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相似文献
 共查询到18条相似文献,搜索用时 218 毫秒
1.
目的:构建携带融合型自杀基因Fcy::Fur的荧光真核表达质粒pEGFP-N1-Fcy::Fur,并观察其在卵巢癌细胞中的表达.方法:应用基因重组技术,将pORF-Fcy::Fur中的Fcy::Fur目的基因亚克隆到荧光真核表达载体pEGFP-N1,以酶切1和测序鉴定重组质粒的正确性.应用脂质体介导的转染技术将该质粒导入SKOV3细胞,24 h后观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)瞬时表达情况,用Western blot方法检测Fcy::Fur表达.结果:酶切和测序鉴定证实插入片段正确.细胞转染24 h后,荧光显微镜下观察到GFP表达.60%转染细胞发出绿色荧光.Western-blot检测到Fcy::Fur表达.结论:成功构建pEGFP-N1-Fcy::Fur荧光真核表达质粒,并可在卵巢癌细胞中有效表达,为卵巢癌基因治疗提供实验基础.  相似文献   

2.
目的:构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-SUMO-3,观察GFP-SUMO-3融合蛋白在人前列腺癌细胞LNCaP中的表达与定位.方法:采用PCR扩增SUMO-3基因全长cDNA编码区序列,克隆入pEGFP-N1真核表达载体.重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3通过酶切和测序鉴定...  相似文献   

3.
目的:构建小鼠Hsp84基因真核表达质粒。方法:采用逆转录、热降落PCR方法,扩增BALb/c小鼠Hsp84基因片段。将其连人pMD18-T载体,筛选阳性克隆、测序验证。然后以重组T载体为模板,PCR扩增目的序列,插入真核表达质粒pcD—NA3.1中,转化大肠杆菌DH5α,通过琼脂糖电泳、双酶切挑选和验证阳性重组克隆。结果:RT—PCR自小鼠脑组织中扩增出目的基因片段,克隆人pMD18-T载体后,测序结果证明为BALb/c小鼠Hsp84基因.插入目的基因的真核表达载体的酶切谱与设计一致。结论:成功构建了小鼠Hsp84编码框全长的真核细胞表达质粒。  相似文献   

4.
目的构建绿色荧光蛋白(GFP)与人乙型肝炎病毒(HBV)X基因的重组表达载体,建立稳定表达HBVX蛋白(HBx)与GFP融合蛋白的HepG2细胞系,以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段,PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点,转化宿主菌DH5α,采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx;采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞,G418选择抗性细胞克隆,荧光显微镜下观察GFP表达,挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx;将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2.,经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次,细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2/GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP.HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx;获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系,这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。  相似文献   

5.
目的:构建绿色荧光蛋白(GFP)和小鼠纤维介素蛋白(mfgl2)的融合蛋白表达载体,在仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达,为mfgl2的RNA干扰体外研究提供简便的判断手段。方法:用PCR从mfgl2cDNA文库中扩增出mfgl2cDNA片段,插入到GFP表达载体pEGFP—N2中GFP基因序列的上游,构建成GFP—mfgl2融合基因表达载体pEGFP—mfgl2,将该载体转染到CHO细胞后24—48h,通过荧光显微镜观察并摄片。结果:扩增出长约1.3kb的基因片段,经双酶切鉴定和测序鉴定无误;重组载体转染CHO细胞后,在荧光显微镜下可观察到GFP的表达。结论:成功构建了pEGFP.mfgl2融合基因表达载体;重组载体可在CHO细胞中表达出GFP—mfgl2融合蛋白,为下一步进行mfgl2RNA干扰研究提供了简便的判断手段。  相似文献   

