人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的：探讨人脐带华通胶间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及冻存、复苏的方法。方法收集健康足月新生儿脐带组织,采用组织块贴壁法分离、培养脐带间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面抗原,将细胞冻存3个月后复苏,鉴定复苏后细胞的特性。结果组织块贴壁法获得脐带间充质干细胞成功率高;细胞表面高表达CD29、CD44、CD90和CD105,不表达造血干细胞表型CD34、CD45等;冻存后再复苏细胞活性高达80％～90％。结论组织块贴壁法可以从人脐带华通胶中较好的分离、培养出间充质干细胞,为干细胞移植实验研究和临床治疗提供了理想的细胞来源。     

人脐带间充质干细胞原代培养方法的改良

目的: 探讨体外组织块培养原代人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)的改良方法,并观察其形态,免疫表型,成脂成骨分化等生物学特性。方法: 从健康足月儿获得脐带,将血管剥离后,余下的结缔组织剪成小块,分别用传统植块法和改良植块法分离培养原代hUC MSCs。MTT法检测细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞免疫表型,成脂成骨诱导分化检测其分化潜能,化学染色鉴定诱导分化结果。结果： 改良植块法脐带组织贴壁培养3～4 d即可从组织块边缘长出长梭形成纤维样原代细胞,5～6 d后细胞可长满80%,比传统植块法原代细胞培养周期缩短了一半以上时间,细胞传代后流水状或漩涡状生长,MTT法显示细胞增殖能力强,流式细胞仪检测提示CD90, CD105,CD73,CD166,CD29,CD44均阳性表达,阳性率均在95%以上,CD45和HLA-DR均阴性表达,阳性率低于2%;诱导分化实验及化学染色结果证实, 该细胞具有成脂和成骨多向分化潜能。结论：应用与酶消化法相结合的改良植块法可以获得hUC-MSCs,比传统植块法缩短了原代培养周期,提高了细胞培养效率,所获得细胞贴壁生长,增殖能力强,表达间充质干细胞相关免疫表型,具有多向分化潜能,可在科研和临床应用中作为种子细胞来源。     

人脐带间充质干细胞的分离、培养及其肝细胞生物学特性分析

目的：分离、培养人脐带基质来源的间充质干细胞（hUC-MSCs）,观察其部分肝细胞生物学特性。方法：利用组织块贴壁培养法从脐带基质中分离培养hUC-MSCs,观察细胞形态,采用细胞免疫荧光法检测表面标记物CD44,通过RT-PCR法检测肝细胞标志基因ALB、CK18、G6P、GLUL、MET、TAT的表达情况,并进行PAS糖原染色。结果：从脐带基质分离出成纤维样细胞形态的hUC-MSCs,CD44表达阳性;RT-PCR结果表明培养的hUC-MSCs表达成熟肝细胞的标志基因ALB、CK18、G6P、GLUL和MET,而不表达TAT,PAS糖原染色呈阳性反应。结论：组织块贴壁培养法可有效获得稳定、均质性良好的hUC-MSCs,其具备部分肝细胞生物学特性。     

人脐带间质干细胞分离纯化及基本生物学特性研究

目的探讨人脐带间质干细胞（MSC）的分离、纯化、扩增方法,研究其基本生物学特性.方法无菌条件下收集剖宫产新生儿脐带,分别用组织块贴壁法和酶消化法获取脐带间质干细胞,进行原代培养.应用DMEM/F12培养液进行纯化和扩增培养.用流式细胞仪检测MSC的细胞表面标志.绘制细胞生长曲线并测定细胞周期.结果两种分离方法均可获得MSC,原代培养12～14 d后可达90%融合,细胞可传代20代以上.流式细胞仪检测结果显示,脐带MSC强表达CD13、CD29、CD44、CD105,弱表达CD106,不表达CD34、CD11a、CD14、CD31、CD45.结论脐带MSC在体外有较强的增殖能力,可作为组织工程的种子细胞.     

