CRISPR/Cas9联合Cre-Loxp系统建立VASN条件敲除的小鼠肝细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统的条件性敲除策略构建VASN基因敲除的AML12小鼠肝细胞株。方法：在VASN基因第二外显子上下游设计靶点并合成gRNA序列,构建2个CRISPR/Cas9重组载体;设计构建VASN上下游分别带有Loxp序列和旁侧同源序列的供体载体donor DNA质粒;将3个质粒共转染至小鼠肝细胞AML12中,分离单克隆,提取基因组DNA,经PCR及测序鉴定获得稳定敲入Loxp序列的单克隆细胞株AML12-Loxp;将pALB-Cre质粒转染至AML12-Loxp,筛选建立敲除VASN基因的细胞系。结果：成功构建2个靶向敲除VASN基因的pX459-gRNA-VASN-1和pX459-gRNAVASN-2重组载体及一个供体载体;转染药筛后获得12个单细胞克隆,经测序,5个单克隆细胞实现VASN基因上下游精确敲入Loxp序列;同源重组敲入效率为41.6%;p ALB-Cre质粒转染后获得20个单细胞克隆,经PCR和测序获得12个VASN基因敲除的单克隆细胞,敲除效率为60%。结论：利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统成功构建...     

基于CRISPR/Cas9系统定点编辑小鼠MAD2L1基因及其脱靶效应分析

目的 建立利用CRISPR/Cas9系统对小鼠MAD2L1基因第二外显子基因编辑的方法体系，并分析CRISPR/Cas9对MAD2L1基因编辑的脱靶效应。方法 通过CHOPCHOP网站设计位于小鼠MAD2L1基因第二外显子的靶点序列，并构建Cas9-MAD2L1载体，将该载体转染到NIH/3T3细胞中，通过嘌呤霉素筛选并结合荧光显微镜观察GFP后，提取细胞转染后的基因组DNA，利用PCR方法，结合T7E1分析和桑格尔测序，鉴定对小鼠MAD2L1基因编辑情况，并对转染后的NIH/3T3细胞进行CRISPR/Cas9脱靶效应分析。结果 将Cas9-MAD2L1载体转染到NIH/3T3细胞并进行嘌呤霉素筛选后，荧光显微镜下观察到大量表达GFP的细胞，PCR结合T7E1结果显示，以转染后的细胞DNA为模板扩增出的228 bp MAD2L1 PCR产物，可被酶切成166 bp和62 bp片段，测序结果显示，成功对MAD2L1基因第二外显子靶点处进行基因编辑，脱靶效应分析未检测到CRISPR/Cas9有对脱靶位点进行基因编辑。结论 成功建立对小鼠MAD2L1基因第二外显子进行基因编辑的方法体系，设计的对MAD2L1基因编辑靶点未检测到脱靶效应的发生。     

用CRISPR/Cas9技术编辑KLF4基因对GES-1细胞生物学行为的影响

目的 采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建靶向KLF4的基因编辑质粒,建立CRISPR/Cas9-sgKLF4人正常胃黏膜GES-1细胞株,观察KLF4基因敲除效果及其对细胞生物学行为的影响.方法 设计靶向KLF4基因的sgRNA序列,将合成的片段插入到CRISPR/Cas9质粒骨架载体pX459中,再将重组后的质粒做转化,挑取克隆,扩增后提质粒进行测序验证正确性.将构建好的重组质粒体外转染入人胃黏膜细胞GES-1中,利用嘌呤霉素进行筛选获得KLF4敲除的克隆细胞,应用Western blot技术检测未转染细胞和克隆细胞中KLF4蛋白的表达情况,平板克隆实验检测KLF4敲低后克隆形成能力,MTT实验检测其增殖能力,Transwell实验检测其迁移能力.结果 经测序验证,成功构建了靶向KLF4的重组质粒pX459-KLF4-sgRNA,经Western blot方法验证,转染该重组质粒后人胃黏膜上皮细胞株GES-1的KLF4蛋白表达量明显降低,行为学实验结果表明,GES-1细胞敲低KLF4基因后克隆形成能力、增殖能力以及迁移能力都明显增强.结论 成功构建了靶向KLF4的CRISPR/Cas9基因编辑质粒载体及KLF4基因敲低的稳定细胞株GES-1,KLF4基因敲低后GES-1细胞生物学行为的改变证实其抑癌基因活性.     

