶联免疫试验检测抗-HBs灵敏度2.5mIU/ml,变异系数(CV)<15％。与抗-HAV·IgM阳性血清、抗-HCV阳性血清无交叉反应,阻断试验成立。对200份抗-HBs阴性血清(RIA-、ELISA-)进行BELISA检测,确定抗-HBs阴性血清光量子数为50MV/20s。对98份抗-HBs阳性血清(RIA+)进行BELISA和ELISA检测,BELISA检出98份阳性,与RIA符合率100％,而ELISA与RIA的符合率为89.9％,可见BELISA灵敏度与RIA相同。结论用细菌荧光素酶为示踪物建立的生物发光检测技术灵敏度高,特异性强,可取代放射免疫分析和以辣根过氧化物酶为示踪物建立的酶联免疫检测技术。     

WGA-Sepharose 4B柱亲和层析分离纯化血型糖蛋白A

人血型糖蛋白A（GPA）是一种富含唾液酸的膜固有蛋白，有着诸如血型活性，多病原体受体活性，生物活性物质6和某些外源性凝集素的受体等多方面的重要功能，为了进一步探讨GPA的结构与功能的关系，制备高纯度的GPA是很有必要的。为睇，本文采用能专一性结合唾液酸的麦胚凝集素（WGA）-Sepharose 4B,亲和层析纯化GPA。结果表明，本方法制得的GPA，在SDS-PAGE上为单一区带，过碘酸希夫试剂（PAS）染色也是一条区带。     

应用Protein A-Sepharose CL-4B亲和层析法纯化单克隆抗体

目的：纯化单克隆抗体（ 单抗,ＭｃＡｂ） 。方法：应用Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ制备免疫亲和层析柱,纯化载脂蛋白（Ａｐｏ）Ｅ４、ＡｐｏＥ６、抑制素（ｉｎｈｉｂｉｎＩＮＨ）α、βＡ、βＢ５ 种ＭｃＡｂ。结果：ＭｃＡｂ 纯化后电泳呈一条带,并有较好的免疫活性。结论：应用蛋白Ａ亲和层析法可以纯化ＭｃＡｂ。     

应用Protein A—Sepharose CL—4B亲和层析法纯化单克隆抗体

目的：纯化单克隆抗体（单抗,ＭｃＡｂ）方法：应用Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ－４Ｂ制备免疫亲和层析柱,纯化载脂蛋白（Ａｐｏ）Ｅ４、ＰＯｅ６、抑制素（ｉｎｈｉｂｉｎ ＩＮＨ）α、βＡ、βＢ５种ＭｃＡｂ。结果：ＭｃＡｂ纯化后电泳旦一条带,并有较好的免疫活性。结论：应用蛋白Ａ亲和层析法可以纯化ＭｃＡｂ。     

抗慢性B淋巴细胞白血病患者血清IgM McAb的纯化及其酶结合物的制备

应用DEAE-22纤维素离子交换柱和正辛酸法从接种杂交瘤细胞BALB/C 鼠的腹水或腹腔肿瘤浸出液中纯化抗慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)患者血清IgM 单克隆抗体(McAb),纯化物经巴比妥琼脂电泳,SDS-PAGE 鉴定为高纯度。ELISA 法证明具有高效价、高度特异性。采用过碘酸钠氧化结合法制备的辣根过氧化酶 HRPO-McAb 结合物的免疫活性、酶与蛋白质二者mol比、标记率均达到质量要求。     

