皮肤成纤维细胞构建组织工程肌腱的实验研究

近年来，研究者们应用类似于骨髓基质干细胞的细胞作为组织工程肌腱的种子细胞，未获明显进展。皮肤成纤维细胞和肌腱细胞均来源于中胚层，细胞形态相似。如果成纤维细胞能取代肌腱细胞，作为种子细胞应用于肌腱组织工程则可望解决种子细胞缺乏的难题。作者曾应用成纤维细胞作为种子细胞修复肌腱缺损取得初步成功，但缺乏长期观察结果。本研究旨在长期观察皮肤成纤维细胞构建的组织工程肌腱，并与肌腱细胞作为种子细胞的组织工程肌腱进行比较。     

应用人皮肤成纤维细胞体外构建组织工程化肌腱

目的 探讨应用国产可吸收生物材料聚羟基乙酸(PGA)和人皮肤成纤维细胞在体外构建组织工程化肌腱的可行性.方法 酶消化法获得人皮肤成纤维细胞经体外培养、扩增至第2代,接种于PGA材料(将材料固定于U形弹簧)并给予持续张力作为实验组(n=15);接种成纤维细胞但不给予任何张力作为对照组1(n=15),即无张力组;给予张力但未接种细胞的单纯PGA为对照组2(n=3),即无细胞组;给予张力并接种肌腱细胞的作为对照组3(n=5,仅限第9周时间点),即肌腱细胞组.体外培养后分别于第2、5、9、14和18周取材进行组织学、生物力学和电镜检测.结果 第2周时,实验组与无张力组大体观察未见明显差异,组织学上主要是未降解的PGA纤维,电镜观察显示细胞在材料上黏附伸展良好.第5周时,除无细胞组外均有新生肌腱样组织形成,组织学检查提示胶原纤维形成.第9周时,无细胞组PGA发生断裂;实验组形成的肌腱组织直径为(1.18±0.25)mm,明显细于无张力组[(2.43±0.49)mm,P=0.017];实验组和肌腱细胞组除后者细胞数量略少外,在大体和组织学上较为相似.实验组形成的胶原包括Ⅰ型和Ⅲ型,细胞和胶原纤维沿受力方向排列,类似正常肌腱;无张力组则杂乱排列,且残留PGA较多.实验组的抗张强度为(2.75±0.59)MPa,接近肌腱细胞组[(3.08±0.30)MPa,P=0.439],明显强于无张力组[(0.82±0.21)MPa,P=0.006].第14周时,无细胞组的PGA基本降解;实验组胶原纤维直径增粗,死亡细胞增多,出现中空现象,但抗张强度比同组第9周时增加.第18周时,实验组中空现象更为明显,抗张强度下降,余与同组第14周时相似.结论 应用人皮肤成纤维细胞在体外可以构建出与肌腱细胞所构建的相类似的人肌腱样组织,施加一定张力可能更有利于组织形成,但体外培养时间不宜过长.     

皮肤成纤维细胞构建组织工程化猪角膜基质样组织

目的 探讨以皮肤成纤维细胞为种子细胞,在猪角膜微环境中构建组织工程化角膜基质组织的可行性.方法 分离获取胎猪皮肤成纤维细胞经体外培养、扩增.通过转染绿色荧光蛋白(GFP)基因标记细胞,示踪细胞的转归.选取第3代的细胞接种于可吸收生物材料聚羟基乙酸(PGA),形成细胞-生物材料复合物,体外培养1周后,移植于猪的角膜基质层内,于第8周取材进行大体、组织学检查及超微结构观察.以角膜基质细胞为种子细胞构建的组织工程化角膜基质组织作为对照.结果 术后8周,实验组角膜逐渐恢复透明,与对照组角膜无明显差别.组织学检查显示形成新生的角膜基质样组织,呈板层状,排列较规则,与对照组角膜组织相似.超微结构观察及胶原纤维直径检测显示,实验组与对照组角膜组织差异无统计学意义.荧光显微镜观察到GFP阳性细胞存在.结论 皮肤成纤维细胞可能替代角膜基质细胞,在猪角膜内构建角膜基质样组织.     