基于CRISPR/Cas9技术建立敲除OSBPL2基因的HeLa细胞株

目的:利用CRISPR/Cas9技术构建OSBPL2基因敲除的稳定HeLa细胞株?方法:设计3个单导向RNA(single-guide RNA,sgRNA),分别靶向OSBPL2基因的第2?3和5外显子,以PGK1.1为载体,构建出3个重组真核表达载体?分别转染HeLa细胞后,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,CruiserTM敲除检测实验和测序共同检验载体靶向效率?选出靶向效率最高的质粒转染HeLa细胞,进行单克隆细胞培养,最后用Western blot 鉴定敲除效果?结果:sgRNA正确插入到PGK1.1载体,靶向第2外显子的重组载体转染HeLa细胞并筛选单克隆后,细胞未检测出OSBPL2蛋白的表达?结论:敲除OSBPL2基因的稳定HeLa细胞株构建成功?     

利用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠的研究

目的 应用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。方法 针对miRNA-29b1基因设计一段sgRNA,sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行测序以鉴定基因型,同时取小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miRNA-29b1在这些脏器中的表达。结果 设计了20 bp的miRNA-29b1sgRNA并与Cas9一起进行了体外转录,显微注射小鼠受精卵细胞后获得miRNA-29b1基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有两种基因型,一种为10 bp的缺失突变;另一种为22 bp的缺失突变,同时伴有3 bp的插入突变。与野生型小鼠相比,基因突变小鼠心、肝、脾、肺、肾等组织中miRNA-29b1表达量下降明显。结论 应用CRISPR/Cas9技术成功构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。     

利用CRISPR/Cas9系统构建Lrtm1基因敲除的C2C12细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除Lrtm1（leucine-rich repeats and transmenbrane domains 1）基因的C2C12细胞系,为研究Lrtm1基因的作用提供实验基础。方法：设计3对针对Lrtm1基因的向导RNA（sgRNA）,将sgRNA插入载体pCRISPR-LvSG06中;利用慢病毒包装系统包装含有sgRNA的重组质粒pCRISPR-LvSG06;将病毒感染C2C12细胞,并加入嘌呤霉素筛选,将筛选嘌呤霉素阳性的细胞提取RNA,逆转录成cDNA;设计Cas9引物,利用cDNA为模版,PCR验证C2C12细胞中Cas9的表达,确认慢病毒成功感染C2C12细胞;利用96孔板挑选单克隆细胞的方法筛选得到单克隆细胞;将扩增的单克隆细胞提取基因组DNA,测序Lrtm1基因相关序列并与野生型Lrtm1基因进行对比,确认敲除成功的克隆细胞株;诱导敲除Lrtm1稳定细胞株成肌分化,检测成肌分化标志因子Myosin的蛋白表达,RT-PCR检测转录因子PAX7的mRNA表达,Western blot检测H3K27me3蛋白水平。结果：测序结果显示向导RNA（sgRNA）成功插入载体质粒;将单克隆细胞DNA测序结果显示A和C克隆成功敲除Lrtm1基因;敲除Lrtm1基因后成肌分化标志因子Myosin蛋白表达降低,成肌转录因子PAX7 mRNA的表达降低,在分化72和96 h组,H3K27me3蛋白水平较野生型组增高。结论：利用CRISPR/Cas9技术成功敲除Lrtm1基因,稳定敲除Lrtm1基因的C2C12细胞系构建成功;敲除Lrtm1后能抑制C2C12细胞成肌分化,并且抑制成肌转录因子PAX7的mRNA表达,PAX7 mRNA表达降低的原因可能为H3K27me3水平增高。     

