小鼠肝脏特异的微RNA在HeLa细胞中的转染与表达

目的观察miR-122在HeLa细胞内表达情况.方法将构建的miR-122真核表达质粒pAVU6 27-mir122以电穿孔法转染HeLa细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,通过Northern杂交和点杂交验证miR-122在HeLa细胞中的表达.结果阳性转染细胞与小鼠肝脏细胞Northern杂交及斑点杂交均出现放射自显影,而转染空质粒的HeLa细胞则无放射显影.结论 miR-122在HeLa细胞中获得正确表达.     

pHsa-m122真核表达载体的构建及其表达活性的鉴定

目的 构建肝脏特异性的微RNA-miR-122真核细胞表达载体并对其表达活性进行鉴定.方法 经PCR从人基因组DNA中扩增肝脏特异性的微RNA-miR-122的前体序列,引入酶切位点和Poly T转录终止序列,将其插入siRNA专用真核表达载体pSuper中.将构建载体进行酶切、测序鉴定,再通过共转染含miR-122靶序列的GFP表达质粒后,经荧光显微镜和流式细胞仪及Western Blot检测,鉴定载体功能性表达.结果 miR-122的前体序列成功地克隆到真核表达载体pSuper上.且可表达出具有生物活性的miR-122,将该真核表达载体命名为pHsa-m122.结论 成功构建miR-122真核表达载体pHsa-m122,有助于进一步研究miR-122在肝炎病毒复制及肝癌形成中的作用.     

IL-1β反义RNA真核表达载体的构建

目的 通过构建IL-1β反义RNA真核表达载体,为进一步研究IL-1β奠定了基础.方法 采用RT-PCR法分别获取IL-1β的两段基因序列,利用基因工程方法构建IL-1β反义RNA真核表达载体,并对其进行反复PCR鉴定、单酶切鉴定和DNA序列分析.结果 经最终DNA序列分析证实,成功构建了人IL-1β反义RNA真核表达载体.结论 本研究为IL-1β尤其是肿瘤微环境中IL-1β作用的研究提供了证据.     

小干扰RNA体外抑制HBs-GFP融合基因的表达

目的:利用增强型绿荧光蛋白(EGFP)和小发夹RNA(shRNA)表达载体技术,建立一种行之有效且相对经济的验证siRNA的方法.方法:将HBV S基因融合到EGFP中,建立HBs-GFP融合基因表达载体;同时构建带U6 27 RNA转录启动子的shRNA表达载体pAVU6 4sh357.二载体共转染HepG2细胞后,流式细胞仪检测HBs-GFP蛋白的荧光强度;同时RT-PCR和实时定量PCR法检测HBs-GFP mRNA水平的改变.结果:小干扰RNA有效抑制目的基因的表达,共转染后第72 h荧光蛋白抑制率为55.4%;HBs-GFP 融合基因的RNA表达受到显著抑制,抑制率达到90%.结论:载体法表达的小干扰RNA体外显著抑制HBs-GFP融合基因的表达.     

小鼠微小RNA miR-22真核表达载体的构建及功能初步研究

目的 从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段并克隆到pIRES2-EGFP,构建miR-22的真核表达载体.方法 利用PCR技术从基因组DNA扩增miR-22前体对应的基因组片段,克隆到质粒pUCm-T,测序正确后构建到真核表达载体pIRES2-EGFP中,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,并进行序列测定.脂质体Lipofectamin 2000法转染Hela细胞后G418筛选获得稳定转染克隆,提取总RNA,通过RT-PCR方法对neo片段进行鉴定,采用Northern blot技术检测miR-22的表达.结果 PCR扩增得到的334 bp片段与预期的miR-22前体对应的基因组片段序列一致;成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/miR-22,测序结果正确.重组质粒转染Hela细胞后,经G418筛选成功获得阳性克隆.Northern blot分析显示miR-22在Hela细胞内高效表达.结论 本实验成功克隆了miR-22的前体对应的基因组片段,构建其真核表达载体,并在Hela细胞内获得高表达,为深入研究微小RNA miR-22的功能奠定了基础.     