皮肤成纤维细胞构建组织工程化猪角膜基质样组织

目的探讨以皮肤成纤维细胞为种子细胞,在猪角膜微环境中构建组织工程化角膜基质组织的可行性。方法分离获取胎猪皮肤成纤维细胞经体外培养、扩增。通过转染绿色荧光蛋白(GFP)基因标记细胞,示踪细胞的转归。选取第3代的细胞接种于可吸收生物材料聚羟基乙酸(PGA),形成细胞-生物材料复合物,体外培养1周后,移植于猪的角膜基质层内,于第8周取材进行大体、组织学检查及超微结构观察。以角膜基质细胞为种子细胞构建的组织工程化角膜基质组织作为对照。结果术后8周,实验组角膜逐渐恢复透明,与对照组角膜无明显差别。组织学检查显示形成新生的角膜基质样组织,呈板层状,排列较规则,与对照组角膜组织相似。超微结构观察及胶原纤维直径检测显示,实验组与对照组角膜组织差异无统计学意义。荧光显微镜观察到GFP阳性细胞存在。结论皮肤成纤维细胞可能替代角膜基质细胞,在猪角膜内构建角膜基质样组织。     

生长因子在人肌腱细胞和皮肤成纤维细胞中的表达差异

目的 对几种重要的生长因子在正常人体皮肤、肌腱中的表达差异进行研究。方法 体外培养人肌腱细胞和人皮肤成纤维细胞，观察细胞的形态特点；用基因芯片、免疫组化、免疫细胞化学、RT-PCR的方法对肌腱细胞和成纤维细胞的几种生长因子进行检测及比较。结果 所测生长因子中除转化生长因子-βⅡ型受体(TGF-βRⅡ)、类胰岛素生长因子-结合蛋白3(IGF-BP3)外，其余在肌腱细胞和成纤维细胞中的表达均无明显的差异。结论 人成纤维细胞与人肌腱细胞的生长因子表达基本相似，通过对皮肤成纤维细胞的某些特性的改造，可以使其成为构建组织工程化肌腱的种子细胞。     

生长因子在人肌腱细胞和皮肤成纤维细胞中的表达差异

目的对几种重要的生长因子在正常人体皮肤、肌腱中的表达差异进行研究.方法体外培养人肌腱细胞和人皮肤成纤维细胞,观察细胞的形态特点;用基因芯片、免疫组化、免疫细胞化学、RT-PCR的方法对肌腱细胞和成纤维细胞的几种生长因子进行检测及比较.结果所测生长因子中除转化生长因子-βⅡ型受体(TGF-βRⅡ)、类胰岛素生长因子-结合蛋白3(IGFBP3)外,其余在肌腱细胞和成纤维细胞中的表达均无明显的差异.结论人成纤维细胞与人肌腱细胞的生长因子表达基本相似,通过对皮肤成纤维细胞的某些特性的改造,可以使其成为构建组织工程化肌腱的种子细胞.     

皮肤成纤维细胞培养的体会

国内已有一些科研单位开展了皮肤成纤维细胞的培养技术〔１〕，因其在核型分析中稳定性好，并能够表达其来源个体的基因组中与代谢有关的绝大多数基因，利用理化方法予以检测。此外皮肤组织取材方便、安全，易为患者接受，可以动态观察，细胞株可储存备用，故有着重要的实...     

人皮肤角质形成细胞和成纤维细胞的原代培养和鉴定的实验研究

目的建立人皮肤角质形成细胞(keratinocyte)成纤维细胞(fibmblast)原代培养和体外连续培养的模型，为组织工程化皮肤提供充足的种子细胞。方法以5-15岁小儿包皮为材料，胰蛋白酶消化后，分离两种细胞，分别用无血清表皮培养液(K-SFM)、DMEM(10％血清)培养，对年轻细胞(2-4代角质形成细胞，10-40代成纤维细胞)均用倒置显微镜进行大体观察，透射电镜进行超微结构观察，并拍照记录，同时进行免疫细胞化学鉴定。结果消化后得到大量细胞，在培养2周后开始传代，光镜下角质形成细胞呈典型铺路石状，透射电镜下呈多边形，符合角质形成细胞特征；成纤维细胞光镜下呈梭形，放射状或漩涡状排列，电镜证实是成纤维细胞。免疫细胞化学检测：角质形成细胞鼠抗人角蛋白(AE1／AE3)单克隆抗体(mouse anti-cytokeratin)染色阳性；成纤维细胞鼠抗人Ⅰ型，Ⅲ型胶原单克隆抗体(mouse anti-TypeⅠ，ⅢCollagen)和鼠抗人波形蛋白单克隆抗体(mouse anti-vim-entin)染色阳性。结论用简便易行，经济实用的方法在体外对角质形成细胞和成纤维细胞进行分离、培养和传代，能同时得到足够数量的组织工程皮肤的种子细胞。     

