IL-2/pUC19重组质粒的构建

目的：构建IL－2／pU19重组质粒。方法：从PHA刺激的Jurkat细胞中提取mRNA，经RT－PCR法获取IL－2基因；将克隆质粒pUC19和IL－2基因行BamHI和EcoRI双酶切、低熔点胶纯化、连接酶切产物、转化DH5a感受态细菌、筛选菌落和测序鉴定。结果：电泳获得预期的IL－2条带，测序证实为正确的IL－2序列。结论：应用克隆质粒pUC19可方便高效地构建IL－2／pUC19重组质粒。     

旋毛虫相对分子质量53 000抗原蛋白基因克隆载体的构建

目的:构建编码旋毛虫相对分子质量53 000 抗原蛋白基因(Ts53)的克隆载体并进行序列分析.方法:应用RT-PCR方法从河南省猪源旋毛虫肌幼虫总RNA中扩增目的基因Ts53,将PCR产物克隆入pUC18载体中构建重组质粒pUC18-Ts53,进行测序及同源性分析.结果:克隆了旋毛虫肌幼虫的Ts53基因,所获基因的核苷酸序列与GenBank所登录的旋毛虫Ts53蛋白基因序列的同源性为99.06%.应用Kyte-Doolittle方法进行氨基酸的亲水性分析表明,53 000蛋白抗原性最强的部位可能位于220～230氨基酸残基处.结论:成功构建了旋毛虫相对分子质量53 000蛋白抗原基因的克隆载体pUC18-Ts53,为Ts53基因的表达奠定了基础.     

胃癌高表达基因erk的PCR扩增,克隆和鉴定

对在胃癌高表达的EPH家族基因erk胞外的配体结合区基因扩增及克隆．方法：从胃癌患者手术切除标本中提取RNA，反转录为cDNA，以计算机辅助分析设计并合成引物进行RT－PCR，并将扩增片段克隆入pUC19质粒，用酶切及PCR方法筛选鉴定阳性克隆．结果：RT－PCR扩增片段与设计相符，且特异性好，无非特异产物出现，表明所设计引物符合要求．酶切及巢式PCR、PCR－RFLP方法证明克隆片段正确插入pUC19的HindIII和BamHI位点，并将重组克隆命名为pGE42．结论；克隆的完成为进一步研究该基因在胃癌的发生中的作用，寻找其胞外配体及进行表达产物的细胞定位等工作打下基础．     

恶性疟原虫海南株线粒体复合体Ⅱ辅基铁-硫蛋白基因克隆及序列分析

目的：构建恶性疟原虫海南株线粒体复合体Ⅱ琥珀酸-泛醌还原酶辅基铁-硫蛋白(iron-sulfur protein,Ip)基因原核表达质粒pET28α-Ip，测定Ip基因序列，为研究铁-硫蛋白基因功能奠定基础。方法：采用PCR技术从恶性疟原虫海南株基因组DNA中扩增出Ip基因，扩增产物经纯化后，用BamHI XhoI双酶切，定向克隆入pET28α质粒，转化大肠杆菌DH5α，再用BamHI XhoI酶切及PCR扩增对重组子进行鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定，并进行同源性比较。结果：筛选出编码海南株Ip基因的原核表达质粒pET28α-Ip，海南株Ip基因序列与K1、3D7株高度同源。结论：pET28α-Ip重组质粒的构建，为进一步研究铁-硫蛋白基因奠定基础。     

EBV-LMP1 cDNA的克隆测序与原核表达质粒构建

目的：克隆EBV－LMP1 cDNA，构建EBV－LMP1基因的原核表达重组质粒。方法：通过RT－PCR技术从B95－8细胞中扩增EBV－LMP1 cDNA，克隆至pGEM-T easy载体上并测序；利用引物上的BamH I与HindⅢ酶切位点将LMP1基因插入载体pET-32a，转化JM109菌。提取质粒，限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果：扩增的LMP1 cDNA长度为1158bp，测序结果与已知序列吻合，重组原核表达质粒经酶切鉴定表明获得正确重组子。结论：成功克隆了EBV－LMP1 cDNA，并构建了pET-32a-LMP1原核表达载体，为研究LMP1在EBV致瘤中的作用及肿瘤疫苗奠定了基础。     