人脐带间充质干细胞体外培养的生物学特性研究

目的建立人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)体外培养的方法,探讨该方法培养的脐带间充质干细胞特性及分化潜能。方法用新取的脐带制成细胞悬液,放入含10%胎牛血清的DMEM/F-12混合培养基培养,动态观察原代培养细胞的生长过程。取生长状态良好的第三代细胞(P3),MTT检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测表面标志物CD29、CD44、CD31、CD45、CD34,鉴定hUC-MSCs;诱导hUC-MSCs分化成为脂肪细胞,鉴定所分离的hUC-MSCs具有多向分化能力。结果来源于人脐带培养的MSCs呈现梭形生长,经流式细胞仪检测示CD29(98.3%)、CD44(99.2%)阳性,CD34(0.3%)、CD31(0.8%)、CD45(0.4%)阴性,经过诱导分化,证实hUC-MSCs有成脂分化潜能。结论采自脐带标本分离培养可获得稳定、均质性良好的hMSCs,并具有多向分化能力。     

人脐带间充质干细胞分离扩增方法的优化

【目的】 探究一种高效稳定分离、扩增人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）的方法。【方法】取材脐带20条,获得Wharton’s Jelly组织,分别用酶联合消化法（12例）和酶序贯消化法（8例）来分离、提取hUC-MSCs,比较两种方法分离hUC-MSCs的成功率、原代培养时间及获得的细胞数量;利用低糖DMEM（LG-DMEM）完全培养基和LD-Mesen培养基（MesenPro RSTM与LG-DMEM的混合培养基）分别培养hUC-MSCs,比较两种培养体系的扩增效率。对所获取细胞的免疫表型以流式细胞术进行鉴定,并诱导成脂、成骨分化验证其多向分化潜能。【结果】 酶联合消化法和酶序贯消化法成功率分别为100%（12/12）和12.5%（1/8）,二者相比有显著统计学差异（P=1.03×10-4）,前者原代培养平均时间为（14.17±1.14）d,获得细胞（1.30±0.14）×106个。2×105个hUC-MSCs用LD-Mesen和LG-DMEM两种体系培养12d后,扩增所得的细胞数分别为(14.86±0.08)×106和(5.08±0.08)×106,二者有显著统计学差异（P=1.38×10-8)。hUC-MSCs高表达CD73、CD105、CD90、CD29、CD44,不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR;并可向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化。【结论】 酶联合消化Wharton’s Jelly组织并以LD-Mesen体系进行扩增可高效获取hUC-MSCs,效率明显优于传统方法。     

食蟹猴脐带间充质干细胞的分离与鉴定

目的建立食蟹猴脐带间充质干细胞的分离培养方法。方法新鲜食蟹猴脐带剪碎为糊状,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养,观察细胞形态特征,流式细胞技术分析细胞抗原标志的表达,并检测其体外多向分化潜能。结果运用组织贴块法可以从新鲜脐带中分离到贴壁生长、阳性表达CD29、CD44、CD90的成纤维细胞样细胞。这些细胞在体外诱导培养后可分别检测到脂滴、骨和软骨细胞。结论运用组织贴块培养法可用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液从食蟹猴脐带中分离到间充质干细胞。     

小鼠脐带间充质干细胞的体外诱导分化

目的分离扩增小鼠脐带间充质干细胞（mouse umbilical cord mesenchymal stem cells,mUCMSCs）探讨其是否可诱导成软骨、脂肪和成骨细胞。方法 通过贴壁培养法将mUCMSCs体外分离、扩增、纯化,倒置显微镜下观察细胞的形态特征,运用流式细胞仪检测分析细胞的抗原标志表达进行鉴定。运用诱导培养液对分离的mUCMSCs分别定向诱导培养为软骨、脂肪和成骨细胞。结果 运用组织贴块培养法可从新鲜脐带中分离到贴壁生长的成纤维样细胞,这些细胞高表达CD29、CD90和CD105,低表达CD34。成软骨诱导后阿新兰染色呈蓝色;成脂诱导后油红O染色,出现红色脂滴;茜红素染色成骨诱导的mUCMSC,可见红色结节。结论 贴壁培养法分离培养所获得的mUCMSCs在体外可诱导分化为软骨、脂肪和成骨细胞。     

人胎儿脐带间充干细胞培养及其鉴定

目的建立人脐带间充质干细胞（MSC）培养方法,观察其生长情况并进行抗原特异性鉴定.方法获取足月胎儿人脐带,剪碎成组织块,用组织块贴壁法获取MSC.1周时去除组织块,用0.125%胰蛋白酶消化传1～5代.观察形态学变化.用CD44、CD34抗体染色鉴定培养细胞.结果培养第1周,有少量梭形细胞从组织块内迁出,传代后细胞生长加快,细胞形成仿锤形.CD44抗体染色为阳性,CD34染色为阴性,证明其具有MSC特性.结论通过组织块剪碎贴壁法和组织化学染色鉴定获得了MSC,可用于后续研究.     

