人羊膜来源间质干细胞的分离、培养及鉴定

目的:探讨来源于人羊膜间质干细胞(amniotic-derived mesenchymal stem cells,AD-MSCs)的分离、培养及鉴定.方法:无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的羊膜剪成碎片,加入胰酶37℃消化30 min,共2次,然后加入终浓度1.0 g/L的胶原酶和0.1g/L的DNA酶,37℃消化60 min,收集细胞,用含体积分数为10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基进行培养和纯化.倒置显微镜观察细胞形态,取4～6代的细胞用流式细胞仪分析细胞表面标志,取扩增第3代后的AD-MSCs加入全反式维甲酸(RTRA)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)向神经元样细胞诱导分化.结果:来源于羊膜的细胞种植于DMEM/F12培养基中后,可在体外大量扩增并纯化;流式细胞检测显示:CD29、CD44、HLA-ABC阳性表达,CD34、CD45、HLA-DR阴性表达.免疫细胞化学显示AD-MSCs经RTRA和bFGF诱导后表达神经元特异性烯醇化酶,不表达胶质纤维性蛋白.结论:羊膜中存在间质干细胞,其可以在体外培养、扩增、纯化,并可在体外向神经元样细胞分化.     

大鼠肾小球系膜细胞体外培养及鉴定的实验研究

目的:探索一种重复性好、传代次数多的大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)体外培养和鉴定的方法.方法:麻醉状态、无菌条件下取得大鼠的肾脏,用3种不同目数的不锈钢筛网提取肾小球,搜集到的肾小球分别加入2.5 g/L、0.5异/LⅣ型胶原酶及2 g/L Ⅱ型胶原酶各5 mL,分别在37 ℃水浴箱中振荡消化20 min、30 min、25min,然后接种肾小球,比较不同培养条件下肾小球系膜细胞的生长状况.结果:Ⅱ型、Ⅳ型胶原酶3种不同浓度作用不同的消化时间,细胞的生长速度及生长状况不同,Ⅳ型胶原酶(2.5 g/L)消化20 min的为最佳.结论:培养的细胞为肾小球系膜细胞,用Ⅳ型胶原酶(2.5 g/L)消化20 min的肾小球系膜细胞生长状态最佳.     

用荧光钙指示剂喹2测定人血小板胞浆游离钙浓度的方法

我们采用荧光钙指示剂喹2,建立了测定人血小板胞浆游离钙浓度的方法,简报如下。 导入喹2的血小板悬液(QPS)的制备:将富含血小板血浆与10 μmol/L 喹2/AM混匀,置22℃水浴20 min,加入1μmol/L PGE_1,室温下430×g 离心 15 min,弃上层液。用1ml含1 μmol/L PGE_1和10μmol/L EGTA的HEPES无钙台氏缓冲液(HTB)使血小板悬浮并移至10ml体积已用HTB(含10 μmol/L EGTA)50ml平衡过的2％琼脂糖胶柱上,用相同缓冲液洗脱。过柱后将血小板悬液调至1×10~8血小板/ml和Ca~(2+)浓度至1 mmol/L,置22℃备用。对照血小板悬液(CPS)的制备:用等体积     

雷公藤药物血清体外对肾小球系膜细胞增殖及其分泌IL-6的影响

1 材料和方法雷公藤经水浸30 min后,水提3次,30 min/次,水煎浓缩后含生药6.1 g/L. SD大鼠6只(中国药科大学动物房),雌雄不限,体质量200～250 g. 分为雷公藤组和对照组,每日6 mL/kg灌胃,7 d,于最后1次灌胃后2 h内静脉取血,离心取血清,56℃灭活,过滤除菌. MTT(Sigma),溶于PBS,浓度5 g/L,过滤除菌,4℃避光保存.     

冷凝集对XS-4000i自动血细胞分析仪的影响及处理

目的 探讨冷凝集对XS-4000i自动血细胞分析仪检查结果的影响及处理方法.方法 同一冷凝集标本分别采用手握标本10 min,手握20 min,37℃水浴标本30 min,血浆置换和置换血浆加手握10 min,进行血常规检测,比较五种方法的效果差异.结果 手握10 min、手握20 min和置换血浆加手握10 min均获得满意的血常规检测结果,MCHC值由540 g/L降至361~376 g/L,血浆置换和37℃水浴标本30 min效果较差,MCHC降至426~455 g/L.结论 手握10 min、手握20 min和置换血浆加手握均可以用于冷凝集标本血常规检测的前处理.     

