Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞Tau蛋白的过度磷酸化

目的采用凝聚态Aβ25-35建立Tau蛋白过度磷酸化的阿尔茨海默病样细胞模型.方法用不同浓度凝聚态Aβ25-35作用于SH-SY5Y细胞24,48,72 h,通过四唑盐比色法及乳酸脱氢酶释放实验观察Aβ25-35对SH-SY5Y细胞存活的影响;选择对细胞存活影响较小的适宜浓度和作用时间处理细胞,以蛋白免疫印迹法研究Tau蛋白磷酸化水平的变化.结果 Aβ25-35对细胞存活的影响随着作用时间的延长或作用浓度的增加而增强.10 μmol/L Aβ25-35作用于细胞72 h或20 μmol/L Aβ25-35作用于细胞≥48 h时,MTT代谢率均明显下降(P<0.05).Aβ25-35作用浓度>20 μmol/L作用72 h后,细胞LDH释放率明显增加(P<0.05).选用细胞毒性小的10,20 μmol/L Aβ25-35作用于SH-SY5Y细胞0,3,6,12,24,48 h,蛋白免疫印迹示Tau蛋白在Ser396、Ser199/202位点的磷酸化水平增高,于6 h达到最高峰.结论凝聚态Aβ25-35可诱导建立阿尔茨海默病样Tau蛋白过度磷酸化的细胞模型.     

Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞Tau蛋白的过度磷酸化

目的采用凝聚态Aβ25-35建立Tau蛋白过度磷酸化的阿尔茨海默病样细胞模型.方法用不同浓度凝聚态Aβ25-35作用于SH-SY5Y细胞24,48,72 h,通过四唑盐比色法及乳酸脱氢酶释放实验观察Aβ25-35对SH-SY5Y细胞存活的影响;选择对细胞存活影响较小的适宜浓度和作用时间处理细胞,以蛋白免疫印迹法研究Tau蛋白磷酸化水平的变化.结果 Aβ25-35对细胞存活的影响随着作用时间的延长或作用浓度的增加而增强.10 μmol/L Aβ25-35作用于细胞72 h或20 μmol/L Aβ25-35作用于细胞≥48 h时,MTT代谢率均明显下降(P<0.05).Aβ25-35作用浓度>20 μmol/L作用72 h后,细胞LDH释放率明显增加(P<0.05).选用细胞毒性小的10,20 μmol/L Aβ25-35作用于SH-SY5Y细胞0,3,6,12,24,48 h,蛋白免疫印迹示Tau蛋白在Ser396、Ser199/202位点的磷酸化水平增高,于6 h达到最高峰.结论凝聚态Aβ25-35可诱导建立阿尔茨海默病样Tau蛋白过度磷酸化的细胞模型.     

Aβ25-35对体外培养大鼠神经干细胞分化的影响

目的 探讨β淀粉样蛋白（Aβ25-35）对体外培养神经干细胞分化的影响和机制.方法 分离培养新生SD大鼠经干细胞,加入10%的胎牛血清使其分化7 d时,一部分细胞用Aβ25-35作用12 h,观测细胞生长状态,运用免疫细胞化学和免疫蛋白印记迹术研究各组Tau蛋白在Ser396,Ser262位点磷酸化水平变化及活化型GSK-3β[pTyr279,216]的表达水平.结果 呈球形生长的神经干细胞在加入胎牛血清培养液后,逐渐从球的周边分化出神经细胞,长出神经细胞样的触突,在Aβ25-35作用下,分化细胞的突起粗大且生长速度较快.免疫细胞化学染色和Western-blot结果显示,所有分化细胞都有Tau[pS396]、Tau[pS262]、GSK-3β[pTyr279,216]表达,但经Aβ处理后表达量增高.结论 Aβ25-35可通过上调GSK-3β的表达提高Tau蛋白磷酸化水平,促进神经干细胞向神经细胞分化.     

