定点诱变HBcAg质粒在人永生化B淋巴母细胞系中的稳定表达

目的:构建携带V60, G87, L97突变位点的HBV全基因组真核细胞表达载体,转染慢性HBV感染者永生化B淋巴母细胞系(LCL),建立相同HLA背景下的慢性HBV感染CTL应答的刺激细胞和靶细胞.方法:用定点突变技术在HBVp3.8Ⅱ质粒C基因区3个氨基酸V60, G87, L97位置进行突变(p3.8Ⅱ- V60, G87, L97),转化E. coli XL1-Blue感受态细胞扩增筛选,用限制性内切酶SacⅠ和KpnⅠ分别将野生型和突变型p3.8Ⅱ质粒进行双酶切, 插入EBO-plpp真核细胞表达载体,转染LCL,潮霉素稳定筛选后,鉴定目的基因在转染细胞是能够稳定表达.结果:DNA序列分析表明,野型HBV DNA核心区第60, 87, 97位氨基酸发生了预期的突变,Western Blot和微粒子免疫荧光法证明,转染的LCL能稳定表达HBV 抗原.结论:定点诱变HBcAg质粒在人永生化B淋巴母细胞系中可稳定表达.     

基因B型及C型慢性乙型肝炎患者特异性T淋巴细胞应答的差异

目的比较HBV基因B,C基因型患者间HBV特异性T淋巴细胞应答的差异。方法以我国主要流行的B,C基因型为病毒学背景,设计覆盖HBV全基因序列的重叠多肽池,PCR-RFLP方法检测患者HBV基因型,通过酶联免疫斑点试验检测30例基因B,C型慢性HBV感染者的特异性T淋巴细胞分泌IFN-γ差异。结果在30例慢性HBV感染者中基因B型有21例(70%),基因C型有9例(30%);在特异性T淋巴细胞应答方面,HBV基因B型患者明显高于基因C型患者(P=0.021)。结论HBV基因B型较高的特异性T淋巴细胞反应水平对于解释HBV基因B型患者与基因C型患者临床转归差异提供了细胞免疫学依据。     

丙型肝炎病毒HLA-A＊1101和A＊2402限制性CD8＋T细胞表位的研究

目的：鉴定出丙型肝炎病毒（HCV）特异性HLA-A＊1101限制性和A＊2402限制性CD8＋T细胞表位.方法：采用T细胞表位预测软件SYFPEITHI预测HCV特异性CD8＋T细胞表位,合成HLA-A＊1101限制性、A＊2402限制性候选表位;建立永生化的HLA-A＊1101阳性、A＊2402阳性B细胞株,采用竞争性肽结合实验检测候选表位与HLA-A＊1101或A＊2402分子的结合力;候选表位体外分别刺激HLA-A＊1101阳性或A＊2402阳性HCV感染者外周血单个核细胞（PBMCs）后,采用酶联免疫斑点（ELISPOT）和细胞内细胞因子染色（ICS）实验分别检测肽特异性分泌γ-干扰素（IFN-γ）的细胞的水平和（肝） 异性IFN-γ＋CD8＋T细胞的水平.结果：5条HLA-A＊1101限制性候选表位中,NS3_609（ITLTHPITK）和NS2_165（VVFSDMETK）与HLA-A＊1101分子具有高结合力.3条HLA-A＊2402限制性候选表位中,NS3_373 （KCDELASKL）和NS5b_382 （YYLTRDPTI）与HLA-A＊2402具有高结合力;在HLA-A＊1101阳性HCV感染者PBMCs中存在NS3 609和NS2_165特异性分泌IFN-γ的CD8＋T细胞,而在HLA-A＊2402阳性HCV感染者PBMCs中存在NS3_373和NS5b 382特异性分泌IFN-γ的CD8＋T细胞.结论：本研究证实NS3_609（ITLTHPITK）和NS2_165（WFSDMETK）为全新的HCV特异性HLA-A＊1101限制性CD8＋T细胞表位,NS3_373 （KCDELASKL）和NS5b_382 （YYLTRDPTI）为全新的HCV特异性HLA-A＊2402限制性CD8＋T细胞表位.     

2型糖尿病遗传家系永生细胞株的建立

目的体外建立2型糖尿病家系永生化B淋巴母细胞系。方法应用EB病毒（EBV）转化技术,将2型糖尿病家系外周血B淋巴细胞转化成永生化淋巴母细胞系（LCL）。结果成功地为一个2型糖尿病家系的10名成员建立了永生细胞株,其中4名为患者。 结论2 型糖尿病家系永生细胞株成功建立,该细胞株保存了原来个体完整的基因组,为以后的深入研究提供随时可取的实验材料。     