6.
目的:构建重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)基因真核表达载体pEGFP-N1/hIL-1ra,瞬时转染人牙龈成纤维细胞并检测其表达,为牙周炎症的基因治疗提供实验基础。方法:TRIzol法提取人乳腺癌组织总RNA进行RT-PCR,将纯化的扩增产物hIL-1ra与克隆载体pMD18-T连接、转化,测序正确后将重组体pMD18-T/hIL-1ra与真核表达质粒pEGFP-N1分别进行双酶切,连接后转化感受态细菌E.coliTOP10。将构建正确的pEGFP-N1/hIL-1ra重组质粒DNA瞬时转染人牙龈成纤维细胞,荧光显微镜观察绿色荧光的表达,RT-PCR方法检测其基因的表达。结果:构建的pEGFP-N1/hIL-1ra真核表达载体经PCR及双酶切鉴定均表明人IL-1ra基因已与pEGFP-N1正确重组。瞬时转染人牙龈成纤维细胞后能观察到绿色荧光,RT-PCR可得到目的片段。结论:成功构建了重组质粒pEGFP-N1/hIL-1ra,瞬时转染人牙龈成纤维细胞后检测到其基因水平的表达,为炎性细胞因子拮抗剂基因用于牙周炎抗炎治疗奠定了实验基础。  相似文献   

7.
目的构建猪源性胆囊收缩素(CCK)基因真核表达质粒pIRES2-EGFP/CCK,并在哺乳动物细胞COS-7中和仓鼠体内进行表达。方法从含CCK的中介载体pMD18-T/CCK中,以限制性内切酶方法获取目的片段,将其克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,以脂质体法转染COS-7细胞,利用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,同时采用肌肉注射法免疫仓鼠,了解重组质粒pIRES2-EGFP/CCK的体内表达。结果构建了猪CCK基因的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP/CCK,用其转染COS-7细胞后24h、48h、72h均可检测到绿色荧光蛋白的表达,其中72h组荧光强度达到最强。用pIRES2-EGFP/CCK免疫仓鼠后,第4d注射部位可以检测到绿色荧光蛋白的表达,第14d荧光强度明显增强,第42d荧光强度进一步增强,正常对照组始终未检测到绿色荧光蛋白的表达。结论成功构建了猪源性CCK基因真核表达质粒pIRES2-EGFP/CCK,并成功地在哺乳动物细胞COS-7中和仓鼠体内进行了表达,为仓鼠胰腺癌的交叉免疫治疗奠定了基础。  相似文献   

8.
胡世颉  章翔  金岩  轩昆  金明  王西玲  张蓉 《医学争鸣》2003,24(22):2044-2047
目的:构建MAGE-Ela与绿色荧光蛋白融合的真核表达载体,为研究肿瘤疫苗中树突状细胞的作用奠定基础.方法:应用基因重组技术,将反转录PCR得到的MAGE-Ela基因克隆入荧光真核表达载体pEGFP-N3中,用含卡那霉素LB培养基平板筛选转化菌,阳性重组子经SalⅠ和KpnⅠ双酶切分析、PCR鉴定.结果:MAGE-Ela基因成功地亚克隆至真核表达载体pEGFP-N3中,获得MAGE-E1a/pEGEP-N3重组质粒.结论:MAGE-E1a基因克隆入pEGFP-N3质粒,成功构建MAGE-E1a/pEGFP-N3荧光真核表达载体,解决了MAGE-E1a基因转染的定位问题,为研究肿瘤疫苗奠定了基础。  相似文献   

9.
目的为开展C型利钠肽(CNP)基因治疗构建家兔CNP基因真核表达载体。方法通过RT-PCR从家兔腹主动脉组织中克隆CNP基因全长编码区,将该DNA片段亚克隆至克隆载体pMD 18-T中,用PstⅠ单酶切筛选出负向插入片段,用HindⅢ和KpnⅠ双酶切将目的DNA片段定向克隆至真核表达质粒pEGFP-N1中,然后用双酶切、DNA序列测定鉴定方法对重组质粒进行鉴定。结果酶切及测序鉴定证实,家兔CNP基因全长编码区被准确插入到pEGFP-N1酶切位点HindⅢ和KpnⅠ中。结论含家兔CNP基因真核表达载体的成功构建和鉴定为CNP基因治疗的研究奠定了基础。  相似文献   