复方壳多糖组织工程皮肤分泌b-FGF的初步研究

目的 研究组织工程皮肤培养液中碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)的分泌情况.方法 收集复方壳多糖组织工程皮肤制备过程中复方壳多糖皮肤替代物(SE)、复方壳多糖真皮替代物(DE)、单层角质形成细胞(KC)以及复方壳多糖DE与KC在transwell内共培养的培养液样本,双抗体夹心ELISA法测定其中b-FGF分泌量.结果 b-FGF分泌量依次为单层KC＜复方壳多糖DE/KC共培养＜复方壳多糖SE＜复方壳多糖DE.结论 角质形成细胞能调控成纤维细胞分泌b-FGF能力,有利于伤口愈合.     

以表皮干细胞与HaCaT细胞为种子细胞构建组织工程皮肤的比较研究

目的 比较人表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)与人永生化角质细胞HaCaT作为种子细胞构建组织工程皮肤的差异.方法 Ⅳ型胶原快速黏附法分选表皮干细胞,无血清培养基DK-SFM培养,取第2代备用;应用DK-SFM培养HacaT细胞,取对数生长期的细胞备用;利用组织工程技术构建真皮等价物(dermal equivalent);将上述备用的两种种子细胞分别接种在真皮替代物的表面,构建组织工程皮肤,先后进行浸没培养和气-液面器官型培养,从形态学、物理特性、HE染色等方面观察比较培养物的差异.结果 以ESCs构建的组织工程皮肤收缩快,分层分化近似于正常皮肤,具有较好的张力和韧性.以HaCaT细胞构建的组织工程皮肤分层少,生长慢,张力韧性较差.两种皮肤的直径都随培养时间的增加而缩短,且在3～7 d各检测时相点间有显著性差异(P＜0.05).结论 ESCs比永生化的HaCaT细胞更适合作为种子细胞构建组织工程皮肤.     

猪小肠粘膜下层作为组织工程肌腱支架的试验研究

目的:制备小肠粘膜下层,用作肌腱替代物,观察其替代肌腱的过程和结果,检验体内组织工程理论的可行性。方法:取猪小肠的空肠部分,经化学处理后,将小肠粘膜下层卷曲成轴,取15只19天的罗曼鸡胚趾深屈肌腱,用酶消化方法体外分离培养肌腱细胞,并进行传代扩增。对各代肌腱细胞的活性与手术中进行比较。分别于术后第3、6、9周作为时间点,每个时间点处死8只动物切取左趾移植物,进行检测,所得数据进行处理和分析。结果:SIS替代肌腱的过程是代谢过程,经过16周,SIS为宿主肌腱完全替代,其组织结构和力学性能与正常肌腱极其接近。结论:体内组织工程理论至少在肌腱再生方面是可行的。复合细胞的SIS肌腱替代物优于单纯SIS替代肌腱的作用,SIS具有很好的生物相容性和力学强度,有可能成为肌腱组织工程的一种理想的支架材料。     

Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor, LY294002, induced senescence-like changes in human diploid fibroblasts