泽泻醇B抗4T1乳腺癌细胞侵袭转移的体外研究

〖H探讨泽泻醇B（Alisol B）对乳腺癌细胞株4T1转移能力的抑制作用及可能机制。方法 4T1细胞经药物作用24h后,通过MTT法检测药物对细胞生长的影响;通过划痕试验及Transwell小室检测泽泻醇B对细胞侵袭和迁移能力的影响;通过Western blot 检测细胞经药物作用后对基质金属蛋白酶MMP2及MMP9蛋白表达水平的变化。结果 泽泻醇B对4T1细胞的生长具有一定的抑制作用。划痕实验显示泽泻醇B可显著抑制乳腺癌细胞的转移能力,细胞经药物（10μmol/L）作用24h后,其相对迁移率降至（52.66±8.48）%（P<0.01）。Transwell小室侵袭实验同样证实泽泻醇B能够有效抑制乳腺癌细胞的转移,经药物（10μmol/L）作用24h后,24h内细胞相对侵袭力下降至（47.06±9.32）%（P<0.01）。Western blot结果表明,泽泻醇B能够使癌细胞内MMP2及MMP9蛋白表达量显著下调。结论 泽泻醇B在体外能够有效抑制4T1乳腺癌细胞的转移,其机制可能与抑制细胞内基质金属蛋白酶的表达量有关。     

4种药用植物提取物体外抗柯萨奇病毒B3作用的研究

目的:研究三叶委陵菜、异叶蛇葡萄、蛇葡萄及细叶卷柏提取物对培养细胞的毒性、抗柯萨奇病毒 B3(CVB3)的作用及其机理。方法:通过观察药物毒性、病毒引起的细胞病变效应、MTT法检测细胞活性,判断药物毒性及药物抗病毒效应。结果:4种药物的半数毒性浓度(TC50)分别为7.2, 8.1, 8.7, 12.4μg·ml-1。三叶委陵菜、异叶蛇葡萄、细叶卷柏可直接杀伤病毒,半数抑制浓度(IC50)分别为0.52, 1.21, 0.53μg·ml-1,治疗指数(TI)分别为14, 6.7, 23;蛇葡萄、细叶卷柏可阻止病毒的吸附,IC50分别为0.56, 0.51μg·ml-1,TI分别为16, 23。药物不能抑制病毒的生物合成。结论:4种药物通过不同机制发挥抗CVB3的作用;但是同时对细胞也有一定的毒性作用,仍需进一步研究有效的抗病毒成份。     

泽泻醇B抗4T1乳腺癌细胞侵袭转移的体外研究

探讨泽泻醇B（Alisol B）对乳腺癌细胞株4T1转移能力的抑制作用及可能机制。方法 4T1细胞经药物作用24h后,通过MTT法检测药物对细胞生长的影响;通过划痕试验及Transwell小室检测泽泻醇B对细胞侵袭和迁移能力的影响;通过Western blot 检测细胞经药物作用后对基质金属蛋白酶MMP-2及MMP-9蛋白表达水平的变化。结果 泽泻醇B对4T1细胞的生长具有一定的抑制作用。划痕实验显示泽泻醇B可显著抑制乳腺癌细胞的转移能力,细胞经药物（10μmol/L）作用24h后,其相对迁移率降至（52.66±8.48）%（P<0.01）。Transwell小室侵袭实验同样证实泽泻醇B能够有效抑制乳腺癌细胞的转移,经药物（10μmol/L）作用24h后,24h内细胞相对侵袭力下降至（47.06±9.32）%（P<0.01）。Western blot结果表明,泽泻醇B能够使癌细胞内MMP-2及MMP-9蛋白表达量显著下调。结论 泽泻醇B在体外能够有效抑制4T1乳腺癌细胞的转移,其机制可能与抑制细胞内基质金属蛋白酶的表达量有关。     

