补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠脑内神经细胞黏附分子表达的影响

目的：探讨补阳还五汤对局灶性脑缺血大鼠脑内神经细胞黏附分子（NCAM）表达的影响。方法：采用大脑中动脉阻塞法复制脑缺血模型,动物随机分为正常组、假手术组、模型组和补阳还五汤组,各组分别给予不同处理,分别于12h,1,3,7,14d处死动物,采用免疫组织化学法观察NCAM的表达。结果：在正常脑内有少量NCAM阳性细胞,缺血后表达增加,于术后第3天达高峰,补阳还五汤组能显著提高NCAM的表达,在第7、14天模型组与补阳还五汤组差异有显著性（P〈0．01）。结论：补阳还五汤增强脑缺血后NCAM的表达是其促进神经再生和功能恢复的可能机制之一。     

补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血后血管内皮生长因子及其受体Flk1的影响

目的探讨补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血后血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(Fetal liver kinase1,Flk1)的影响。方法大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组、补阳还五汤组,大脑中动脉线栓法复制局灶性脑缺血模型,采用免疫组织化学法和酶联免疫法检测各组动物脑内VEGF、Flk1的表达和蛋白水平,同时评价动物神经功能。结果在正常大鼠脑内有少量VEGF和Flk1阳性细胞,脑缺血后VEGF和Flk1阳性细胞增加;与模型组比较,尼莫地平、补阳还五汤均能改善模型大鼠的神经功能缺失症状,增强VEGF和Flk1的表达,提高VEGF蛋白水平(P<0.05);于7、14d补阳还五汤作用强于尼莫地平(P<0.05)。结论补阳还五汤增强大鼠局灶性脑缺血后VEGF及Flk1的表达和提高VEGF蛋白水平,是其抗脑缺血的可能作用机制之一。     

补阳还五汤超微饮片对局灶性脑缺血大鼠神经干细胞移植后Bcl-2、Bax表达的影响

目的探讨补阳还五汤超微饮片对局灶性脑缺血大鼠神经干细胞移植后凋亡相关基因Bcl-2、Bax的影响。方法将SD大鼠80只,雌雄各半,复制局灶性脑缺血大鼠模型,造模后按神经功能缺损评分进行分层,随机分为5组,每组15只,分别于移植后7 d、14 d、28 d进行神经功能评分,采用补阳还五汤超微饮片与传统饮片予以干预,于相应时间点处死大鼠后采用免疫组化法检测凋亡基因Bcl-2、Bax。结果补阳还五汤能显著减轻神经功能缺损,Bcl-2、Bax在各时间点(7 d、14 d、28 d)表达与模型组比较差异有统计学意义(P0.05),模型加移植加补阳还五汤超微饮片组上调Bcl-2、拮抗Bax表达的作用优于模型加移植加补阳还五汤传统饮片组,差异有统计学意义(P0.05)。结论补阳还五汤可调节脑缺血后Bcl-2、Bax的表达,是其促进神经功能恢复的可能机制之一,且超微饮片组的作用较传统饮片组更加显著。     

超微脑得健对脑缺血大鼠脑内Rho表达的影响

目的 探讨超微脑得健对脑缺血大鼠脑内Rho的影响,揭示其可能作用机制.方法 采用脑中动脉阻塞法复制大鼠局灶性脑缺血模型,将动物随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组、脑得健原方组、超微脑得健全量组,超微脑得健1/3剂量组.采用RT-PCR法检测大鼠脑组织Rho mRNA表达.结果 假手术组脑内有一定水平Rho mRNA表达,模型组Rho mRNA表达至7 d达到高峰.给药3d后各治疗组动物脑组织Rho mRNA含量较同时段模型组比较明显降低,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 超微脑得健能抑制脑缺血后Rh0表达,可能为其促进脑缺血后神经功能恢复作用机制之一.     