Objective To reveal the role of Phosphatidylinositol 3-kinases (PI3Ks) in regulating human diploid fibroblast (2BS cell) senescence as well as the possible mechanisms involved.Methods Using a PI3Ks specific inhibitor, LY294002, cell cycle, apoptosis, proliferation, senescence association β-galactosidase staining as well as senescence association CKIs, p16INK4 and p21Cip1 protein expressions were all measured in the low passages of 2BS cells.Results Both 25 μmol/L and 50 μmol/L concentrations of LY294002 could cause a significant decrease in cells entering into S phase, and this cell cycle of G1 phase arrest was dose-dependent. Meanwhile, LY294002 contributed to apoptosis, caused 2BS cell growth arrest, and activated senescence association β-galactosidase (P<0.05). In addition, LY294002 could induce time-course expressions of p16INK4 and p21Cip1 in 2BS cell lines. Conclusions PI3Ks inhibitor LY294002 could induce senescence-like changes in 2BS cell lines. Two senescence associated CKIs, p16INK4 and p21Cip1, might be involved in this senescence phenotype proceeding in 2BS cell lines.     

pSG5-Cbfa1转染兔皮肤成纤维细胞及其瞬时表达

目的　探讨外源性小鼠Cbfa1基因在兔皮肤成纤维细胞中获得瞬时表达的可行性。方法　在阳离子脂质体介导下 ,将含外源性小鼠Cbfa1基因的 pSG5 Cbfa1真核表达质粒导入原代培养的第 2代兔皮肤成纤维细胞内。采用RT PCR及Western Blot法检测Cbfa1基因在兔皮肤成纤维细胞内的瞬时表达。同时采用RT PCR法检测细胞内骨钙素及碱性磷酸酶基因的表达情况。结果　转染pSG5 Cbfa1真核表达质粒的兔皮肤成纤维细胞内有大量小鼠Cbfa1mRNA转录及蛋白瞬时表达 ,同时诱导骨钙素mRNA及碱性磷酸酶mRNA大量表达。结论　在阳离子脂质体介导下 ,小鼠Cbfa1基因能够导入兔皮肤成纤维细胞内并获得瞬时表达 ,同时诱导细胞内成骨特异性骨钙素基因及碱性磷酸酶基因的转录     

不同厚度自体皮片移植对大鼠深Ⅱ°烧伤创面成纤维细胞转化的影响

目的 探讨自体刃厚皮、中厚皮及全厚皮覆盖SD大鼠深Ⅱ°烧伤创面对创基成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响.方法 将40只SD大鼠随机平均分为A、B两组,每组每只大鼠制作10%体表面积的深Ⅱ°烧伤模型,伤后即刻削痂并采用自体刃厚皮、中厚皮及全厚皮覆盖创面,同体相同对照创面伤后不做任何覆盖,A组于植皮后48 h取材,B组于植皮后7 d取材.用免疫组化方法观察不同创基中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达情况,定量检测肌成纤维细胞(α-SMA阳性细胞)和成纤维细胞(α-SMA阴性细胞)的数量,计算肌成纤维细胞转化率.结果 植皮后48 h取材组对照创面、刃厚皮移植创面、中厚皮移植创面和全厚皮移植创面创基肌成纤维细胞的转化率分别为(76.3±3.3)%、(69.8±1.6)%、(57.5±1.6)%、(44.7±1.7)%;植皮后7 d取材组上述4种创面创基肌成纤维细胞的转化率分别为(72.9±6.1)%、(63.6±4.7)%、(50.2±1.6)%、(32.3±1.2)%.对照创面创基肌成纤维细胞转化率均高于各实验创面(均P＜0.01);刃厚皮、中厚皮及全厚皮移植创面两两比较,创基肌成纤维细胞转化率差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 SD大鼠深Ⅱ°烧伤创面成纤维细胞向肌成纤维细胞转化率与其创面的覆盖方式直接相关,这可能对远期瘢痕收缩的程度有直接影响.