B7-H4单抗3C8的纯化及对肿瘤免疫逃逸的阻断作用研究

采用Protein G亲和色谱及DEAE阴离子交换柱色谱分离纯化精制鼠源性B7-H4单克隆抗体3C8,结合流式检测可与B7-H4/293T转基因细胞株结合的目标抗体组分,获得了纯化的鼠源性B7-H4单克隆抗体3C8。反相柱色谱检测其纯度为93%,SDS-PAGE凝胶电泳鉴定证明经过两步柱色谱,目标抗体的纯度大大提高。流式细胞术检测发现3C8只与B7-H4/293T转基因细胞株结合,不与Mock/293T细胞结合,并且3C8也不与B7家族其他成员的转基因细胞株结合。激光共聚焦实验显示3C8可特异性染色B7-H4/293T转基因细胞,Western blot实验发现,以3C8作为一抗,B7-H4/293T转基因细胞有阳性条带而Mock/293T细胞没有条带。用3C8作为一抗进行免疫组化,结果显示,前列腺癌和肾癌组织特异性高表达B7-H4分子,而前列腺癌旁组织和肾癌癌旁组织B7-H4呈阴性表达。T细胞体外实验显示,B7-H4-Ig可特异性与活化T细胞结合,但3C8可阻断这种结合作用,并可逆转T细胞增殖抑制作用及T细胞因子分泌抑制作用。     

重组人β防御素4的原核表达、纯化及抗铜绿假单胞菌活性初探

目的制备原核表达的重组人β防御素4(human beta defensin 4,HBD4),初步探讨其对铜绿假单胞菌的体外抗菌活性.方法将编码HBD4的DNA片段连接到大肠杆菌表达载体pET42a中,构建好的表达质粒pET42a-HBD4转化到表达菌株BL21(DE3)中,0.5 mmol/L IPTG诱导表达4 h,亲和纯化融合蛋白后经Western blot鉴定,再以肠激酶酶切融合蛋白,镍柱亲和层析分离HBD4;采用打孔法初测其抗铜绿假单胞菌活性,并用微量稀释法测定HBD4与3种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),比较其抗铜绿假单胞菌活性并异.结果 GST-HBD4在大肠杆菌中以可溶形式成功表达,纯化的重组HBD4体外对铜绿假单胞菌有抗菌活性,其效能略低于亚胺培南,而高于哌拉和环丙沙星.结论采用基因工程技术成功表达了重组HBD4,其对铜绿假单胞菌有较强的杀菌活性,具有烧伤创面感染治疗的应用前景.     

天然抗角蛋白单克隆抗体3B4的多反应性鉴定及其分子机制的初步探讨

目的：对天然抗角蛋白单克隆抗体384的多反应性进行鉴定，并探讨其分子基础．方法：用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)和免疫组化法检测384与多种抗原的反应活性，分析其可变区基因与氨基酸序列．结果：384除与角蛋白和皮肤发生较强的反应外。尚能选择性与多种具有不同表位的抗原和不同的组织反应；同源性分析表明。其重、轻链可变区基因分别与胚系基因VH1 J558．42及VK1 am4高度同源；HCDR3区为该抗体区别于其他同源性较高的免疫球蛋白的惟一基序，     

以包涵体形式表达的6B11卵巢癌抗独特型单链抗体的复性、纯化和活性研究

目的：探讨以细菌胞浆内包涵体形式表达的６Ｂ１１卵巢癌抗独特型单链抗体（６Ｂ１１ｓｃＦｖ）的复性、纯化及其活性。方法：重组质粒ｐＬ６Ｂ１１ｓｃＦｖ转化大肠杆菌ｐｏｐ２１３６，温度诱导，以包涵体形式获高效表达。超声破碎细菌细胞得包涵体，用８ｍｏｌ·Ｌ－１尿素溶解包涵体后直接稀释复性，探讨复性条件并采用ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层析纯化复性蛋白，ＳＤＳＰＡＧＥ分析蛋白纯度，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ、ＥＬＩＳＡ及竞争抑制ＥＬＩＳＡ测活性。结果：复性蛋白质经纯化，纯度达９５％以上。当氧化型谷胱甘肽（ＧＳＳＧ）浓度为５ｍｍｏｌ·Ｌ－１，还原型谷胱甘肽（ＧＳＨ）浓度为０．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１，１０℃复性４８ｈ以上时，复性率较高。纯化后的表达蛋白６Ｂ１１ｓｃＦｖ能与ＨＲＰＣＯＣ１６６９卵巢癌单抗反应并与卵巢癌抗原共同竞争结合卵巢癌单抗ＣＯＣ１６６９，抑制率达６７％，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ显示其相对分子质量为２８×１０４，证明纯化后的表达蛋白质，能模拟卵巢癌抗原与卵巢癌单抗特异结合。结论：以包涵体表达的６Ｂ１１ｓｃＦｖ，经溶解复性纯化后，纯度高，活性好。     