补阳还五汤对脑缺血后大鼠脑内GLT-1表达的影响

目的 :观察脑缺血后补阳还五汤对大鼠脑内海马CA1区GLT-1(glutamate transporter-1)表达的影响。方法 :大脑中动脉栓塞法制备缺血性脑损伤大鼠模型,术后补阳还五汤灌胃,灌胃1、3、5、7 d后灌注取材。采用免疫组织化学染色法观察海马CA1区的GLT-1表达,采用免疫荧光双染确定GLT-1的细胞定位。结果 :同模型组相比,补阳还五汤在1 d和3 d后可显著增加海马CA1区GLT-1的表达,随后GLT-1的表达逐步下降,而且两组之间没有明显差异(5 d和7 d)。另外免疫荧光双染表明GS主要表达于星形胶质细胞。结论 :补阳还五汤可通过提高脑缺血后CA1区GLT-1的表达减少谷氨酸的浓度发挥保护作用。     

脑得健方对大鼠局灶性脑缺血后神经功能及梗死面积的影响

目的探讨脑得健方对大鼠局灶性脑缺血后神经功能及脑梗死面积比的影响。方法将大鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组、脑得健方高、中、低剂量组,每组20只,大脑中动脉线栓法复制局灶性脑缺血模型,于手术后3d和7d评价其神经功能。每组随机取5只做TTC并计算梗死面积比,5只计算大脑干湿重比。结果脑缺血后模型大鼠有神经功能障碍、出现大面积梗死和组织水肿。治疗7d后,脑得健方各剂量和补阳还五汤均能改善模型大鼠的神经功能缺失症状,减小梗死面积,减轻脑组织水肿,分别与模型组比较,差异均具有统计学意义（P〈0．05）。结论脑得健方和补阳还五汤均能改善模型大鼠的神经功能缺失症状,减少梗死面积,减轻脑组织的水肿。药物以中剂量最佳。     

补阳还五汤对脑缺血再灌注后星形胶质细胞connexin43影响

目的:探讨补阳还五汤对大鼠脑缺血再灌注后海马CA1区缝隙连接小体connexin43(Cx43)的影响。方法:采用颈内动脉线栓法建立大脑中动脉栓塞模型,脑缺血2 h再灌注1、3和7 d后,免疫组织荧光染色观察海马CA1区Cx43的表达情况,并通过星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的免疫染色比较星形胶质细胞的激活程度。结果:补阳还五汤组脑缺血再灌注1 d后海马CA1区Cx43的表达较模型组显著降低(P<0.05),而第3天和第7天海马CA1区Cx43的表达较模型组高(P<0.05)。同时,补阳还五汤组缺血再灌注1 d后星形胶质细胞的激活较模型组受到抑制;第3天和第7天星形胶质细胞激活均较第1天明显减弱,而且第7天时两组无明显差异。结论:补阳还五汤可能通过调控星形胶质细胞Cx43表达对脑缺血再灌注后不同时间点的损伤和修复进行调控。     

补阳还五汤对脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的:观察补阳还五汤对大鼠脑缺血-再灌注损伤的保护作用.方法:SD大鼠56只随机分假手术组、模型对照组、补阳还五汤1组和补阳还五汤2组,每组14只.线栓法制作大鼠脑缺血-再灌注模型.再灌注48小时后观察大鼠神经功能缺损评分情况,TTC染色测量脑梗死体积,干湿重法测量缺血侧脑含水量,常规HE染色观察病理变化.结果:脑缺血-再灌注48小时,补阳还五汤1、2组大鼠神经功能缺损评分明显高于对照组(P<0.05),脑梗死体积及脑水肿也明显减轻(P均<0.05),脑组织病理学显著改善.补阳还五汤1、2两组比较,2组疗效稍好于1组,但无统计学意义(P>0.05).结论:补阳还五汤对大鼠脑缺血-再灌注损伤具有保护作用.     