利用CRISPR/Cas9技术构建ACE2基因修饰的猪胎儿成纤维细胞系

目的：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)基因编辑的长白猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF)细胞系,为构建新型冠状病毒即严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 型(se- vere acute respiratory syndrome coronavirus type 2,SARS-CoV-2)不易感猪模型提供实验材料。方法：①利用生物信息学方法对大鼠和鸡的ACE2氨基酸序列进行比对,将大鼠ACE2与SARS-CoV-2 S蛋白相互作用的关键氨基酸残基替换为鸡ACE2的氨基酸残基,设计嵌合的ACE2基因并构建ACE2基因敲入供体。②设计并合成靶向猪ACE2基因的sgRNA,克隆到pX330载体上构建ACE2基因打靶载体。③将ACE2打靶载体和ACE2基因敲入供体以及Neomycin抗性质粒共转染至长白猪PFF细胞,筛选G418抗性单细胞克隆并进行测序鉴定。结果：根据氨基酸序列比对结果,将大鼠ACE2蛋白的第19、31、34、35、42、353、354位氨基酸残基替换为鸡ACE2的氨基酸残基,设计合成了嵌合的ACE2基因。G418抗性单细胞克隆基因型分析结果显示获得了阳性单细胞克隆。结论：利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源ACE2基因敲除、嵌合ACE2敲入的长白公猪PFF细胞系,为构建SARS-CoV-2不易感猪模型奠定了基础。     

基于CRISPR/Cas9技术构建严重联合免疫缺陷小鼠

目的 应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。方法 根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列,分别针对其外显子设计25 bp左右的sgRNA并进行合成, sgRNA退火后克隆入pX330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞,受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠,首建鼠（F0）与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞技术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。结果 成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录,mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后,获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型,分别是10 bp和11 bp的缺失突变;而Rag2只有一个基因型,为8 bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后,肿瘤生长良好,且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。结论 利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变,并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常。     

人/猪SERPING1同源性比较及猪SERPING1敲除细胞系的建立

目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立SERPING1^-/-猪胎儿成纤维细胞(PFFs)系,为构建遗传性血管性水肿模型提供细胞实验材料。方法 首先比较人/猪SERPING1氨基酸同源性。其次,分析猪SERPING1基因有效的编码区,据此选择第八外显子为敲除靶点,设计并合成靶向猪SERPING1的单导向RNA(sgRNA),连接到含有Cas9核酸内切酶的pX330载体上,构建SERPING1打靶载体pX330sgRNA,将其转染至猪胎儿成纤维细胞中,G418药物筛选阳性单克隆细胞。最后,用T7E1酶切实验检测靶点编辑情况,测序验证单克隆细胞基因型。结果 生物信息学分析结果提示人/猪SERPING1蛋白氨基酸同源性较高,氨基酸比对相似性达到65.87%。成功构建打靶SERPING1的载体,并转染到细胞,药物筛选获得SERPING1基因敲除的单克隆细胞,测序确认了突变的基因型。结论 人/猪SERPING1蛋白同源性较高,适合用于构建遗传性血管性水肿模型。构建的Cas9/sgRNA表达载体实现了SERPING1基因编辑,获得基因敲除的单细胞克隆,为后续SERPI...     