10.
目的 构建人工锌指蛋白ZFP基因的真核表达载体,检测其在真核细胞的表达情况,从而探讨人工锌指蛋白作为人工转录因子DNA结合域的可能性.方法 全基因合成人工锌指蛋白(putative zinc finger protein,ZFP)的核酸序列并克隆入pEGFP-N1及pIRES2-EGFP真核表达载体中,构建重组质粒pEGFP-N1/ZFP及pIRES2-EGFP/ZFP-Flag,通过酶切、菌落PCR及测序来鉴定重组载体的正确性.脂质体DOTAP体外转染重组质粒于COS-7细胞中,用荧光显微镜、RT-PCR、Western blot方法鉴定ZFP在该细胞中的表达.结果 正确构建了pEGFP-N1/ZFP、pIRES2-EGFP/ZFP-flag重组表达质粒,并且在COS-7细胞中成功进行了人工锌指蛋白ZFP的表达.结论 采用生物信息学手段获得的假定的锌指蛋白基因序列可以在真核细胞内正常表达.  相似文献   

11.
目的:构建人端粒酶逆转录酶基因启动子区的真核表达载体。方法:用核酸内切酶NotⅠ和KpnⅠ酶切报告基因GFP,插入pcDNA3.1( )载体,得到pcDNA3.1( )-GFP(PG)载体;用PCR方法扩增hTERT基因ATG上游的启动子序列,测序后用核酸内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切插入PG载体,得到pcDNA3.1( )-GFP—hTERT(PGT)载体。将PGT载体转染人食管癌EC9706细胞系,经G418筛选,荧光显微镜下观察。结果:克隆得到的启动子序列与文献相符,重组载体经酶切鉴定方向正确,含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。经转染人食管癌EC9706细胞系,在荧光显微镜下观察到绿色的阳性克隆。结论:克隆的人端粒酶逆转录酶基因启动子序列在真核细胞中具有启动子活性。  相似文献   

12.
重组真核表达载体pEGFP-N1/PDGF-A的构建及真皮干细胞的转染   总被引:5,自引:1,他引:4  
目的克隆血小板衍生生长因子A链(plateletderivedgrowthfactorAchain,PDGFA)基因,以增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)载体pEGFPN1为骨架,携带PDGFA基因进入真皮间充质干细胞(dermisdrivedmesenchymalstemcells,DMSCs),为采用转入PDGFA基因的DMSCs修复创面奠定基础。方法采用RTPCR二步分离法,以人肝癌细胞系(SMC7721)的总RNA为模板,扩增PDGFA基因的全长cDNA编码序列,克隆入载体pMD18T,随后又将PDGFA基因亚克隆入pEGFPN1载体中,构建PDGFA基因的真核表达载体pEGFPN1/PDGFA,并采用Fugene6介导转染技术将PDGFA基因导入DMSCs。结果克隆到PDGFA基因的全长cDNA序列,经测序验证,其序列与GenBank所报告的该基因的序列完全一致。结论成功地将PDGFA基因克隆到pEGFPN1载体中,并实现了PDGFA基因在DMSCs的表达。  相似文献   

13.
目的:构建信号调节蛋白α-绿色荧光蛋白(SIRPα-GFP)真核表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达SIRPα-GFP融合蛋白的细胞系,研究SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞的膜定位。方法:将SIRPα质粒和带有GFP的表达载体分别用限制性内切酶MluⅠ和SgfⅠ进行双酶切,将SIRPα基因克隆到pLenti-GFP载体中,构建pLenti-SIRPα-GFP质粒;将pLenti-SIRPα-GFP质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对重组质粒pLenti-SIRPα-GFP进行DNA测序;采用Lipofectamine 3000转染试剂将pLenti-SIRPα-GFP质粒转染到HEK293T细胞中,通过荧光显微镜观察SIRPα-GFP在稳定转染HEK293T细胞中的表达,采用Western blotting法检测HEK293T细胞中SIRPα-GFP融合蛋白的表达。结果:酶切鉴定和DNA测序,重组质粒pLenti-SIRPα-GFP构建成功。荧光显微镜检测,SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞膜上表达。Western blotting法检测,SIRPα蛋白在pLenti-SIRPα-GFP质粒转染的HEK293T细胞中成功表达。结论:成功构建了pLenti-SIRPα-GFP质粒。通过在HEK293T细胞中转染pLenti-SIRPα-GFP质粒,成功制备了稳定表达SIRPα-GFP的细胞系。SIRPα-GFP蛋白定位于HEK293T细胞的细胞膜上。  相似文献   