补阳还五汤对全脑缺血再灌注不同时点大鼠皮质神经细胞谷氨酸受体2表达的影响

目的 研究补阳还五汤抗全脑缺血后再灌注损伤的分子机制.方法 将SD大鼠随机分为3组,即正常组、模型组和药物组(补阳还五汤预干预),模型组和药物组再分别设置2、12、24、48、72 h五个观察时间点.连续给药5 d后,采用改良的Pulsinelli四血管闭塞法复制全脑缺血大鼠模型,再灌注后2、12、24、48、72 h分别检测各组大鼠皮质神经细胞谷氨酸受体2(glutamate receptor 2,GluR2)的表达水平.结果 与正常组比较,再灌注各时点模型组大鼠大脑皮质神经细胞GluR2表达水平显著降低(P<0.01);与模型组比较,再灌注各时点药物组GluR2表达水平显著升高(P<0.01);与再灌注2 h比较,再灌注12、24、48、72 h药物组GluR2表达水平显著升高(P<0.01).结论 补阳还五汤可预防大鼠脑缺血再灌注引起的GluR2表达减少,且在再灌注2 h后这种抑制作用更强.     

补阳还五汤对全脑缺血再灌注不同时点大鼠皮质神经细胞谷氨酸受体2表达的影响

目的研究补阳还五汤抗全脑缺血后再灌注损伤的分子机制。方法将SD大鼠随机分为3组,即正常组、模型组和药物组(补阳还五汤预干预),模型组和药物组再分别设置2、12、24、48、72h五个观察时间点。连续给药5d后,采用改良的Pulsinelli四血管闭塞法复制全脑缺血大鼠模型,再灌注后2、12、24、48、72h分别检测各组大鼠皮质神经细胞谷氨酸受体2(glutamate receptor 2,GluR2)的表达水平。结果与正常组比较,再灌注各时点模型组大鼠大脑皮质神经细胞GluR2表达水平显著降低(P<0.01);与模型组比较,再灌注各时点药物组GluR2表达水平显著升高(P<0.01);与再灌注2h比较,再灌注12、24、48、72h药物组GluR2表达水平显著升高(P<0.01)。结论补阳还五汤可预防大鼠脑缺血再灌注引起的GluR2表达减少,且在再灌注2h后这种抑制作用更强。     

补阳还五汤对脑缺血后中性粒细胞浸润及ICAM-1表达的影响

目的观察补阳还五汤对脑缺血再灌注后中性粒细胞浸润和ICAM-1表达的影响。方法术前7天开始罐胃,然后用线栓法诱导大鼠大脑中动脉阻塞模型,再灌24h后采用神经症状评分和梗死周边区存活神经元数评价脑损伤情况,用髓质过氧化物酶(MPO)和ICAM-1免疫组化方法,评价中性粒细胞浸润和ICAM-1表达情况。结果缺血90min再灌24h后,补阳还五汤能显著改善神经症状(P<0·05或P<0·01),增加缺血半球皮层周边区存活神经元数(P<0·05或P<0·01)。与模型组比较,补阳还五汤显著减少缺血半球皮层MPO阳性细胞数(P<0·01)和ICAM-1阳性血管数(P<0·01)。结论补阳还五汤对脑缺血损伤有保护作用,并能减少中性粒细胞浸润和ICAM-1表达。     