淋球菌主要外膜蛋白PIA原核重组质粒的构建及序列分析

目的：构建携带淋球菌主要外膜蛋白PIA基因的pET重组质粒，分析其编码序列。方法：根据PIA已知序列设计——对引物，用PCR技术从淋球菌捷克标准株中扩增PIA；将目的基因PCR产物和质粒pET28a( )同时用BamHI和Hind Ⅲ限制性内切酶进行双酶切，纯化回收后将其连接并将重组质粒转化大肠杆菌DH5α。将构建的重组质粒pET28a( )-PIA通过PCR、质粒双酶切、DNA测序证实获得正确的重组克隆。结果：成功构建PIA基因原核重组质粒pET28a( )-PIA。序列分析表明，其携带的PIA基因序列与GenBank中公布的淋球菌(AF090818)的PIA序列具有很高的同源性，其同源性达到99．9％。结论：成功构建携带淋球菌主要外膜蛋白PIA基因重组表达载体，有助于更深入地分析其基因功能，为后期淋球菌的临床检测和基因疫苗研制打下基础。     

丙型肝炎病毒Ns_3基因区部分序列的PCR克隆和鉴定

选取HCV－1、HCV－J、HCV－BK、台湾株HCV、中国河北株HCV序列的同源性部分，设计Ns3区部分序列的PCR引物．应用RT－PCR技术，从丙型肝炎患者血浆中扩增一长为448bp的cDNA片段作为目的基因，与经过限制性酶切的pUcI9载体连接，构建重组质粒pUHCV－Ns3．分别或混合应用HCV序列特异的引物和载作序列特异的通用引物，以PCR扩增重组质粒，结果扩增产物的分子量均与预期大小一致．限制性酶切位点分析结果也证实，克隆的基因是HCV的Ns3区部分序列的目的基因．克隆序列的特异性和插入方向同时得到了鉴定．     

庚型肝炎病毒C26抗原基因的cDNA序列研究

目的：确定我国庚型肝炎病毒（河北株）C26抗原基因的cDNA序列。方法：采用RT－PCR方法从人血清中扩增出庚型肝炎病毒C26抗原的cDNA产物，使之与T－载体连接构建成克隆重组质粒。用PCR和限制性内切酶切割方法鉴定出阳性重组质粒，然后扩增并抽提质粒进行DNA序列测定。结果：获得的庚型肝炎病毒C26抗原基因的cDNA核苷酸序与国外已报道的庚型炎病毒44402，庚型肝炎病毒45966、庚型肝炎病毒36380的相应区域进行比较，核苷酸同源性在84％以上，氨基酸同源性在90％以上，结论：庚型肝炎病毒中国河北株的C26cDNA序列在遗传上是比较保守的。     

TCR Vβ8/pcDNA3.1重组质粒的构建

目的：构建重组质粒TCRVβ8／pcDNA3．1。方法：从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取mRNA，经RT－PCR法获取TCRVβ基因；将表达质粒pcDNA3．1和TCRβ基因行BamHI和HindⅢ双酶切、低熔点胶纯化、连接酶切产物、转化DH5a感受态细菌、筛选菌落和测序鉴定。结果：电泳获得523bp的TCRVβ8预期条带，测序证实为正确的TCRVβ目的基因序列。结论：测是构建TCRVβ8／pcDNA3．1重组质粒的重要步骤。     

旋毛虫Ts43基因克隆和序列分析

目的：构建编码旋毛虫相对分子质量43000蛋白基因(Ts43)的原核表达载体，并对其序列进行分析。方法：应用RT—PCR方法从河南省南阳猪源旋毛虫获得旋毛虫基因Ts43，克隆人pGEMEX-1载体中构建重组质粒pGEMEX—Ts43，进行测序、同源性比较及抗原性预测分析。结果：所获基因的核苷酸序列与GenBank所登录的旋毛虫Ts43蛋白基因序列的同源性为99％。抗原性预测分析结果显示，河南省南阳猪源旋毛虫相对分子质量43000的蛋白分子上存在有4个明显抗原活性的结构域，分别位于距翻译起点第26～28、101～105、185～193、275～295个氨基酸残基的肽链上。结论：成功构建了旋毛虫相对分子质量43000蛋白抗原基因的原核表达载体。     

