母乳及婴儿食品对致病性大肠杆菌粘附的影响

目的：比较母乳、人工婴儿食品及某喂养的婴儿粪便对致病性大肠杆菌（EPEC）粘附上皮细胞或肠粘膜的影响,以进一步阐明母乳喂养对婴儿肠道的保护作用。方法：通过细胞培养、细菌粘附实验、光镜和电镜等技术观察EPEC在含有母乳、牛奶、奶粉及母乳喂养和人工喂养的婴儿粪便滤过液的培养基中粘附HeLa细胞及肠粘膜的情况。结果：EPEC在含母乳的培养基中对HeLa细胞的粘附指数显著低于对照孔,而在含牛奶和奶粉的培养基中EPEC的粘附指数与对照孔比较无显著差别;母乳喂养婴儿粪便滤过液中的细菌粘附指数明显低于人工喂养婴儿粪便中的粘附指数。结论：母乳可能具有抑制致病性大肠杆菌粘附婴儿肠道的作用。     

致病性大肠杆菌绿色荧光蛋白标记

目的:用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记致病性大肠杆菌(enteropathogenic escherichia coli,EPEC),以方便研究细菌的黏附。方法:以真核表达载体p EGFP-C1为模板设计引物,采用PCR方法扩增EGFP基因并测序后,克隆入原核表达质粒载体p Trc99a,转染EPEC,用荧光显微镜观察IPTG诱导后EPEC对Hep-2细胞的黏附及荧光表达情况。结果:成功构建原核表达质粒p Trc99a-EGFP和菌株EPEC/EGFP,黏附到Hep-2细胞表面的细菌克隆能够表达绿色荧光蛋白。结论:对EPEC进行了EGFP标记,为计数细菌的黏附提供方便。     

亚油酸抑制肠道致病性大肠杆菌粘附HEP-2细胞

肠道致病性大肠杆菌(EPEC)由多种血清型组成,后者传统上与婴儿腹泻的爆发有关。EPEC是发展中国家婴儿腹泻的重要原因,EPEC菌株引起腹泻的机理不清楚,似乎与传统的致病特性如目前已被承认的毒素及移生因子(又叫群集繁殖因子——译者注)无关。EPEC在试管内粘附某些细胞的能力和它在体内对肠粘膜的附着有关。而这是一种可能     

致病性大肠杆菌引发宿主细胞A/E损伤分析方法的建立

目的 建立一种能够对由致病性大肠杆菌引发的宿主细胞黏附及擦拭性损伤(A/E损伤)进行半定量分析的方法,为进一步研究其致病性提供评价手段.方法 以大肠杆菌黏附HeLa细胞作为感染模型.采用姬姆萨染色和荧光肌动蛋白染色实验,通过菌落计数及肌动蛋白聚集数量定量分析,统计学处理,比较EPEC 43095、EHEC 0157:H7 Sakai株和弱毒株EHEC 0157:H7 0013015以及E. coli DH5α对HeLa细胞的黏附能力,评价它们对细胞的损伤程度.结果 EPEC对细胞的黏附及擦拭性损伤程度大于EHEC(P<0.05).EHEC Sakai和00B015在黏附能力上差异不大(P>0.05),但是,Sakai在肌动蛋白聚集形成能力方面却明显强于00B015(P<0.05).结论 成功建立了一种能够对EPEC或EHEC所引发的宿主细胞黏附及擦拭性损伤进行半定量分析的方法.     

一株肠致病性大肠杆菌的全基因组序列分析

目的 分析并找出肠致病性大肠杆菌Deng(Enteropathogenic Escherichia coli Deng,EPEC Deng)的全基因组序列特点.方法 EPEC Deng来源于我国婴幼儿腹泻患者的粪便标本,菌株采用诊断血清鉴定血清型,通过自动细菌鉴定仪,使用微量肉汤法进行药敏试验.进一步提取细菌总DNA,构建测序文库,通过Illumina 2000仪器测序,然后利用多引物PCR等方法进行补缺口及拼接,最终获得完整的全基因组.采用相关软件获得基因序列,通过对比已知的蛋白数据库进行基因功能注释及生物信息学分析.结果 EPEC Deng菌株归属O119:H6,药敏结果显示该菌株对环丙沙星、左氧氟沙星、氨苄西林及氨苄西林/舒巴坦耐药,对其余的抗菌药物均敏感.EPEC Deng基因组包含5 233 046 bp,GC含量50.48％.基因组通过注释后总共有5 347个编码蛋白序列,80个tRNA的编码基因,以及22个完整的rRNA基因编码的操纵子.EPEC染色体基因组中含有致病岛,大小约为40Kb左右,与数据库中的一个37Kb的致病岛(AF200363.1)序列极为相似,相似度达到99％.结论 完成了肠致病性大肠杆菌基因组精细测序分析,PAI是EPEC致病的关键,为进一步研究菌株的进化关系提供了基因数据.     