叶酸对N2a-APP695细胞Tau蛋白及其Ser396位点磷酸化的调控

目的:研究叶酸对转染人APP695质粒的小鼠成神经瘤细胞(N2a)Tau蛋白的表达及其磷酸化修饰的影响.方法:稳定转染人APP695质粒的N2a细胞根据叶酸不同剂量分为4组,叶酸缺乏组(0μmol/L)、叶酸正常组(10 μmol/L)、叶酸低剂量组(20μmol/L)、叶酸高剂量组(40 μmol/L).各组细胞作用96 h后,用Real-time PCR检测其tau mRNA表达,用Western blot检测Tau总蛋白以及磷酸化Tau蛋白(p-Tau Ser396)的表达.结果:与叶酸正常组相比,叶酸的添加对tau mRNA及总蛋白的表达水平作用不明显;叶酸对Tau蛋白Ser396位点磷酸化有显著的影响,随叶酸剂量的增加Tau Ser396位点去磷酸化逐渐增强.结论:添加叶酸能对Alzheimer's disease(AD)模型细胞中磷酸化Tau蛋白Ser396位点有显著的去磷酸化作用,提示叶酸对AD可能具有一定的治疗作用.     

秦皮乙素对Aβ_(25-35)诱导的Tau蛋白过度磷酸化的作用

目的用Aβ25-35诱导HEK293细胞的Tau蛋白过度磷酸化建立Tau蛋白过度磷酸化的模型,探讨秦皮乙素(Esc)对该模型的作用及可能机制。方法采用不同浓度的Esc预孵HEK293细胞24 h,再用Aβ25-35诱导Tau蛋白过度磷酸化,Western blot检测Tau蛋白Ser396、Ser199位点磷酸化水平及GSK-3β磷酸化水平,以评价Esc对Aβ25-35诱导Tau蛋白过度磷酸化的影响及可能的作用机制。结果 10μmol/L Aβ25-35作用于HEK293细胞6 h,Tau蛋白Ser396和Ser199位点磷酸化水平分别是正常对照组的2.1和2.0倍,GSK-3β磷酸化水平增加至对照组的1.4倍,而预孵Esc(50、100、200μmol/L)24 h均可降低上述3个指标,其中200μmol/L作用最强,可使上述指标分别降低(57.2±5.3)%、(53.4±3.0)%和(59.3±2.1)%,与模型组比较差异均有统计学意义(P0.05)。预孵10 mmol/L LiCl可使上述指标分别降低(39.4±5.6)%、(36.7±2.8)%和(39.6±2.6)%,与模型组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论Esc可降低Aβ25-35诱导的HEK293细胞Tau蛋白Ser396和Ser199位点过度磷酸化,该作用可能与Esc抑制GSK-3β活性有关。     

IGF-1对Aβ1-40诱导PC12细胞tau蛋白过度磷酸化的保护作用及其机制研究

目的 探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对β样淀粉蛋白(Aβ1-40)引起的PC12细胞tau蛋白磷酸化的保护作用及其机制.方法 通过MTT法观察不同浓度的IGF-1对PC12细胞存活的影响.应用蛋白免疫印迹方法,检测Aβ1-40处理后PCI2细胞tau蛋白磷酸化、总tau蛋白、糖原合成激酶3 β(GSK-3β)和磷酸化GSK-3βSer9的表达情况;观察IGF-1或GSK-3β特异性抑制剂氯化锂(IACl)对Aβ1-40诱导PCI2细胞上述指标变化的影响.结果 不同浓度的IGF-1均能提高PC12细胞生存率,1μg/mL IGF-1作用最明显.tau蛋白Ser396、Ser199/202位点的磷酸化水平在Aβ1-40诱导后3 h开始增高,12 h达到高峰;总tau蛋白的变化趋势与tau蛋白磷酸化的改变大体一致.在tau蛋白磷酸化达高峰时,GSK-3β的表达增加而磷酸化GSK-3βSer9的表达减少.用IGF-1或LiCl处理后,可减轻Aβ1-40所诱导的tau蛋白过度磷酸化,同时GSK-3β的表达下降而磷酸化GSK-3βSer9的表达增加.结论 Aβ1-40可使PC12细胞tau蛋白Ser396、Ser199/202位点的磷酸化水平增高,该作用主要通过激活GSK-3β实现.IGF-1可抑制GSK-3β的活性,最终达到减轻Aβ1-40所诱导的PC12细胞tau蛋白过度磷酸化的作用.     