14.
15.
目的 构建真核表达载体pEGFP-N1/hVEGF121,并转染神经干细胞(neural stem cells,NSCs),以探究人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,hVEGF121)基因导入NSCs的表达变化.方法 分离培养胎鼠NSCs,并行nestin、GFAP...  相似文献   

16.
目的:建立一种简易、快速检测细胞内外源性基因稳定表达的方法。方法:以携带绿色荧光蛋白的真核表达质粒pEGFP-N1为骨架,将完整的 hOSM基因ORF克隆到pEGFP-N1上游的多克隆位点,构建表达载体pOSM-EGFP-N1,脂质体介导转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),G418筛选,挑选阳性克隆。荧光显微镜、流式细胞术分析转染了pOSM-EGFP-N1质粒的CHO细胞纯度。RT-PCR的方法分析OSM基因水平表达。结果:成功建立稳定表达OSM的CHO细胞株(CHO-OSM-EGFP),纯度达到99.76%,且OSM基因在CHO-OSM-EGFP细胞中稳定表达。结论:构建了携带绿色荧光、表达OSM的pOSM-EGFP-N1质粒转染的CHO细胞,只通过荧光显微镜观察和FCM检测细胞绿色荧光,即可明确OSM转染成功。为表达外源性基因阳性细胞的筛选提供了简易的方法。  相似文献   

17.
目的:建立人精子蛋白17(hSp17)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)共表达的卵巢癌细胞模型. 方法:用PCR方法获取hSp17基因片段,Hind Ⅲ/Kpn I双酶切、T4 DNA连接酶连接的方法将hSp17基因片段克隆至含报告基因EGFP的真核表达载体pEGFP-N1中,脂质体介导转染卵巢癌细胞HO8910,荧光倒置显微镜观察及Westernblot检测转染细胞中hSp17/EGFP融合蛋白的表达,G418筛选稳定表达的细胞株. 结果:酶切和测序结果均证实pEGFP-N1/hSp17重组质粒的构建完全正确.荧光观察与Western blot均证实了hSp17/EGFP蛋白的共表达,且成功筛选出稳定表达的细胞株. 结论:成功构建hSp17/EGFP共表达的卵巢癌细胞模型,为研究hSp17异常表达对肿瘤细胞生物学行为的影响,以及hSp17为靶标的肿瘤诊断和生物治疗奠定基础.  相似文献   

18.
目的 获得高纯度的eae基因表达蛋白紧密黏附素(Intimin),研究其黏附作用.方法 从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7全基因组中扩增出eae基因,T-A克隆后,将eae插入载体pET28a(+),并转化至E.coli BL21(DE3)中表达;用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出重组蛋白;SDS-PAGE检测目的 蛋白相对分子质量,免疫印记分析其免疫反应性,免疫荧光检测其黏附性.结果 获得了大小约2805 bp的eae片段;构建r重组载体pET28a(+)-eae,并在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达Intimin,Mr约97 000;Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出Intimin;大肠杆菌O157:H7多抗血清在Mr约97 000处检测出一条特异性Intimin带;Intimin可黏附在HEp-2细胞表面.结论 高纯度的重组蛋白Intimin具有一定的免疫反应性,能与HEp-2细胞黏附,为进一步研究Intimin蛋白与宿主受体蛋白的相互作用奠定基础.  相似文献   

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