人乳头瘤病毒HPV16L1-E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法,从ＨＰＶ１６型野毒株质粒中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２８５５ｂｐ）基因片段,采用ＰＣＲ产物的ＴＡ克隆法,将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭＴＥａｓｙ载体,构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨⅠ、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ,Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ｐＴＡＬ１,回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段,利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产生相同粘末端的特点,产生Ｌ１Ｅ７Ｃ重组基因片段,将其克隆入质粒ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔｓｋ,构建了ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ重组克隆质粒,ＨｉｎｄⅢ、ＸｈｏⅠ酶切ｐＢＳＬ１Ｅ７Ｃ,释放Ｌ１Ｅ７Ｃ基因片段,定向重组入ｐＣＡ１４腺病毒载体,成功构建真核表达载体ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组腺病毒载体：ｐＣＡ１４Ｌ１Ｅ７Ｃ,为研制ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ重组Ａｄ５载体疫苗和ＨＰＶ１６Ｌ１Ｅ７Ｃ嵌合蛋白疫苗打下基础     

HPV16L1ORF的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的：获得足够量的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｌ１融合蛋白及含ＨＰＶ１６Ｌ１ＯＲＦ序列的基因重组体。方法：通过ＰＣＲ扩增获得ＨＰＶ１６Ｌ１基因片段，将此片段插入原核细胞表达载体ｐＧＥＭＥＸ－１，表达后进行菌体蛋白质Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ免疫印迹分析。结果：ＨＰＶ１６Ｌ１基因重组体的构建成功，克隆的目的基因片段在大肠杆菌中产生的融合表达产物在Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测中个有抗     

人乳头瘤病毒HPV16L1—E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法,从ＨＰＶ１６型野毒株质业中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９－７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２－８５５ｂｐ）基因片段,采用ＰＣＲ产物的Ｔ－Ａ克隆法,将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ载体,构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨ１、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ,Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ＰＴＡＬ１,回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段,利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产竽相同粘末端的特点,     

HPV16L1重组蛋白在甲醇营养型酵母菌中的诱导表达及鉴定

目的 ＨＰＶ１６Ｌ１重组蛋白的表达为研制ＨＰＶ１６Ｌ１预防性蛋白疫苗及诊断试剂盒打下基础。方法 ｐＰＬＣ３．５－ＨＰＶ;１６Ｌ１／ＧＳ１１５阳笥菌株,经０．５％甲醇诱导,运用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测Ｌ１蛋白;用鼠抗ＨＰＶ１６Ｌ１单克隆抗体,经Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测蛋白的特异笥;在透射电下观察类病毒颗粒（ＶＬＰｓ）结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测结果表明,在５５ＫＤ处有诱导蛋白带的出现;经Ｗ     

DIG—DNA探针检测宫颈癌组织中HPV—16的E7转化基因

应用地高辛配基（Ｄｉｇ－１１－ｄＵＴＰ标记人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ－１６）Ｅ７转化基因作探针，分别检测了宫颈癌活检组织、宫颈炎及正常宫颈脱落细胞ＮＤＡ。其检率为：宫颈癌中４２．１％（２４／５７）、宫颈为中２．５％（１／３９）、正常宫颈中５．５％（１／１８）。宫颈组织中ＨＰＶ－１６Ｅ７转化基因的检出率较高，提示该转化基因与宫颈癌的发生可能密切相关。本研究也证实ＤＩＧ配基标记的Ｅ７基因探针具有特异、     

中国山东地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16E6E7基因 …

目的 分析中国山东地区宫颈癌患者ＨＰＶ１６型Ｅ６Ｅ７基因结构特点。方法 从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取ＤＮＡ,经ＨＰＶ多重引物ＰＣＲ法鉴定标准中感染ＨＰＶ型别,选感染ＨＰＶ１６型的标本ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增,获得ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因,将其重组入ｐＡＬＴＥＲ－１载体,进行双向测序、分析。结果 构建了含中国山东地区宫颈癌患者组织中ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７的重组质粒,命名为ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７－ＳＤ。     

HPV16E7基因克隆及其特异性鉴定

根据已报导的ＨＰＶ１６Ｅ７基因序列，设计了两个寡核苷酸引物，在引物的５’端分别引入了ＥｃｏＲＩ和Ｈｉｎｄ Ⅲ酶切位点，采用多聚酶链反应（ＰＣＲ）扩增了ＨＰＶ１６Ｅ７基因片段。通过ＥｃｏＲＩ和Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切位点与ｐＵＣ１８载体连接，重组质粒转化宿主菌ＪＭ１０９，在含Ｘ－ｇａｌ、ＩＰＴＧ的平板上直接筛选，斑点杂交，ＰＣＲ扩增鉴定和酶切分析证明得到了含ＨＰＶ１６Ｅ７完整的编码序列的重组克隆。     

宫颈癌组织中HPV16E6的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：进行人乳头瘤病毒１６型相关肿瘤的Ｅ６血清学研究。方法：采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）从宫颈癌组织ＤＮＡ中扩增出ＨＰＶ１６Ｅ６基因片段,克隆至测序质粒ｐＧＥＭ－Ｔ中,并用限制性内切酶将ＨＰＶ１６Ｅ６基因切下,克隆至表达质粒ｐＧＥＭＥＸ－１中,经ＩＰＴＧ诱导表达为融合蛋白,分子量约４５ＫＤ。结果：融合蛋白占菌体总蛋白的２５％,免疫印迹检测表明ＨＰＶ１６Ｅ６融合蛋白能被抗ＨＰＶ１６Ｅ６抗体识别。结论：     

pEGFP-HPV16E6/E7表达载体的构建及转染角朊细胞的瞬时表达

目的：构建ｐＥＧＦＰ－ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７表达载体,观察其在角朊细胞中的瞬时。方法：基因重组技术,基因转染技术。结论 ｐＥＧＦＰ－ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７表达载体便于观察,转染细胞中ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７－ＧＦＰ融合蛋白的表达民政部及蛋白定位,适用于对ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７分子生物学特性及致瘤机理的研究。     

人乳头瘤病毒16型(湖北株)E7基因在体内和体外的表达

构建人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７湖北株（ＨＢ）基因真核表达质粒,探讨其在哺乳动物体外,体内表达状况,为本地区ＨＰＶ相关肿瘤的基因治疗提供依据。方法采用分子克隆技术,构建ＨＰＶ１６Ｅ７－ＨＢ重组表达质粒,磷酸钙－ＤＮＡ沉淀技术及基因免疫技术将外源目的基因（ＨＰＶ１６Ｅ７－ＨＢ）导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞及大、小鼠体内ＰＣＲ,ＲＴ－ＰＣＲ,免疫荧光染色技术对外源目的基因及其产物（ｍＲ－ＮＡ,蛋白质。