P-糖蛋白在大鼠脑缺血再灌注后的表达变化

目的 观察大鼠局灶性脑缺血90 min再灌注后p-糖蛋白(P-gp)在脑组织中的表达及其变化规律.方法 采用线栓法建立大鼠脑缺血再灌注模型,选取26只成年健康SD雄性大鼠,其中1只用于2,3,5--三苯基氯化四氮唑(TTC)染色,其余25只随机分为对照组(n=5)、假手术组(n=5)、脑缺血再灌注1、3、7d组(n=5).用免疫组织化学DAB单标,观察P-gp在正常脑组织和缺血脑组织中的分布变化;用Mdr-1抗体分别和神经元标记物(Neun)、星形胶质细胞标记物(GFAP)、微血管内皮细胞标记物(CD31)进行免疫荧光双标,观察P-gp在缺血再灌注后脑组织的表达;用实时定量PCR技术检测脑缺血再灌注后大脑皮质及纹状体微血管P-gp mRNA的表达变化.结果 对照组仅在脑组织微血管内皮细胞表达P-gp,缺血再灌注组除微血管内皮细胞表达P-gp外,在部分神经元及星形胶质细胞的突起也有表达.脑缺血再灌注后1d皮质P-gp mRNA表达降低,但3d表达明显增高,7d又下降,其升高和降低水平与对照组及假手术组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).脑缺血再灌注后1、3、7d纹状体P-gp mRNA表达均增多,其中以1、3d增多明显,与对照组和假手术组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 脑缺血再灌注后P-gp在大脑皮层及纹状体微血管P-gp的表达呈现不同的趋势,这可能是脑组织的自我保护机制之一.     

大鼠急性脑缺血后CD4~+CD25~+调节性T细胞、Foxp3表达及其意义

目的动态观察大鼠急性脑缺血后不同时期外周血中CD4+CD25+调节性T细胞和脑组织中Foxp3的表达,探讨其在急性缺血性卒中病理生理演变过程中的作用。方法 48只Wistar大鼠按随机数字表法分为缺血组和假手术组。参考改良的Zea-Longer插线方法将缺血组大鼠制作成右侧大脑中动脉线栓脑缺血动物模型。采用流式细胞术和免疫组化染色检测造模后1、3、7、14 d时大鼠外周血中CD4+CD25+调节性T细胞表达和脑组织中Foxp3表达,同时采用改良NSS神经功能评分观察大鼠行为学变化。结果缺血组和假手术组大鼠神经功能缺损评分在模型制备后逐渐下降(P<0.01)。流式细胞术显示脑缺血后1、3 d时缺血组大鼠外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的表达与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05),7、14 d时表达明显高于假手术组(P<0.05),且与大鼠的神经功能评分呈负相关(r=-0.68,P=0.01)。免疫组化显示脑缺血后1 d时缺血组大鼠脑组织中即可观察到Foxp3表达,且主要集中在缺血灶区域,在未缺血侧也可观察到Foxp3表达,但表达量较少,而假手术组脑组织中未见Foxp3表达。结论 CD4+CD25+调节性T细胞参与了大鼠急性脑缺血后炎症免疫反应的发生发展过程,且在脑缺血后1 d时便开始参与脑缺血性损伤的免疫调节,这种免疫调节对脑细胞有着保护作用。     

大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤动态病变及其与MMP-2表达关系

目的探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的病变规律及MMP-2在损伤机制中的作用。方法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,分别采用HE、TUNEL染色法观察缺血2 h再灌注3 h-7 d脑组织的动态病理变化及免疫组化法检测MMP-2的蛋白表达。结果假手术组大鼠脑组织形态结构正常;与之相比,缺血再灌注3 h-7 d组脑组织均有明显病变且差异有显著性(P<0.01);缺血中心区再灌注后3 h以变性损伤为主,24 h-7 d以坏死及继发炎症为主;边缘区一直以持续进行性凋亡为主;水肿贯穿病变全程,分别于再灌注后24 h、72 h两次出现高峰,其中24 h尚伴灶片状出血。缺血再灌注组大鼠大脑组织的MMP-2表达显著高于假手术对照组,P<0.05;MMP-2表达存在时空改变且与脑水肿、细胞凋亡有正相关性,P<0.01,相关度R值在0.5以上,其中24 h的首次脑水肿高峰与MMP-2表达峰值点重叠。结论再灌注后24 h、72 h的两次水肿高峰及迟发、持续性细胞凋亡是再灌注损伤两个最重要的方面,MMP -2表达参与了其机制。     