效应分子在致病性大肠杆菌感染细胞线粒功能障碍中的作用

目的：探讨致病性大肠杆菌（EPEC）效应分子在Hela细胞线粒体功能障碍中的作用．方法：用EPEC效应分子删除株、质粒互补株或染色质互补株感染Hela细胞,用线粒体膜电位（MMP）检测试剂盒（JC-1）染色细胞线粒体,通过多功能酶标仪检测MMP,蛋白印迹法检测效应分子的转位,免疫荧光法检测效应分子的定位,以此判断效应分子在EPEC致MMP下降中的作用．结果：与野生型组相比较,△map,△espF,△eae,△tir感染组单删除株降低细胞MMP功能显著减弱（P〈0．05）,但AespZ感染组删除株的功能却增强（P〈0．05）．与△map,△espF感染组单删除株相比较,△map espF感染组双删除株功能进一步减弱（P〈0．05）．△map,△espF,△eae感染组删除株的功能可被质粒表达相应蛋白所互补,EspFL16E定位于细胞质,也能互补△espF的功能．△tir不能被质粒表达转位受体（Tir）互补,可以被染色质表达野生型Tir或突变TirY474S互补,但不能被突变TirS434A互补．结论：除Map,EspF外,EspZ,外膜蛋白intimin和其受体Tir也是参与细胞MMP下降的重要效应分子,TirS434在Tir引起MMP下降中起重要作用．     

临床分离肠外致病大肠杆菌及其与肠内致病大肠杆菌相关性的分子流行病学研究

目的:分析临床分离肠外致病大肠杆菌(Extraintestinal pathogenic escherichia coli,ExPEC)的血清型、毒力基因及其与肠内致病大肠杆菌的同源性,探讨ExPEC与肠内致病大肠杆菌的相关性.方法:以我院2006-2009年临床分离的227株ExPEC为研究对象.用常见肠内30种致病大肠杆菌"OK"诊断血清,对上述227株临床分离ExPEC做血清分型,并用PCR分析相关毒力基因,通过脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis,PFGE)分析部分患者ExPEC与该患者肠内大肠杆菌的同源性.结果:在227株ExPEC中,分离出19株肠产毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic escherichia coli,ETEC)、15株肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic escherichia coli,EPEC).ETEC不耐热肠毒素基因(Heat-labile enterotoxin,ItA)表达率31.57%、耐热肠毒素基因(Heat-stable enterotoxin,stI)表达率47.36%、stI/ltA21.05%;EPEC紧密粘附素毒力基(E.coli attachment A,eac A)表达率60.0%,束状菌毛毒力基因(Bundle-forming pilus,bfpA)66.66%,eaeA/bfpA 26.66%.PFGE分型:2例患者血培养大肠杆菌与该患者粪便中分离出的大肠杆菌PFGE分型一致.结论:肠内致病大肠杆菌血清型能引起临床肠外感染,但所占比例相对较少,且主要为ETEC和EPEC血清型.ExPEC感染的败血症患者,其来源可能是其肠道致病大肠杆菌的移位所致.     

贵阳地区夏秋季腹泻病例中致泻性大肠杆菌监测分析

目的了解贵阳地区夏秋季感染性腹泻病例中致泻性大肠杆菌的分布状况,为该地区致泻性大肠杆菌的预防控制提供依据。方法收集2010年贵阳地区6家哨点医院的381例感染性腹泻病例的粪便标本,提取标本DNA,采用实时荧光PCR(RT-PCR)方法进行肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E Coli,EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic E coli,ETEC)、肠粘附性大肠杆菌(Enteroadherent E coli,EAEC)、肠侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E coli,EIEC)、肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E coli,EHEC)的检测,并进行病原统计分析。结果 381例腹泻病例的粪便标本中致泻性大肠杆菌检出率为34.65%,其中检出率最高的是EAEC,为12.07%;其次是EPEC,检出率为9.45%,其中非典型EPEC占75.00%;ETEC检出率为9.19%,其中ETEC-ST占60.00%;EIEC检出率为3.94%;EHEC未检出;两种病原混合感染检出率为5.25%,以EPEC和EAEC混合感染为主,占40.00%。≤5岁组和5岁组病例病原检出率分别为35.28%和30.91%,差异无统计学意义(P0.05);≤5岁组病原EAEC检出率较高(P0.05);5岁组病原ETEC检出率较高(P0.05)。男性病例检出率高于女性(P0.05)。8月、9月检出率相对较高(P0.001)。结论贵阳地区腹泻病例致泻性大肠杆菌感染以EAEC为主,其次是EPEC和ETEC,未发现有EHEC,8月、9月贵阳地区致泻性大肠杆菌的检出率较高。     