旋毛虫排泄-分泌抗原重组的研究

获取旋毛虫肌幼虫排泄分泌（ＥＳ）抗原的部分结构基因并进行了克隆、鉴定和表达。首先采用ＲＴＰＣＲ技术从旋毛虫肌幼虫总ＲＮＡ中获取目的基因，经酶切分析后与融合表达载体ｐＥＸ３１Ｃ、ｐＥＸ３１Ｂ及非融合表达载体ｐＢＶ２２０连接，并将其转入大肠杆菌进行表达。结果：重组质粒在大肠杆菌中表达出相应的相对分子质量的重组蛋白，经纯化后的重组蛋白可与旋毛虫病猪阳性血清发生反应。提示：重组抗原可作为ＥＳ抗原的候选替代抗原     

旋毛虫不同地理株冷冻耐力的观察

目的观察旋毛虫不同地理株的冷冻耐力。方法将75只雄性昆明小鼠随机分为3组（每组25只）,每组分别感染-18℃保存不同时间的旋毛虫河南株、云南株及乡土旋毛虫,每只小鼠经口接种300条肌幼虫。感染后42d剖杀,将全身骨骼肌消化后收集肌幼虫,测定其生殖力指数（Reproductivecapacityindex,RCI）。结果旋毛虫河南株-18℃保存0、6、12h后的RCl分别为91．4、0．03及0（X2=26．453,P〈0．05）,云南株-18℃保存0、6、12、24h后的RCl分别为235．6、0．04、0．01及0（x≮21．115,P〈0．05）;乡土旋毛虫-18℃保存0、6、12、24、48h后的RCl分别为34．6、26．8、21．9、10．8及7．4（F=8．505,P〈0．05）。结论旋毛虫河南株与云南株对低温的抵抗力较低,-18℃分别保存12、24h感染性已完全丧失;乡土旋毛虫对低温抵抗力较强,一18℃保存48h仍有较强的感染性。     

广西南丹县旋毛虫COX1基因和5S rRNA基因分析

目的分析广西壮族自治区南丹县旋毛虫（Trichinella spiralis）COX1和5SrRNA基因特点,阐述该分离株的系统发生关系及基因变异规律。方法PCR扩增南丹旋毛虫分离株COX1和5SrRNA基因片段并对扩增产物进行测序;应用Blast和ClustalX软件计算其碱基组成,分析该分离株与GenBank中相应序列的同源性及遗传距离,同时应用UPGMA方法分析聚类关系。结果扩增后COX1基因片段长419bp,5SrRNA基因片段长695bp。南丹旋毛虫分离株与Trichinella spiralis（T.spiralis）的同源性最高,分别为99.0%和99.1%,遗传距离最小,分别为0.005和0.014。采用UPGMA法构建的2个系统发生树,南丹分离株和T.spiralis具有高度同源性,位于同一分枝,与无囊包旋毛虫（T.papuae和T.zimbabwensis）分枝较远,后者独成一枝,与T.spiralis相比,2个基因均存在变异,且变异位点均为4个,分别占相应基因序列的1.19%和0.57%。2个基因均富含A和T碱基,A＋T含量分别占相应基因的61.8%和66.4%。COX1变异存在转换和颠换,但均发生在密码子第三位点。5SrRNA基因变异位点分散,但变异均为转换,无颠换。结论南丹旋毛虫分离株与T.spiralis具有高度的亲缘关系,其COX1和5SrRNA基因的碱基组成、变异位点及变异类型均具有偏好现象。     

A型流感病毒核蛋白原核表达载体的构建与表达

目的:构建A型流感病毒核蛋白(NP)的原核表达质粒,分析其在大肠杆菌中的表达状况.方法:采用逆转录聚合酶链式反应技术从A型流感病毒基因组中扩增出编码核蛋白的基因片段,克隆至pGEM-T Easy载体,PCR筛选阳性克隆并测序.经酶切后将目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL2(CDE3),PCR和酶切鉴定转化菌落.将阳性菌落经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析目的蛋白的表达.结果:RT-PCR扩增出NP基因序列,将其亚克隆至表达载体pGEX-4T-1构建成重组表达质粒,并在BL2(CDE3)中表达了NP融合蛋白.结论:成功构建A型流感病毒NP的重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达了NP融合蛋白.     