利用DNA免疫技术制备抗登革2型病毒NS2B蛋白多克隆抗体

目的构建登革2型病毒(dengue virus serotype2,DV2)非结构蛋白NS2B的真核表达质粒pCAGGS-P7/NS2B,进行DNA免疫,制备小鼠抗NS2B特异性多克隆抗体。方法PCR扩增DV2-NS2B基因片段,构建真核表达载体pCAGGS-P7/NS2B,采用脂质体介导的方法转染Vero细胞,检测目标蛋白的表达。用该表达质粒免疫BALB/c小鼠,制备抗NS2B抗血清。结果成功构建真核表达重组质粒pCAGGS-P7/NS2B,该重组质粒具有良好的免疫原性,免疫小鼠后所获的抗血清,抗体效价达1∶3200,Western blot和间接免疫荧光证实抗血清能特异性地识别DV2-NS2B蛋白。结论通过DNA免疫所制备小鼠抗DV2-NS2B抗血清能特异性地识别DV2-NS2B蛋白。     

单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4体外抑制白念珠菌芽管形成及粘附作用

目的:观察单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4在体外抑制白念珠菌芽管形成及抑制白念珠菌与宿主细胞粘附的作用.方法:将不同浓度的单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4分别与白念珠菌酵母相悬液在有利于芽管形成的条件下共同孵育,倒置显微镜下计数白念珠菌总数以及白念珠菌芽管数;将不同浓度的单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4与白念珠菌酵母相和人角质形成细胞混悬液、白念珠菌酵母相和人口腔黏膜上皮细胞混悬液、白念珠菌酵母相和胎儿脐静脉内皮细胞混悬液共同孵育,分别计数人角质形成细胞、人口腔黏膜上皮细胞、胎儿脐静脉内皮细胞上粘附的白念珠菌数.结果:与对照组比较,不同浓度的单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4均能抑制白念珠菌芽管生成,并且抗体浓度越高,抑制白念珠菌芽管形成的作用越明显;同时单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4能够显著减少白念珠菌与角质形成细胞、上皮细胞、内皮细胞的粘附,其抑制作用与单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4的浓度呈正相关.结论:单克隆天然抗角蛋白抗体IgM 3B4在体外能够抑制白念珠菌芽管形成,能够抑制白念珠菌与人角质形成细胞、人口腔黏膜上皮细胞、胎儿脐静脉内皮细胞的粘附,从而降低白念珠菌的侵袭力,提示天然抗体IgM在机体抗真菌感染的天然免疫中可能具有积极的作用.     

利用CRISPR/Cas9技术构建Aff4基因敲除B16-F10细胞系及AFF4的多克隆抗体制备

目的：利用CRISPR/Cas9技术构建ALF转录伸长因子4(AFF4)基因敲除的小鼠黑色素瘤细胞（B16-F10）,自主制备特异的AFF4多克隆抗体。方法：设计一对分别靶向小鼠Aff4基因第3个外显子和第4个内含子的向导RNA(sgRNA)。将构建成功的重组质粒转染至B16-F10细胞中,并利用抗性筛选出单克隆细胞,进行基因型鉴定和AFF4表达水平检测。验证自主制备的AFF4多克隆抗体的特异性。结果：通过基因组DNA鉴定获得两株正确的单克隆细胞系,其Aff4基因m RNA水平（t=53.08,P<0.001）和AFF4蛋白表达水平（t=15.17,P<0.001）显著降低。免疫共沉淀实验和蛋白免疫印迹实验证明自主制备的抗人/鼠AFF4多克隆抗体特异性良好（t=264.7,P<0.000 1）。结论：成功构建了Aff4基因敲除的B16-F10稳定细胞系,并且成功制备抗AFF4蛋白的多克隆抗体。