PTEN与磷酸化tau蛋白水平在Aβ25-35诱导的AD样细胞模型中的变化

目的探讨在Aβ25-35诱导人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞和大鼠胎鼠皮层原代神经元细胞的过程中PTEN及磷酸化tau(Ser396)蛋白水平的变化。方法 40μmol/L和20μmol/L的Aβ25-35分别孵育SH-SY5Y细胞和大鼠原代皮层神经元,孵育后的不同时间点MTT法测定细胞活力,显微镜观察细胞形态的变化,免疫印迹法观测各时间点磷酸化tau(Ser396)蛋白水平来确定模型的建立;同时观察在此过程中PTEN蛋白水平的变化。结果随着Aβ25-35孵育时间的延长,SH-SY5Y细胞和大鼠皮层原代神经元细胞逐渐出现细胞活力下降,细胞胞体变圆,突起回缩甚至消失,细胞间连接断裂等现象,细胞磷酸化tau(Ser396)蛋白水平于诱导后6h升高,12～24h达到高峰;PTEN蛋白水平于3h左右开始升高,6～12h达到高峰,后逐渐下降,48h甚至低于正常对照组,且PTEN蛋白水平的升高先于磷酸化tau(Ser396)蛋白水平的升高。结论 PTEN与Aβ25-35诱导的阿尔茨海默病样细胞模型的发生发展可能具有一定的关联性,在其发生早期PTEN表达可能增强。     

丝素肽对Aβ25-35致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及机制研究

探讨丝素肽对Aβ_25-35所致SH-SY5Y细胞损伤的保护作用及其相关机制。建立Aβ_25-35损伤SH-SY5Y细胞模型,并以丝素肽干预。MTT法检测丝素肽对Aβ_25-35致SH-SY5Y细胞损伤的干预作用;Western blot检测丝素肽对Aβ_25-35致神经元Tau蛋白多位点过度磷酸化的影响及其作用机制;DCFH-DA探针法检测丝素肽对Aβ_25-35致SH-SY5Y细胞胞内活性氧(ROS)异常升高的影响。结果表明,丝素肽可改善Aβ_25-35致SH-SY5Y细胞损伤。丝素肽可通过抑制GSK-3β活性、增强PP2A活性,改善Aβ_25-35引起的神经元Tau蛋白异常磷酸化水平,提示丝素肽可通过调节Tau蛋白的磷酸化发挥神经保护作用。同时,丝素肽可降低Aβ_25-35引起的SH-SY5Y细胞胞内升高的ROS水平,提示丝素肽还可通过调节氧化应激反应途径保护神经元。     

巨细胞病毒宫内感染对子代豚鼠海马神经元Tau蛋白磷酸化的影响

目的:研究巨细胞病毒(CMV)宫内感染对子代豚鼠海马神经元Tau蛋白磷酸化的影响。方法:建立豚鼠CMV宫内感染动物模型,PCR法筛选CMV DNA阴性豚鼠,雌雄同笼受孕;孕龄1-20d时,随机分成两组:感染组腹腔内接种CMV病毒悬液,对照组接种生理盐水,足月分娩的子代豚鼠喂养至3月龄后无菌采集脑组织,应用免疫组织化学法和免疫印迹法检测各组子代豚鼠海马神经元Tau、p-Tau(Ser 404)、PKA及PP2A蛋白表达水平。结果:与对照组相比,感染组子代豚鼠海马神经元Tau、p-Tau(Ser 404)及PKA蛋白的表达水平明显上升,而PP2A蛋白的表达水平明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:CMV宫内感染导致子代豚鼠海马神经元Tau蛋白磷酸化水平增加,可能与PKA及PP2A蛋白的表达异常相关。     

阻断酪氨酸蛋白激酶Src表达对蛋白磷酸酯酶2A活性和tau蛋白磷酸化的影响

研究细胞内酪氨酸蛋白激酶Src对蛋白磷酸酯酶2A（PP2A）酪氨酸307位点（Y307）磷酸化和活性以及tau蛋白磷酸化的影响，为阿尔茨海默病脑内PP2A活性下调和tau蛋白异常磷酸化机制提供实验依据。体外培养小鼠成神经瘤N2a细胞，转染特异性阻断Src表达的siRNA，检测转染不同时间点PP2A Y307的磷酸化水平、PP2A的活性以及tau蛋白在不同位点的磷酸化水平。