肠致病性大肠杆菌感染时血清TNF-α和IL-1β含量的检测及意义

目的 研究肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic eschefichia coli,EPEC)感染人单核白血病细胞系THP-1细胞时.血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-1β水平的动态变化及与其THP-1细胞凋亡的关系.方法 以Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪检测THP-1细胞凋亡率,以MTT法测定细胞存活率;并用酶联免疫吸附测定法动态检测感染24h内细胞培养上清中TNF-α和IL-1β浓度的变化.结果 EPEC感染THP-1细胞后TNF-α和IL-1β活性均显著增加,峰值分别出现在感染后6及12 h,而后逐渐下降,IL-1β活性至感染后24 h仍高于对照组;THP-1细胞凋亡率在感染后逐渐增高,至24 h达高峰.结论 EPEC可激活多种炎症介质和诱导THP-1凋亡,EPEC感染THP-1细胞后TNF-α和IL-1β水平的升高具有重要作用.     

岸蟹金属硫蛋白在大肠杆菌BL21中的表达

目的：在大肠杆菌BL21中表达岸蟹金属硫蛋白基因，建立金属硫蛋白原核表达的流程。方法：将重组质粒pET-GST-R转化至大肠杆菌，经PCR扩增和酶切检测，得到含重组质粒pET-GST-R的工程菌。结果：从IPTG浓度、IPTG诱导时间、金属离子浓度等几个方面摸索诱导金属硫蛋白表达的条件，表达出分子量约为33kD的融合蛋白。结论：成功制备金属硫蛋白的工程菌菌株。金属硫蛋白对大肠杆菌细胞毒性很大，培养基需添加金属离子。     

2013-2018年北京市顺义区哨点医院腹泻病例中致泻性大肠埃希菌流行特征分析

目的 了解北京市顺义区腹泻病例中致泻性大肠埃希菌(diarrheagenic Escherichia coli,DEC)的流行特征,为顺义区DEC引起的腹泻防控工作提供科学依据。方法 收集2013至2018年北京市顺义区2家哨点医院肠道门诊腹泻患者临床和流行病学资料,采集粪便标本进行DEC检测,数据采用SPSS 25.0和Excel 2010进行流行病学分析。 结果 2 068例腹泻监测病例中检出DEC 182例(8.80%),检出率由高到低依次为肠产毒性大肠埃希菌(enterotoxigenic E.coli, ETEC)(111例,5.37%)、肠致病性大肠埃希菌(enteropathogenic E.coli,EPEC)(45例,2.18%)、肠集聚性大肠埃希菌(enteroaggregative E.coli, EAEC)(27例,1.31%)(各类型DEC检出数相加大于阳性例数是由于混合感染者分别计算到各类型引起),且不同户籍、不同性别、不同年龄的检出率差异无统计学意义。DEC的季节性发病特征明显,各菌型的流行高峰均在夏季,主要表现为ETEC(χ²=76.591,P<0.001)和EAEC(χ²=10.204,P<0.05);本市患者EPEC(χ²=12.243,P<0.001)和EAEC(χ²=7.947,P<0.01)阳性检出率高;不同年龄EAEC检出率差异有统计学意义(χ²=17.171,P<0.05)。发热、恶心、腹痛、脱水症状对DEC检出率无影响,但无呕吐症状病例DEC检出率高(χ²=7.099,P<0.01),主要体现为ETEC(χ²=15.073,P<0.001);伴发热与无发热组EAEC检出率差异有统计学意义(χ²=4.951,P<0.05)。结论 北京市顺义区DEC流行的优势菌型主要为ETEC、EPEC和EAEC,季节性发病特征明显,夏季应加强DEC引起腹泻的防控工作。     