A型流感病毒株核蛋白基因的克隆与重组质粒的构建

目的克隆A型流感病毒株Swine/Henan/703/2001(H3N2)的核蛋白(NP)基因序列并构建重组质粒。方法采用逆转录聚合酶链式反应技术从病毒株基因组中扩增出编码核蛋白的基因序列,克隆至pGEM-TEasy载体,经蓝白筛选、菌落PCR及酶切鉴定挑取阳性克隆并测序。结果利用RT-PCR扩增到目的基因片段,并将其克隆至T载体。结论成功构建重组质粒pGEM-TEasy-NP,为NP相关功能及流感疫苗的进一步研究奠定实验基础。     

HPV16 E5蛋白原核表达、鉴定及真核表达稳定株的筛选

目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制，对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPVl6感染患者子宫颈细胞DNA为模板，采用PCR方法扩增HPV16 E5基因，经BamHⅠ和HindIⅡ双酶切后插入相同酶切的pET32a（＋）载体，转染JMl09感受态细胞，并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达，SDS-PAGE和Wlescem blotting检测目标蛋白表达情况。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET32（＋），E5质粒后取得的E5全基因片段转入pcDNA3．1（＋）空质粒，构建pcDNA3．1（＋）m5真核表达质粒并对NIH3T3细胞进行转染，最后用G418进行稳定表达株的筛选，并采用RT．PCR鉴定细胞内HPV16 E5基因表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32/E5，在1mmol／LPTG、28℃诱导条件下BL21（DE3）菌体中HPVl6E5．TRX融合蛋白占菌体总蛋白的10％左右。真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／E5在成功转染NIH3T3细胞后于250μg/mlG418浓度时筛选21d得到了E5基因稳定表达株，RT-PCR产物测序得到了HPV16 E5基因全序列。结论成功构建了pET32／E5原核和pcDNA3．1（＋）／E5真核表达质粒，HPV16 E5蛋白在大肠杆菌和NIH3T3细胞中的稳定表达．这些结果为进一步深入研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础。     

人全长PLCr 1基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人全长PLCr1基因真核表达载体，以便进一步研究PLCr1的作用及其机制。方法自行设计一对带有日砌Ⅲ和Not Ⅰ酶切位点的引物，采用RT-PCR技术从MG63细胞中扩增人全长PLCr1 cDNA(3878bp)，纯化后，经HindⅢ-NotⅠ酶切，插入真核表达载体pLNCX2中，构建重组质粒pLNCX2／PLCr1。通过PCR，限制性酶切分析及DNA直接测序对所构建的重组质粒进行鉴定。同时经瞬时转染后，利用RT-PCR及Western blotting转染后LoVo细胞中PLCr1的表达。结果RT-PCR产物经琼脂糖电泳分析所得片段大小与预期相符(3878bp)。重组质粒经日HindⅢ-NotⅠ酶切后，得到3878bp(PLCr1基因)及6100bp(载体pLNCX2)两个片段，同时重组质粒经HindⅢ-BglⅡ酶切后．得到约1300bp及约8500bp两个片段，与预期一致。DNA测序也证实了重组质粒的正确。经RT-PCR和Westem blot分析证实转染pLNCX2／PLCr1的LoVo细胞中PLCr1的表达均高于转染空质粒pLNCX2的LoVo细胞及未转染的LoVo细胞。结论成功构建了人全长PLCr1基因真核表达载体pLNCX2／PLCr1，为进一步研究PLCr1的作用奠定了基础。     

人canstatin基因克隆及其重组蛋白表达

目的克隆人血管能抑素canstatin基因,重组表达canstatin蛋白.方法从人胎盘组织中提取总RNA做模板,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增canstatin cDNA,转入克隆载体pUCm-T,再转化E.coli DH5α,挑选阳性克隆,测定基因序列.酶切克隆载体目的基因,插入表达载体pET-22b( ),转化E.coli BL21,诱导表达重组蛋白.结果RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实与目的基因长度一致.RT-PCR产物与pUCm-T的连接产物转化E.coli DH 5α,篮白斑筛选后,选6个白色菌落做酶切鉴定,证实其中1个为阳性克隆,测序结果与GenBank公布的canstatin基因序列完全一致.将pUCm-T上目的基因片段酶切后插入pET-22b( ),转化E.coli BL21,挑选7个菌落做酶切鉴定,证实均为阳性克隆.IPTG诱导其中1个克隆表达重组蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明在相对分子质量24 000左右出现新的蛋白条带.结论成功克隆出canstatin基因,重组表达出canstatin蛋白,为进一步研究其临床应用打下基础.