大鼠脑缺血后缺血区BDNF表达变化及通心络的影响

目的观察大鼠脑缺血后缺血区BDNF mRNA及蛋白表达水平的变化及通心络对其的影响。方法健康雄性SD大鼠随机分为:假手术组、模型组、通心络高剂量(2.24g.kg-1.d-1)、低剂量(1.12g.kg-1.d-1)组。采用线栓法制备大鼠大脑中动脉梗死(MCAO)局灶性脑缺血模型,逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组化法检测脑缺血后3h、24h、72h、7d缺血区BDNF mRNA及蛋白表达的变化以及通心络的作用。结果(1)大鼠脑缺血后缺血区BDNF表达变化:大鼠局灶性脑缺血后3h缺血区BDNF mRNA表达略有上升,而24h表达下降,72h后又开始上升,至缺血后7d达高峰;免疫组化染色显示:在脑组织缺血区,BDNF主要在小神经元阳性表达,表达趋势与mRNA基本吻合。(2)通心络对缺血区BDNF表达的影响:与模型组相比,通心络高剂量组BDNF mRNA的表达水平在缺血后3h、24h、7d均有显著提高(P<0.01,P<0.05);通心络低剂量组BDNF mRNA的表达水平在缺血后3h、24h有明显升高(P<0.01,P<0.05);在缺血后7d,高剂组BD-NF mRNA的表达与低剂组相比明显升高(P<0.01)。在缺血后各时间点,通心络各组BDNF阳性神经元数量增多。结论局灶性脑缺血可促进缺血区内源性神经保护因子BDNF高表达;通心络可增强和延长缺血区BDNF高表达,发挥对脑缺血的保护作用。     

对大鼠脑缺血再灌注后tTG表达的影响

目的   研究胱氨酸（Cystamine）对全脑缺血再灌注损伤后大鼠海马组织型转谷氨酰胺酶（tTG）表达的影响。方法    用四血管阻断法制作大鼠全脑缺血再灌注模型。将SD大鼠随机分为假手术组（n=8）,全脑缺血组（n=48）及全脑缺血治疗组（n=48）,全脑缺血组和全脑缺血治疗组按照缺血再灌注时间点的不同再将大鼠随机分为6h、12h、1d、3d、5d、7d六个亚组,每个亚组8只。全脑缺血治疗组大鼠给予Cystamine腹腔注射（0.15mg/g）,全脑缺血组和假手术组大鼠给予生理盐水腹腔注射。TUNEL染色法观察细胞凋亡水平的变化,免疫组织化学方法分析再灌注后不同时间点海马CA1区tTG表达水平的变化。另取52只大鼠随机分为假手术组（n=4）、全脑缺血组（n=24）及全脑缺血治疗组（n=24）,全脑缺血组和全脑缺血治疗组按照不同时间点每个亚组4只,免疫印迹方法测定tTG的表达。结果   缺血组再灌注24h后TUNEL阳性细胞明显增加,1、3、5、7d亚组与假手术组差异有统计学意义（P<0.05）;治疗组与缺血组相比,在1、3、5、7d相应时间点亚组TUNEL阳性细胞数减少（P<0.05）。治疗组海马CA1区tTG平均阳性细胞数于全脑缺血后12h开始下降,3、5、7d亚组均明显低于缺血组（P<0.05）。治疗组海马tTG蛋白水平于缺血再灌注后1d开始降低,3、5和7d亚组显著低于缺血组（P<0.05）。结论   Cystamine可以降低大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区tTG的表达,从而对神经元细胞起到一定的保护作用。     