肠道致病大肠埃希菌流行病学和分子机制的研究进展

肠道大肠埃希菌既是人类正常菌群又是造成全世界发病和死亡的重要病原体。肠道致病大肠埃希菌传统上分为6种：肠道致病性大肠埃希菌（EPEC）、肠道出血性大肠埃希菌（EHEC）、肠道侵袭性大肠埃希菌（EIEC）、肠道聚集性大肠埃希菌（EAEC）、肠道产毒素性大肠杆（ETEC）和弥漫黏附大肠埃希菌（DAEC）。本文中提出肠道致病型大肠埃希菌分为8种,还包括2种新的致病型大肠埃希菌——黏附浸润性大肠埃希菌（AIEC）和产志贺毒素的聚集性大肠埃希菌（STEAEC）。在人类宿主细胞中,通过检测肠道大肠埃希菌移植和研究疾病的分子机制．发现肠道致病型大肠埃希菌根据Ⅲ型分泌系统（T3SS）,可分为依赖T3SS致病型（EHEC、EPEC、EIEC）和非依赖T3SS致病型（ETEC、EAEC、STEAEC、DAEC、AIEC）2大类。本文主要介绍了肠道致病大肠埃希菌的流行病学和分子机制的研究进展。     

携带毒力岛大肠杆菌性小儿腹泻

目的：探讨携带毒力岛大肠杆菌（HPIEC）在小儿腹泻中的病原学地位。方法：采用PCR扩增和菌落原位杂交检测HPIEC－irp2毒力岛基因,并用血清学分型和聚合酶链反应（PCR）法检测各类致泻大肠杆菌。结果：从1032例腹泻患者粪便中分离出652株大肠杆菌,经血清学和PCR毒力基因分型,检出各类致泻大肠杆菌225株,其中肠致病性大肠杆菌（EPEC）20株,ETEC81株,产志贺样毒素大肠杆菌（SLTEC）47株,产志贺样毒素侵袭性大肠杆菌（ESIEC）74株,产毒素大肠杆菌（EIEC）3株。所有致泻大肠杆菌和未能分型的普通大肠杆菌株,再用HPIEC－irp2探针作菌落原位杂交,共检出携带毒力岛大肠杆菌（HPIEC－irp2)112株,总阳性率为17．2％。其中41例是从致泻大肠杆菌ESIEC（24／74）和SLTEC（17／47）中检出。携带毒力岛大肠杆菌性小儿腹泻的主要临床表现为食欲不振（87．5％）,腹痛（58．0％）,腹泻（＞6次／d,75．9）,发热（50．9％）,以粘液便为主（69．6％）。结论：携带毒力岛大肠杆菌是引起小儿腹泻的重要病原菌之一。     

THE TRANSMEMBRANE SIGNAL TRANSDUCTION IN HEp-2 CELLS INDUCED BY BACTERIAL ADHERENCE

In order to understand the role of transmembrane signal transduction of host cells in the early steps of infection,the adherence of E. coli to HEp-2 cells and the change of activity of phospholipase C-γ (PLC-γ) induced by the adherence were investigated. The adherence of enteropathogenic E. coli (EPEC), strain E. 7, induced a significant increase of inositol-triphosphat (IP-3) level in HEp-2 cells. The adherence of the bacteria and the increase of IP-3 was kinetically correlated.Whereas the increase of IP3 level induced by the adherence of the control strain EPEC (H511), a non-piliated strain, was much meager than that by E7, a piliated strain. The results highlighted an important role of transmernbrane signals like IP-3 in the pathogenesis of EPEC.     

四种致泻性大肠埃希氏菌实验室检测研究进展

肠致病性大肠埃希氏菌（EPEC）、肠产肠毒素大肠埃希氏菌（ETEC）、肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC）、肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC）四种致泻性大肠埃希氏菌是引起人体以腹泻症状为主的全球性疾病的常见病原菌,也是我国绝大多数地区引起腹泻的主要病原菌,因此快速准确地检测这四种病原菌对预防和控制由其引起腹泻有着十分重要的作用。本文介绍了这四种致泻性大肠埃希氏菌实验室检测技术的研究进展,主要包括细菌分离培养、免疫学检测、多重PCR、实时荧光PCR等分子生物学方法。     