利用可诱导表达Cas9的HeLa细胞系进行顺铂耐药性基因筛选

目的：利用PiggyBac转座子系统,构建可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系,并针对人核受体基因构建sgRNA文库,进行顺铂耐药性基因筛选。方法：构建PB?TRE?Cas9?NLS?IRES?hrGFP?Zeo载体,与PB?CAG?rtTA以及转座酶载体一同电转到HeLa细胞中,通过药筛和挑选单克隆得到稳定细胞系;构建核受体基因sgRNA病毒文库,并感染可诱导表达Cas9的HeLa细胞系,筛选对顺铂具有抵抗性的克隆,并进行目的基因的测序鉴定。结果：挑选出可诱导表达Cas9的8E单克隆细胞株,在5个基因位点上可以进行高效编辑;感染sgRNA文库之后,挑选顺铂耐药的克隆,并鉴定出大部分克隆含有VDR sgRNA,经测序发现这些克隆中的VDR基因发生突变。结论：利用PiggyBac转座子系统,构建了可诱导表达Cas9的稳定HeLa细胞系,利用这个细胞系可以在多位点进行高效基因编辑,并可用于高通量文库筛选顺铂耐药性基因。     

基于CRISPR-Cas9定向编辑TRAC基因的研究

目的 针对人源TCRα C基因(TRAC)进行CRISPR/Cas9-gRNA的设计,并验证设计的gRNA的有效性及其脱靶率.方法 利用CRISPR网站(http://crispr.mit.edu/)提供的靶向编辑位点筛选工具,针对TCRα C区各设计出了3个编辑位点,并据此构建CRISPR-Cas9-TCR敲除质粒,将构建好的质粒转染293T细胞系,通过流式细胞术结合PCR产物的T-A克隆测序等方法验证各个gRNA序列的编辑效率.再根据所预测的潜在脱靶位点,设计相应的上下游引物进行PCR扩增后测序,检测其是否出现脱靶.结果 在3组针对TCRα C区的gRNA中,site2-gRNA的编辑效率最高,并且无脱靶现象.结论 针对人源TCRα C基因设计的site2-gRNA对TCRα C区具有很好的编辑效果,且无脱靶现象,为消除杂合TCR分子的产生和改善TCR修饰的T细胞(TCR-T)过继性免疫治疗奠定了基础.     

基于CRISPR/Cas9的PALM基因敲除约氏疟原单克隆虫株的构建

目的：基于CRISPR/Cas9技术构建并鉴定Plasmodium yoelii 17XNL PALM基因敲除单克隆虫株。方法：根据PlasmoDB数据库中的约氏疟原虫P.yoelii 17XNL PALM基因序列信息,设计引物与sgRNA。PCR扩增左、右同源臂,将同源臂和sgRNA与载体pYCm-golden-blue连接,构建用于基因敲除的CRISPR工具质粒pYCm-PALM KO。pYCm-PALM KO CRISPR质粒电转染至P.yoelii 17XNL裂殖体,尾静脉注射感染小鼠,24 h后采血查获疟原虫后,给予小鼠6 mg/mL乙胺嘧啶喂水进行药物压力筛选基因敲除疟原虫。此后每2天鼠尾采血涂片镜检疟原虫,喂药8 d时提取疟原虫基因组DNA进行PCR鉴定,最终经测序确定是否发生PALM基因敲除。将已证实存在PALM基因敲除疟原虫的鼠血采用有限稀释法接种小鼠,8 d后采血镜检疟原虫,PCR鉴定,筛选获取单克隆虫株。将获取的PALM基因敲除的单克隆虫株和P.yoelii 17XNL各接种至6只昆明小鼠体内,每只接种1×10⁵感染疟原虫的红细胞(iRBC)...     