pEGFP—C1-miR-335重组质粒的构建及其在乳腺癌细胞中的表达

目的构建携带融合型mieroRNA（微小RNA）基因miR-335的荧光真核表达质粒pEGFP—C1-miR-335,并观察其在乳腺癌细胞MDA—MB-231中的表达。为研究小RNA基因表达调控机制建立实验基础。方法应用基因重组技术,从人类基因组DNA中扩增miR-335的前体序列,经PCR引物加入酶切位点,酶切后插入荧光真核表达载体pEGFP—C1,构建IniR9真核表达载体pEGFP—C1-miR-335,然后进行酶切和测序鉴定重组质粒的正确性。应用脂质体介导的转染技术将该质粒导入MDA—MB-231细胞,24h后观察荧光蛋白表达情况,用Northernblot方法检测miR-335表达。结果酶切和测序鉴定证实插入miR-335前体片段序列正确。细胞转染24h后,荧光显微镜下观察到GFP表达,60％左右转染细胞发出荧光。Northernblot检测到miR-335表达。结论成功构建pEGFP—C1-miR-335荧光真核表达载体,并可在乳腺癌细胞中有效表达。     

肾癌缺氧诱导因子2小干扰RNA表达载体的构建及筛选

目的:构建肾癌缺氧诱导因子2(HIF-2)小干扰RNA真核表达载体.并研究其对肾癌786-0细胞中HIF-2蛋白表达的影响.方法:根据GenBank数据库提供的HIF-2基因核苷酸序列,选择设计双链小干扰RNA,合成HIF-2 RNAi片段No 1、No 2、No 3和对照片段,将RNAi片段定向克隆于pSilencer 2.1-U6 neo真核表达载体,转化感受态菌.挑取阳性载体克隆,DNA测序进行鉴定;培养人肾癌786-0细胞,在脂质体的介导下分别将No 1、No 2、No 3和埘照片段重组载体转染人人肾癌786-0细胞,并设未转染组,Western Blot法检测各载体对肾癌786-0细胞中HIF-2蛋白表达的影响.结果:构建的HIF-2 RNAi真核表达载体经DNA测序证实与设计完全一致,转染肾癌786-0细胞24 h后,No 1组、No 2组和No 3组HIF-2蛋白表达水平降低(分别为0.05±0.00、0.11±0.01、0.15±0.01),与未转染组(0.22±0.02)和对照组(0.21±0.01)相比,差异有统计学意义(F=83.85,P<0.05);未转染和对照组相比差异无统计学意义(P>0.05).结论:成功构建人肾癌HIF-2RNAi真核细胞表达载体,并可有效干扰肾癌786-0细胞中HIF-2蛋白的表达.     

稳定转染CDK2干扰RNA真核表达载体的人脑胶质细胞瘤SHG44细胞系的建立

目的：构建CDK2的干扰RNA真核表达载体,并且稳定转染人脑胶质细胞瘤SHG44细胞来抑制CDK2的表达,为人脑胶质细胞瘤的研究提供有价值的资料。方法：1.根据siRNA设计原则和GeneBank数据库中CDK2的cDNA序列,构建CDK2干扰RNA真核表达载体PGenesil-1-CDK2,并测序鉴定。2.利用脂质体法转染CDK2的干扰RNA真核表达载体,G418筛选阳性转染细胞克隆,制备稳定转染干扰RNA真核表达载体的SHG44细胞系,用倒置荧光显微镜观察荧光蛋白表达量。结果：1.成功构建了CDK2干扰RNA真核表达载体。经鉴定证实,构建的siRNAs序列与基因库中序列完全相同,并且未发现有突变、缺失、插入等异常存在。2.获得稳定转染CDK2干扰RNA真核表达载体的SHG44细胞系,命名为PGenesil-1-CDK2-SHG44。结论：成功的建立稳定转染CDK2干扰RNA的SHG44细胞系。     

腺病毒和腺伴随病毒基因元件提高白细胞介素-6在真核细胞中的表达效率

目的:构建高效真核表达载体以提高细胞因子在真核细胞中的表达效率.方法:利用基因克隆技术构建了两个新的白细胞介素-6(IL-6)真核表达载体pAdCIIL-6和P335ciil-6.将它们瞬时转染COS-7细胞后,利用IL-6依赖株7TD1对上清中的IL-6进行检测.结果:两种新建载体分别能提高IL-6在真核细胞中的表达效率5.5和3.4倍.结论:腺病毒的病毒相关Ⅰ和ⅡRNA(virus-associated Ⅰand ⅡRNA, VAⅠand VAⅡ)和腺伴随病毒(adeno associated virus, AAV) 的倒转末端重复序列(inverted terminal repeat, ITR)能提高细胞因子在真核细胞中的表达.     