佛山市食品中致泻大肠埃希菌菌型分布及毒力研究

目的 了解佛山市食品中致泻大肠埃希氏菌的菌型分布及毒力携带情况。方法采集佛山市十类食品362件中分离的17株致泻大肠埃希氏菌。按GB4789．6-94国家卫生标准检验方法进行血清分型；用ELISA检测耐热肠毒素(ST)和不耐热肠毒素(LT)；毒力测定采用小鼠致病力试验和采用irp2和irpB基因探针菌落原位杂交检测ES-IEC菌株毒力岛。结果 菌型分布在三类11个型别上，其中EPEC占41．17％(7／17)，EIEC为35．29％(6／17)。ESIEC为23．53％(4／17)；17株致泻大肠埃希氏菌在七类食品中均有存在。对小鼠致病力试验均为阳性；耐热肠毒素(ST)和不耐热肠毒素(LT)均为阴性，其中4株ESIEC中1株携带耶尔森氏菌强毒力岛(HPI)。结论佛山市食品中污染致泻大肠埃希氏菌普遍，对小鼠致病力与耐热和不耐热肠毒素无必然联系；有携带耶尔森氏菌HPI的ESIEC存在。应引起足够重视。     

西南战区腹泻患者携带耶尔森菌HPI毒力岛大肠艾希菌调查

目的收集西南战区部队和地方医院腹泻患者粪便标本,做细菌分离与鉴定,分析病原菌组成。对分离的部分生化反应符合大肠艾希菌,但血清学证明不属于肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠产毒性大肠杆菌（ETEC）、肠致病性大肠杆菌（EPEC）和肠出血性大肠杆菌（EHEC）的菌株,做耶尔森菌HPI毒力岛irp-2基因检测,了解西南战区腹泻病人粪便中分离的大肠艾希菌携带耶尔森菌HPI毒力岛irp-2基因的存在情况。方法常规法分离,用肠杆菌科细菌生化鉴定编码系列（API-20E或GYZ-11e系统）和VITEK32全自动微生物生化分析仪以及弧菌科细菌生化鉴定编码系列（GYZ-9V系统）进行系统鉴定,PCR扩增法检测耶尔森菌HPI毒力岛。结果在1 352例腹泻病人中检出36个属种594株病原菌,检出率为43.93%,弗劳地枸橼酸杆菌检出率为6.14%、肺炎克雷伯菌为5.62%、变形杆菌4.66%、志贺菌4.07%,EIEC 1.85%,检出36株携带耶尔森菌HPI毒力岛irp-2基因大肠艾希菌,检出率为2.66%。结论从1352例腹泻患者粪便标本中分离到弗劳地枸橼酸杆菌占首位,肺炎克雷伯菌次之,变形杆菌、志贺菌分别居第三、第四位。西南战区存在携带耶尔森菌HPI毒力岛irp-2基因的大肠艾希菌。     

产毒性和致病性大肠杆菌中小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛的检测

目的　了解小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛在产毒性和致病性大肠杆菌中的分布,探讨毒力岛在大肠杆菌中的结构和功能。方法　对毒力岛的关键基因irp2、fyua和asn-intB进行PCR扩增和DNA测序,并对irp2和fyua进行原位杂交。结果　在检测的93株肠产毒性大肠杆菌和10株肠致病性大肠杆菌基因irp2的检出率分别为32.25％（30/93）和30％（3/10）,fyua的阳性率为21.51％（20/93）和30％（3/10）,而且这些阳性菌株中的毒力岛大部分连接到天门冬氨酸tRNA（asn tRNA）位点。结论　小肠结肠炎耶尔森菌强毒力岛在产毒性和致病性大肠杆菌中较高的阳性率,对于大肠杆菌毒力的变化和毒力的调控以及细菌毒力的进化可能具有重要意义。     

大肠杆菌致小鼠急性腹膜炎模型的建立

目的建立一种简便、稳定、符合临床特征的小鼠感染大肠杆菌致细菌性腹膜炎的模型。方法小鼠腹腔分别注射9种浓度的2株大肠杆菌菌液,分别于4、6、8、16、24h记录小鼠外周血白细胞总数的变化;记录实验组小鼠死亡时间,并解剖死亡小鼠,观察其腹腔情况以及肝、脾组织的病理变化。结果各实验组小鼠均表现出细菌性腹膜炎临床征象,高于2×10^8cfu/ml浓度的实验组小鼠细菌性腹膜炎尤为典型;小鼠外周血白细胞总数随着注射菌液后时间的延长呈现先升高后降低的趋势;病理检查显示实验组小鼠肝、门管、脾窦内有不同程度的中性粒细胞浸润。标准菌株的MLD为3×10^8cfu/ml。结论小鼠大肠杆菌细菌性腹膜炎模型建立成功;小鼠死亡率因不同菌株、不同浓度而有所差异。