利用CRISPR/Cas9系统建立叉头框G1基因敲除的人胚胎干细胞系

目的 采用成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9（CRISPR/Cas9）基因编辑技术构建叉头框G1（FOXG1）基因敲除的人胚胎干细胞系,研究FOXG1基因在人胚胎干细胞早期神经诱导过程中的作用。方法 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过转染2个向导RNA（gRNA）诱导人胚胎干细胞FOXG1基因的大片段敲除,经单克隆筛选、测序分析和蛋白质印迹分析验证获得FOXG1基因敲除的人胚胎干细胞;通过细胞免疫荧光染色、qRT-PCR检测FOXG1基因敲除前后细胞在早期神经诱导过程中关键标志物配对框基因6（PAX6）、性别决定区Y框蛋白2（SOX2）和正小齿同源物2（OTX2）的表达。结果 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得FOXG1基因大片段缺失的人胚胎干细胞,细胞免疫荧光染色、qRT-PCR结果均显示人胚胎干细胞早期神经诱导过程中的关键标志物PAX6、SOX2和OTX2的表达并未受FOXG1缺失的影响。结论 通过2个gRNA共转染可以快捷地诱导人胚胎干细胞FOXG1基因的大片段敲除。FOXG1基因缺失并不影响人胚胎干细胞的早期神经诱导。     

TAFA2基因剔除小鼠模型的建立

目的 建立TAFA2基因剔除小鼠模型,为在体研究TAFA2基因的生物学功能及其与中枢神经系统发生、发育的关系创造条件. 方法 运用生物信息学手段确定小鼠TAFA2基因组的序列,设计基因剔除策略,构建基因剔除载体pBR322-MK-MCS-TAFA2,以电穿孔方法将基因剔除载体导入ES细胞,用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得双抗性克隆,PCR鉴定出正确同源重组的ES细胞克隆. 结果 同源重组的ES细胞注入小鼠囊胚后获得嵌合体小鼠,嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配后获得Aguoti（野生型）毛色的小鼠41只,其中14只为TAFA2基因剔除杂合子小鼠,阳性率为34.1%.在雌、雄杂合子小鼠交配的后代中获得纯合子小鼠,初步的表型观察未发现TAFA2基因剔除小鼠出现异常改变. 结论 已成功建立了TAFA2基因剔除小鼠模型,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象.     

利用CRISPR-Cas9系统建立Prmt1敲除的小鼠胚胎干细胞系

目的利用CRISPR-Cas9系统构建Prmt1敲除的E14小鼠胚胎干细胞系,并分析验证其敲除效果。方法利用第3代基因编辑技术CRISPR-Cas9系统,针对Prmt1第4、5、6、7外显子设计4条gRNAs,gRNA两两组合转染E14细胞,特异性的敲除E14细胞中的Prmt1,并在蛋白质水平,mRNA水平和基因组水平分别验证敲除效果。结果与对照组相比,两组敲除实验组都检测不到Prmt1蛋白质和mRNA的表达,基因组测序结果分析显示,两实验组中Prmt1的mRNA均出现无义突变,使其mRNA的翻译异常终止。同时,实时定量PCR结果显示,精氨酸甲基转移酶家族其他成员Prmt2,Carm1和Prmt6 mRNA表达不受影响。结论成功获得特异性敲除Prmt1的E14细胞系,为研究Prmt1在胚胎干细胞中的作用提供了重要工具。     

pIRES2-HPV18E2-EGFP质粒重组及其在HeLa细胞中的表达

目的构建人乳头瘤病毒18型E2基因片段(HPV18E2)重组表达质粒并予以表达,为进一步研制HPV18相关疾病提供材料.方法以重组质粒(pBR322-HPV18)为模板,PCR方法扩增HPV18E2DNA片段,将HPV18E2DNA与加强绿色荧光质粒(pIRES2-EGFP)重组构建重组质粒(pIRES2-HPV18E2- EGFP).用酶切电泳及测序检查质粒重组后序列正确性.重组质粒转染Hela细胞.RT-PCR鉴定转染细胞中E2基因.结果 PCR扩增DNA片段约为1 kb,与预期结果相同.克隆重组质粒pIRES2-HPV18E2- EGFP酶切后显示的酶切图谱与预期相同,而且测序验证插入片段全序列无改变.转染并用G418筛选后,在荧光显微镜下可见绿色荧光细胞的表达.转染细胞RT-PCR出现特异性条带.结论成功构建表达HPV18 E2蛋白的靶细胞模型.