miR-610的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的:克隆微小RNA hsa-miR-610并构建其慢病毒表达载体.方法:将PCR扩增得到的miR-610前体序列和pcDNA6.2-GW/EmGFP载体经双酶切后连接产生pcDNA6.2-miR-610真核表达载体,双酶切后测序鉴定,筛选阳性克隆.通过BP反应及LR反应将pre-miR-610克隆至慢病毒目的载体pLenti6/V5-DEST,构建miR-610的慢病毒表达载体pLenti6/V5-miR-610.结果:将构建好的慢病毒表达载体导入大肠杆菌Stb13进行扩增,测序表明所构建的载体与预期的完全一致.结论:成功构建了miR-610的慢病毒表达载体pLenti6/V5-miR-610,为深入研究miR-610的生物学功能奠定了基础.     

葡萄糖苷酶Ⅰ特异性siRNA-EGFP真核表达载体的构建及表达

目的:构建葡萄糖苷酶Ⅰ(glucosidaseⅠ, GluⅠ)特异性siRNA真核表达载体。方法:根据 siRNA靶序列选取原则,设计并合成针对鼠葡萄糖苷酶ⅠcDNA的寡聚DNA,退火并连接至载体 pSilencer1.0 U6,再将 U6 启动子及下游插入片断一起切下,克隆至真核表达载体 pEGFP C1,通过限制性酶切和测序对重组表达载体进行鉴定,最后将该质粒转染至HeLa细胞,共聚焦荧光显微镜观察其表达。结果:①限制性酶切和测序结果表明成功构建了带有EGFP基因的鼠GluⅠ特异性的siRNA真核表达载体 pC 1U6glu; ②共聚焦荧光显微镜观察结果表明p C1U6glu成功转染至HeLa细胞。结论:pC 1U6glu的成功构建及表达为进一步利用 siRNA研究葡萄糖苷酶Ⅰ的功能和治疗肿瘤奠定基础。     

人组织因子RNA干扰真核表达载体的构建

目的:利用RNA干扰(RNAi技术,以人组织因子(TF)基因为靶基因,构建特异性的RNA干扰真核细胞表达载体.方法:根据GenBank提供的人TF基因的核苷酸序列,设计具有小发夹结构的2条DNA序列,经退火后成为互补双链,然后将其克隆至干扰载体pSUPER质粒中,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定,最后进行DNA测序.结果:构建成功的针对人TF基因的RNA干扰真核表达载体,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计序列完全一致.结论:成功构建了针对人TF基因的真核载体,使其可能成为肿瘤基因治疗的一种新方法.     

PYK_2小干扰RNA对成年大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响

目的以富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(PYK2)为靶基因,设计并构建短发夹状小干扰RNA表达载体,探讨PYK2小干扰RNA表达载体对心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖的影响。方法以pAVU6 27质粒为载体,以PYK2为靶基因,设计并构建短发夹状小干扰RNA表达载体,行酶切和测序鉴定。用PYK2短发夹状小干扰RNA表达载体转染体外培养的成年大鼠心脏成纤维细胞,反转录聚合酶链反应和Westernblot法检测PYK2基因和蛋白表达的改变,四唑盐比色法和3H-TdR掺入率检测转染后细胞的增殖和DNA合成情况。结果酶切鉴定和测序分析表明靶向PYK2的RNA干扰重组体构建成功;重组体转染CFs后,PYK2的mRNA和蛋白水平较空载体转染的对照组显著下降;重组体转染CFs后MTT比色A值和3H-TdR掺入率均明显低于对照组。结论PYK2小干扰RNA表达载体是抑制心脏成纤维细胞增殖和DNA合成的有效手段,有利于深入探讨PYK2在心肌纤维化发生发展中的作用。     

PYK2小干扰RNA对成年大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响

目的以富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(PYK2)为靶基因,设计并构建短发夹状小干扰RNA表达载体,探讨PYK2小干扰RNA表达载体对心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖的影响.方法以pAVU6 27质粒为载体,以PYK2为靶基因,设计并构建短发夹状小干扰RNA表达载体,行酶切和测序鉴定.用PYK2短发夹状小干扰RNA表达载体转染体外培养的成年大鼠心脏成纤维细胞,反转录聚合酶链反应和Western blot法检测PYK2基因和蛋白表达的改变,四唑盐比色法和3H-TdR掺入率检测转染后细胞的增殖和DNA合成情况.结果酶切鉴定和测序分析表明靶向PYK2的RNA干扰重组体构建成功;重组体转染CFs后,PYK2的mRNA和蛋白水平较空载体转染的对照组显著下降;重组体转染CFs后MTT比色A值和3H-TdR掺入率均明显低于对照组.结论PYK2小干扰RNA表达载体是抑制心脏成纤维细胞增殖和DNA合成的有效手段,有利于深入探讨PYK2在心肌纤维化发生发展中的作用.     