Abstract：

Objective To investigate the effect of thin split-thickness skin, inter-mediate thickness skin and full-thickness skin autograft on the differentiation of fibroblasts into myofibroblasts in rats after deep partial thickness burn. Methods A total of 40 SD rats were divided randomly into two groups (Group A & Group B, n =20 each). In Group A, tissue samples were collected at Day 2 after skin-grafting while Day 7in Group B. In each group, every rat was scalded to cause deep partial thickness wound with an area of 10% of total body surface. The wounds received eschar shaving instantly coupled with skin-autograft, covering with thin split-thickness skin, inter-mediate thickness skin and full-thickness skin respectively. Meanwhile the control wound on the same rat was scalded only. Then the expression of α-SMA was detected by immunohistochemistry in each wound. And the numbers of myofibroblasts (α-SMA positive cells ) and fibroblasts (negative cells) were counted to calculate the conversion ratio of myofibroblasts. Results In Group A, the conversion ratios of myofibroblasts of control, thin split-thickness skin autograft, inter-mediate thickness skin and full-thickness skin groups were (76. 3 ±3. 3)%, (69. 8 ± 1.6)%, (57.5 ± 1.6)% and (44. 7 ± 1.7 ) % respectively. In Group B, the ratios were (72. 9 ± 6. 1 ) %, ( 63.6 ± 4. 7 ) %, ( 50. 2 ±1.6)% and (32. 3 ± 1.2)% respectively. The ratio was higher in control group than that in any other one (P ＜0. 01 ). There was statistic difference between thin split-thickness skin, inter-mediate thickness skin and full-thickness skin autograft groups ( P ＜ 0. 05 ). Conclusion A direct association may exist between the conversion ratio of myofibroblasts and the application of skin-grafting in rats after deep partial thickness scalding. It is probably related with varying degrees of scar contracture in the long-term.     

以兔毛囊干细胞与尿道黏膜干细胞为种子细胞构建组织工程尿道的比较

目的比较兔毛囊干细胞与尿道黏膜干细胞的表型及生物学特性,探索毛囊干细胞作为组织工程尿道种子细胞的可行性。方法体外分离、培养兔毛囊干细胞和尿道黏膜干细胞,并使用流式细胞仪分选富集直径<10μm、integrin-α6+/CD71-的干细胞。计算两种干细胞的最大扩增倍数和克隆形成能力,使用流式细胞仪检测两种干细胞K19、p63、β1-in-tegrin的阳性表达率。将富集毛囊干细胞和尿道黏膜干细胞接种在尿道支架上,构建组织工程尿道,应用组织学、荧光染色法观察体外构建的组织工程尿道的情况。结果兔毛囊干细胞与尿道黏膜干细胞的最大扩增倍数分别为(6.1±0.8)×104倍、(7.1±1.1)×103倍,克隆形成率分别为(10.1±1.3)%、(4.3±1.1)%。K19、p63、β1-integrin在毛囊干细胞中阳性表达率分别为(90.53±6.77)%、(93.31±5.57)%、(91.17±6.98)%,在尿道黏膜干细胞中阳性表达率分别为(88.50±4.95)%、(91.63±5.86)%、(93.35±6.28)%。毛囊干细胞与尿道黏膜干细胞在支架上都能形成复层上皮样结构,AE1/AE3染色阳性。结论兔毛囊干细胞与尿道黏膜干细胞都可以作为种子细胞构建组织工程尿道;在种子细胞获取方面,毛囊干细胞优于尿道黏膜干细胞。     

构建组织工程血管的支架材料和种子细胞研究进展

国内外学者已对用于构建组织工程血管的支架材料和种子细胞进行了较多的研究,以期研制出能代替自体血管用于临床的血管移植物,它应具备良好的生物相容性、适应性重塑和生长的潜能。虽然组织工程研究已开展30多年并取得一定成果,但是仍有许多问题亟待解决。如何研制出理想的支架材料和选择合适的种子细胞有待进一步研究。综述近年用于构建组织工程血管的支架材料和种子细胞的研究进展。     

腺病毒绿色荧光表达载体追踪皮肤组织工程种子细胞的转归

目的：用转基因技术标记组织工程种子细胞，探索一种追踪种子细胞转归的方法。方法：用腺病毒荧光表达载体转染人皮肤成纤维细胞，观察转染率及其荧光表达。再将细胞种植在真皮支架上，活体观察荧光标记的效果和持续时间。结果：所制备的腺病毒荧光表达载体能转染靶细胞，转染率＞95％。转染的细胞经一次传代后，尽管荧光强度降低，细胞轮廓仍清晰可见。细胞种植至真皮支架上，观察2周，可以在荧光显微镜下较清晰地观察到培养物活体上细胞的形态。结论：应用腺病毒荧光表达载体标记皮肤组织工程种子细胞以追踪细胞的转归是方便、可行的。