经鼻给予NGF对大鼠局灶性脑缺血后脑内巢蛋白的表达

【目的】探讨经鼻给予神经生长因子治疗大鼠脑梗塞后脑内巢蛋白的表达。【方法】选用SD大鼠72只,随机分为3组：模型组（n=24）、对照组（n=24）和治疗组（n=24）,采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血模型,对照组经鼻给予等量生理盐水,治疗组于脑缺血后2h经鼻给予神经生长因子,每组又根据处死时间不同分为3、7、14、21d组,用Longa等评定方法检测大鼠行为、免疫组化方法检测脑内海马区巢蛋白的表达。【结果】神经功能评分在各时问点治疗组与模型组、对照组比较差异有统计学意义;大鼠脑缺血后各组问不同时相均有巢蛋向阳性细胞数,治疗组7d阳性细胞数量显著增加。【结论】经鼻给予神经生长因子可有效促进脑缺血后脑内巢蛋白的表达,有助于大鼠神经功能恢复。     

脑缺血再灌注大鼠脑内Mrp1的表达变化

目的观察脑缺血再灌注后多药耐药蛋白（Mrp1）在脑内的表达变化,探讨其与缺血再灌注的关系.方法 24只大鼠随机分为假手术组（n=6）和缺血再灌注后1、3、7d组（n=6）.应用颈内动脉线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,以抗Mrp1抗体进行免疫组化染色,检测缺血再灌注后脑组织中Mrp1的表达变化.结果 Mrp1在正常脑内的神经元及胶质细胞中均有表达.缺血再灌注后1d、3 d、7d组中,缺血再灌注区的皮质、海马及纹状体内可见Mrp1表达升高,阳性细胞数量增多,在3d组达高峰（P〈0.05）.结论大鼠脑缺血再灌注后细胞中Mrp1的表达增高,可能是细胞受损时的自我保护反应,但同时也可能与临床耐药性的发生有关.     

补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血后海马齿状回神经干细胞增殖和存活的影响

[目的]观察补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血后海马齿状回神经干细胞增殖和存活的影响。[方法]采用线栓法诱导大鼠大脑中动脉阻塞模型,缺血90min后再灌,缺血后24h开始灌胃补阳还五汤（13g.kg-1）,1次/d,缺血后第5~7天腹腔注射Br-dU（50mg.kg-1,2次/d,间隔8h）,分别在缺血后第8和35天处死,免疫组化检测海马齿状回BrdU阳性细胞。[结果]与模型组比较,缺血后第8、35天,补阳还五汤组BrdU阳性细胞数显著增加（P〈0.01）。[结论]补阳还五汤能促进脑缺血大鼠海马齿状回神经干细胞增殖和存活。     

加味补阳还五汤对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤低氧诱导因子-1表达的调控

[目的]建立新生SD大鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）模型,观察低氧诱导因子-1（HIF-1）的表达及加味补阳还五汤对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的保护作用,为新生儿缺氧缺血性脑损伤提供新的治疗思路。[方法]新生7d龄SD大鼠140只,随机分为空白组（28只）、HIBD模型组（28只）及加味补阳还五汤组（84只）,加味补阳还五汤组按给药剂量分为高、中、低剂量组。每组分别在规定时间点处死,光镜下观察各组大鼠左侧脑组织HE染色的病理改变、组织中HIF-1α蛋白表达,并通过RT-PCR检测HIF-1基因表达。[结果]缺氧缺血后新生大鼠出现不同程度的行为异常,1h后逐渐由兴奋转为抑制,少数发生抽搐;HE染色结果显示,加味补阳还五汤高剂量组各时间点损伤程度比中、低剂量组均有明显减轻;免疫组化结果显示,加味补阳还五汤各剂量组各时间点HIF-1α阳性细胞数均较空白组多,高剂量组各时间点HIF-1α阳性细胞数均较HIBD组明显增多;荧光定量PCR检测结果表明加味补阳还五汤高剂量组HIF-1的表达量高于其他组,差异均有统计学意义（P〈0.05）。[结论]加味补阳还五汤能通过上调HIF-1的表达来减轻缺氧缺血所致的脑损伤,此研究为临床治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤提供了新的治疗思路。