HPV51DNA的HaeⅡ、AluI酶切片段的核苷酸顺序分析

<正> 我们将HPV51DNA用HaeⅢ、A1u I同时消化,然后在agarose上电泳,将电泳片段回收,将其与MP-18噬菌体连接。然后转染XL1 blue菌。在含I PTG及X-gel的上层agarose中,连接有HPV51片段的MP-18出现白色噬菌斑,反之,出现蓝色噬菌斑。挑取单个白色噬菌斑种入3mL YT培养基中,同时加入已培养4h的新鲜XL1blue细菌10μL,37℃振荡培养过夜,离心。上清中含带有HPV 51片段的单链MP-18。取1mL上清,加入300μL20％PEG,30μL5mol/L NaCl,6μLO。5mol/LEDTA(pH8.0),5μLRNase(10mg/mL),混匀后,置冰浴30min,离心。沉淀溶于100μL TE(pH8.0),加3μL20％SDS,3μL蛋白酶K(5mg/mL),混匀,     

共聚焦显微镜监测小鼠腹腔巨噬细胞膜电位

1 材料和方法 处死小鼠,腹腔内注射 5 mL 冷 Hanks 液,轻揉腹部,抽吸细胞悬液约 4 mL。细胞洗两次后,加含 10％ 小牛血清的 RPMI 1640 培养基 10 mL,接种于 96 孔板中, 每孔 01 mL,37℃ 静置 60 min,使巨噬细胞贴壁。用无血清培养液冲洗培养孔三次,去除未贴壁细胞,剩下贴壁的巨噬细胞。加入 01 mL 5 μmol/L 的 DBAC4(3)（美国分子探针公司产品,用无水乙醇溶解,用无血清培养液稀释）,室温温育 10 min。将 96 孔板置于共聚焦显微镜（美国 Meridian 公司 Ultima 型）的载物台上,调整到最佳扫描参数后开始动态扫描。在扫…     

大量提取质粒的简便方法

0　引言　质粒提取是分子生物学实验室一项最基本的工作 .我们介绍一种非常简便的大量提取质粒方法 ,此法提取的质粒可直接用于酶切鉴定、转化、探针标记等 .菌种为转化了重组 p U C19质粒的 DH5α E.coli.重组 p UC19质粒为在 H inc II位点插入不同的 PCR产物连接而成 .1　方法　挑一个单菌落接种于 5 m L L B/ Amp(含氨苄青霉素0 .1g· L-1 )培养液中 ,37℃振荡过夜 (A=0 .6 ) ,转 1m L菌液于 10 0 m L L B/ Amp培养液中 ,37℃振荡过夜 (A=0 .6 ) ,将菌液倒入两个 5 0 m L离心管 ,10 0 0 0 g离心 2 min,弃去上清 ,沉淀中加入 4…     

热休克蛋白70在人肝癌细胞SMMC-7721中的表达

1　材料和方法1.1　材料　人肝癌细胞 SMMC- 772 1由本室保存 ;鼠抗人HSP70单抗、FITC标记的羊抗鼠 Ig G购自 BOSTER公司 ;ENVISION HRP标记的羊抗鼠 Ig G(即用型 )为 DAKO公司产品 .1.2　方法　 1细胞的热休克处理 :接种 2× 10 4SMMC- 772 1于置有盖玻片的 2 4孔培养板中 ,37℃培养过夜 ;将培养板置42℃水浴 2 h,分别于休克后 4,8,12 ,16 ,2 4和 48h,收集细胞爬片 ,以甲醇∶丙酮 (V/ V=1/ 1) 4℃固定 15 min,PBS(p H7.4)洗涤后 ,室温干燥备用 .2免疫组化法检测 HSP70在肝癌细胞的表达 :采用 ENVISION(两步法 ) .细…     

影响大肠杆菌电转化效率因素的探讨

目的 探讨影响大肠杆菌DH5 a电转化效率的几个关键但易被忽略的因素.方法 于室温(25℃)用空气浴振荡和水浴振荡培养大肠杆菌DH5 a,用10%(V/V)甘油-水溶液和10%(V/V)甘油-生理盐水溶液冻存所制感受态细胞.在电压2.5kv、电阻200Ω、电容25μF的条件下进行电转化,电击冰浴(0～10min)后测定转化效率.结果 于25℃水浴振荡培养细菌、10%甘油-生理盐水溶液冻存感受态细胞、电转化后冰浴6min,转化效率高速1.01×1010CFU/μg DNA.结论 该法适合于大肠杆菌DH5 a,可获得较高的转化效率.