靶向survivin基因的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向survivin基因的siRNA的表达载体,研究survivin在喉癌中的作用机制。方法根据基因库上sur-vivin cDNA序列,设计合成靶基因序列,将其寡核苷酸退火后插入到Pgenesil-1表达载体中,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序。结果酶切鉴定、DNA测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变。结论成功构建了靶向survivin基因表达的siR-NA干扰质粒载体Pgenesil/survivin,为进一步运用RNA干扰技术进行survivin基因功能研究奠定了基础。     

微小RNA136过表达对结直肠癌细胞中钙结合蛋白S100A6含量及细胞增殖和凋亡的影响

目的 构建携带微小RNA136(mir136)的真核表达载体并将其转染人结直肠癌细胞,观察外源性mir136表达对人结直肠癌细胞中钙结合蛋白S100A6表达及细胞增殖活性的影响.方法 提取人肾上皮HEK293细胞基因组DNA,PCR扩增包含mir136前体序列的DNA片段并构建重组载体,采用阳离子脂质体法将重组载体转染人结直肠癌HCT116细胞.转染后48h,采用实时定量PCR法检测细胞内mir136含量变化,以蛋白质印迹法检测细胞中S100A6蛋白的表达;转染后24和48h,采用CCK 8试剂盒检测肿瘤细胞增殖活性;转染后48 h,以双染法检测细胞凋亡情况.结果 成功构建重组mir136真核表达载体并转染HCT116细胞.转染后48 h,重组载体转染组HCT116细胞内mir136相对表达量高于未转染组(P＜0.01),而S100A6蛋白的相对表达量则低于未转染组(P＜0.01).同时,重组载体转染组HCT116细胞增殖活性较未转染对照组降低(P＜0.05),而细胞凋亡则较未转染对照组增加(P＜0.01).结论 Mir136可能通过抑制S100A6基因表达而抑制结直肠癌细胞增殖活性,同时引起细胞的凋亡.     

Prohibitin基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体．方法：根据prohibitin mRNA序列,利用Ambion网上设计软件设计两条针对该基因不同靶点的shRNA干扰序列,克隆到线性化的质粒载体上,并进行酶切鉴定和测序．结果：酶切结果表明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计一致．结论：成功构建两个靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体,为下一步研究prohibitin基因在肿瘤细胞中的作用和后续的的体内外实验奠定了基础．     

人抵抗素基因全长的体外拼接及真核表达载体的构建

目的:利用合成的寡核苷酸片段,在体外拼接人抵抗素(Resistin,Retn)基因的全长,并构建其真核表达载体。方法:根据已知抵抗素基因(GenBank:AF323081),设计并合成10条寡核苷酸片段,采用降落PCR方法进行拼接,获得预期大小的PCR产物后将其克隆入pSecTag2B载体进行测序确认。结果:降落PCR法扩增的特异条带与目的基因的大小一致。克隆载体测序结果与GenBank中已知序列完全符合。结论:降落PCR成功地拼接和扩增了人抵抗素全长基因,并构建了含有该基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定了实验基础。     

大鼠β神经生长因子前体基因的克隆及其真核表达载体pEGFP-NGF的构建

目的克隆大鼠脑组织中神经生长因子(NGF)β亚基前体的全长序列，构建其真核表达载体pEGFP-NGF。方法采用RT-PCR方法扩增NGFβ亚基前体的全长序列，克隆入载体pMD18-T，转化大肠杆菌JM109，挑选白色菌落行酶切鉴定、PCR鉴定及序列分析；利用高保真Taq酶自重组质粒pMD 18-T／NGF中扩增目的基因NGF，将目的基因与真核表达载体pEGFP-N1行双酶切，T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH-5α，挑选白色菌落行酶切鉴定。结果pMD 18-T／NGF测序结果与GenBank的序列完全一致，pEGFP-NGF、行限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ酶切，可见酶切片断与插入基因长度相符。结论成功从大鼠脑组织中克隆神经生长因子(NGF)β亚基前体的全长序列，并构建其真核表达载体pEGFP-NGF，为从分子水平开展NGF转基因相关研究奠定了基础。