MAGE-A3抗原肽负载树突状细胞诱导乳腺癌患者免疫应答的研究

目的研究MAGE-A3抗原肽负载对乳腺癌患者树突状细胞(DC)的功能的影响,探讨其是否可以在体外诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答.方法体外培养HLA-A2乳腺癌患者外周血来源的DC,并经孵育携带MAGE-A3抗原肽,用以刺激CTL,用3H-TdR渗入法检测抗原肽负载前后DC刺激同种淋巴细胞增殖能力(MLR),并用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CTL对靶细胞的杀伤效应.结果DC:T为1:10时,单纯DC组刺激能力显著高于抗原肽负载组DC(DC-P)(P＜0.05),但当DC:T低于1:20时后DC-P组刺激能力显著强于单纯DC组(P＜0.05).DC-P组和单纯DC组所激发的CTL对细胞株MCF-7,Sk-Br-3,MDA-MB-435s的杀伤活性有显著性差异,而对细胞株Raji无显著性差异,DC-P组对细胞株MCF-7,Sk-Br-3,MDA-MB-435s的杀伤活性明显高于对细胞株Raji的杀伤活性.结论负载MAGE-A3抗原肽的DC在体外可以诱导乳腺癌患者特异性的CTL免疫应答,为临床以DC为基础的过继免疫治疗的应用提供理论基础.     

基因转染Sp2/0细胞作为检测乙肝病毒基因疫苗细胞免疫效应的靶细胞的研究

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)S基因转染的Sp2/0细胞作为检测HBV基因疫苗细胞免疫效应的靶细胞的可行性.方法以脂质体介导基因转染,含G418的培养基筛选,获得HBV基因S转染的Sp2/0细胞;构建编码HBV抗原蛋白S的重组真核表达质粒pCR3.1-S作为HBV基因疫苗;采用51Cr 4 h释放法体外检测HBV基因疫苗免疫接种小鼠的淋巴细胞杀伤功能.结果与空载体对照组相比较,HBV基因疫苗诱发Balb/c小鼠产生较好的HBV特异的细胞免疫应答(P＜0.05).结论以Sp2/0基因转染细胞作为靶细胞检测免疫BALB/c小鼠的淋巴细胞杀伤功能是可行的.     

B淋巴细胞的永生化及初步筛选

目的构建永生化B淋细胞株并作初步筛选.方法自肺癌患者的肿瘤引流淋巴结中分离出B淋巴细胞,在体外用EB病毒感染使之永生化,再用免疫比浊法测定培养基上清液中人Ig.结果利用上述方法可使B淋巴细胞在体外获得永生化并能分泌人IgG.结论能分泌人型抗体的永生化B淋巴细胞将为进一步构建人源化单链抗体库奠定基础.     

浙江地区原发性免疫缺陷病患儿永生化B淋巴细胞系的建立

目的 利用EB病毒转化人外周血B淋巴细胞,建立浙江地区原发性免疫缺陷病患儿永生化B淋巴细胞系.方法 利用B95-8细胞常规制备EB病毒上清,用环孢菌素A法转化外周血B淋巴细胞.结果 成功建立15例原发性免疫缺陷病患儿永生化B淋巴细胞系,转化后细胞增殖活跃.结论 EB病毒加环孢菌素A能成功转化外周血B淋巴细胞为永生化B淋巴细胞系,为进一步研究原发性免疫缺陷病的分子遗传机制和细胞遗传机制提供了实验材料.     

HFRS患者汉滩病毒特异性CTL克隆靶细胞的建立及意义

目的:建立肾综合征出血热(HFRS)患者汉滩病毒(HTNV)核衣壳蛋白(NP)特异性CTL克隆的靶细胞.方法:采用Ficoll密度梯度离心法分离HFRS患者外周血单个核细胞(PBMC),并用EB病毒(EBV)转化B淋巴细胞,建立B淋巴母细胞样细胞系(B-LCL).然后,用含HTNVS基因的重组痘苗病毒(rVV)转染B-LCL,间接免疫荧光(IFA)检测NP的表达,并用HTNV特异性T细胞克隆对转染rVV的B-LCL进行细胞毒杀伤实验.结果:B淋巴细胞经EBV感染4wk左右,可形成B-LCL.HTNV-S基因在B-LCL中能有效表达NP,且能被HTNV特异性T细胞克隆识别.结论:成功建立了HFRS患者永生化B-LCL.含HTNVS的基因重组痘苗病毒转染的B-LCL可用作HTNV特异性CTL克隆的靶细胞.     

瘢痕疙瘩家系永生淋巴细胞株的建立及其染色体分析

目的建立瘢痕疙瘩家系永生淋巴细胞株,并对该细胞株进行染色体核型分析,探讨用这种方法建立瘢痕疙瘩永生细胞库的可行性和可靠性。方法采用EB病毒转化技术,把瘢痕疙瘩家系外周血B淋巴细胞转化成永生化淋巴母细胞系(LCL)。分别对建株前和建株后10、20、30、35代的细胞株进行染色体核型分析。结果成功地对瘢痕疙瘩家系27个个体建立了永生细胞株,建株后10代、20代的细胞株染色体未发现明显异常;而培养30代、35代的细胞株染色体发生数目和结构的异常。结论瘢痕疙瘩家系永生淋巴细胞株可以为以后的研究提供随时可取的实验材料,在用做遗传学分析时宜在转化早期进行。     

人B淋巴母细胞系体外培养方法的优化及其影响因素

目的探讨体外建立健康人外周血B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）的优化方法及其影响因素。方法用EB病毒感染健康人外周血中分离的单个核细胞（PBMC）,加入CD40激发型抗体（5C11）、CpGDNA免疫调节基因序列以诱导B淋巴细胞增殖,环胞菌素A（CysA）抑制T淋巴细胞的活性。光学显微镜下观察B-LCLs的形态特征,利用流式细胞术分析B-LCLs膜表面分子CD19的表达水平。结果PBMC经EBV感染3周后转化成永生化B-LCLs。转化后的B淋巴母细胞体积增大积聚成团,可进一步分裂增殖并长期传代培养。CD40激发型抗体（5C11）及CpG免疫调节基因序列联合EBV感染人PBMC,明显地提高了转化效率,转化后的LCLs保持了成熟B淋巴细胞的生物学特征。结论CD40信号激发和CpG免疫调节基因序列联合运用能有效地促进EBV对人B淋巴细胞的转化及体外建系。     

分泌血型特异性抗体人B淋巴细胞系的建立

目的:建立Epstein-Barr病毒(EBV)转化的分泌血型特异性抗体的永生化B淋巴细胞系。方法:采用EBV转化外周血B淋巴细胞,加入环孢素抑制T淋巴细胞,建立B血型人B淋巴细胞系(B-LCL),红细胞凝集试验检测细胞培养上清与血型红细胞结合活性。结果:共采集B血型健康人全血15份,成功转化12份,转化率为80%;获得9株分泌抗A抗体的人B淋巴细胞系。结论:建立了分泌抗A抗体B淋巴细胞系,为进一步研制人源血型特异性单克隆抗体奠定基础。     

肾综合征出血热患者永生化B淋巴母细胞系的建立

目的 建立肾综合征出血热患者永生化的B淋巴母细胞系，为进一步研究汉滩病毒感染者的细胞免疫功能奠定基础。方法 自HFRS患者血液中分离外周血单个核细胞(PBMC)，再用EB病毒感染PBMC，同时加入环胞素A(CysA)。结果 20例血样标本经EBV感染4周左右，形成了15例永生化B淋巴母细胞系。成功转化后的B淋巴母细胞系，其体积增大，进而增殖的淋巴细胞积聚成团。结论 永生化的B淋巴母细胞系可传代培养。冻存复苏后细胞增殖活性并无改变。     

瘢痕疙瘩家系外周血淋巴细胞永生化方法探讨

目的探讨建立瘢痕疙瘩家系永生化细胞库的方法，为研究瘢痕疙瘩的发病机制、诊断和治疗提供长期的标本来源。方法采用EB病毒转化技术，分别采用新鲜血法和冻存血法。将瘢痕疙瘩家系外周血B淋巴细胞转化成永生化淋巴母细胞系。结果成功建立了一瘢痕疙瘩家系中27个个体的永生细胞株：新鲜血法较冻存血法可明显提高一次建系成功率。结论EB病毒转化技术可有效保存原来个体完整的基因组，为以后的相关研究提供了长期的DNA资源。新鲜血法明显优于冻存血法，更适用于永生化细胞库的建立。     

肾综合征出血热患者B淋巴母细胞系的建立方法及意义

目的 :探讨EB病毒 (EBV)转化B淋巴细胞的最佳方法 ,为进一步研究肾综合征出血热 (HFRS)患者的细胞免疫功能奠定基础。　方法 :采用环孢素A(CsA)法、微量全血法和冻存全血法三种方法建立B淋巴母细胞样细胞系 (B LCL) ,比较建立细胞系成功率和所用时间。　结果 :EBV成功转化后的B LCL ,其体积增大并永生化 ,进而增生的淋巴细胞积聚成团。CsA法、微量全血法和冻存全血法转化的成功率分别为 73.3%、2 6 .7%和 4 6 .7%。　结论 :CsA法成功率高 ,建立细胞系所用时间短 ,是建立B LCL的最佳选择。     

中国海南岛3个黎族主要支系永生细胞系的建立与保存

目的:建立侾黎、杞黎、本地黎3个黎族主要支系的永生细胞库。方法:采用EB病毒转化外周血B淋巴细胞并加环胞霉素A抑制T淋巴细胞建立永生细胞系。结果:成功地对侾黎、杞黎、本地黎的部分个体建立了永生细胞系。其中侾黎66株,杞黎76株,本地黎54株,共196株。结论:侾黎、杞黎、本地黎永生细胞库的建立使特有的黎族基因组得到系统地、永久地保存,并为分析其遗传学差异奠定了基础。