人脐带间充质干细胞对再生障碍性贫血患者T细胞相关因子调节的体外研究

目的体外观察人脐带间充质干细胞对再生障碍性贫血患者和正常对照T细胞相关细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-17、IL-6的调节作用.方法采用组织块培养法从脐带分离、培养间充质干细胞.用流式细胞术鉴定脐带间充质干细胞的表型.分离再生障碍性贫血患者和正常对照外周血单个核细胞与脐带间充质干细胞共培养.用ELISA法测定外周血单个核细胞组和共培养组培养上清中细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-17和IL-6的水平.结果脐带来源间充质干细胞高表达CD29、CD44、CD105、HLA-I.人脐带间充质干细胞与再生障碍性贫血患者外周血单个核细胞共培养后上清中IL-2水平无明显变化（P〉0.05）而IFN-γ水平有所下降（P〉0.05）,IL-17水平和IL-6水平明显上升（P〈0.01）.人脐带间充质干细胞与正常对照外周血单个核细胞共培养后上清中IL-2和IFN-γ水平明显下降（P〈0.05）而IL-17水平无明显变化（P〉0.05）,IL-6水平明显上升（P〈0.01）.结论人脐带间充质干细胞明显可抑制正常外周血单个核细胞分泌IL-2、IFN-γ,其与外周血单个核细胞共培养后可升高IL-6水平.     

内毒素的量效和时效对人脐带间充质干细胞增殖的影响

  目的  探讨内毒素（Endotoxin),又称为脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）的量效和时效对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs）增殖的影响。  方法  用含不同浓度LPS（0.098、0.195、0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25和50 EU/mL）的干细胞培养基培养hUC-MSCs,采用CCK-8增殖实验检测24h、48h和72 h的细胞增殖情况。确定促进hUC-MSCs增殖的低浓度（0.098 EU/mL）、中浓度（1.56 EU/mL）和高浓度（25 EU/mL）LPS,选择作用时间72 h,进一步用流式细胞术明确LPS对hUC-MSCs增殖的影响。  结果  CCK-8检测结果提示,作用24 h、48 h时,表现为抑制hUC-MSCs的增殖。作用72 h时,表现为促进细胞增殖,且低浓度区域促进作用最显著,浓度增加其促增殖作用相对减弱。流式细胞术结果提示低浓度LPS组G0/G1期的占比降低,S期和G2/M期占比增高。  结论  LPS的量效和时效对hUC-MSCs的增殖表现出不同的效应,适宜的LPS浓度及作用时间有利于hUC-MSCs的增殖。     

人脐血和脐带源MSCs分离培养难易及生物学特征的对比研究

目的 比较从人脐血和脐带中分离培养间充质干细胞（MSCs）的难易及两种不同来源MSCs的生物学特性,寻找最佳MSCs来源.方法 采用密度梯度离心法和组织块法分离培养人脐血MSCs和脐带MSCs.流式细胞术检测脐血和脐带源MSCs表面分子表型;采用丹参联合生长因子的方法诱导两种不同来源的MSCs向神经细胞分化.结果 脐带 MSCs原代分离培养成功率可达88%,而脐血MSCs分离培养成功率只有24%;脐带MSCs和脐血MSCs倍增时间分别为22h和38h;流式细胞术检测结果显示：两者具有相似的免疫表型,均表达黏附分子和基质细胞标记,不表达造血细胞标记、内皮细胞标记和HLA-DR;两种来源的MSCs在体外均可分化为樟经元样细胞.结论 脐带源 MSCs在生长速度、培养成功率上远高于脐血源 MSCs,在细胞表型及分化能力方面无差别.脐带 MSCs 是一种理想的 MSCs 来源.     

转录因子诱导人脐带间充质干细胞转分化为视网膜色素上皮样细胞的研究

目的 探讨采用关键转录因子将人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)转分化为视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)样细胞的方法。方法 通过流式细胞技术鉴定hUC-MSCs的表面标记分子;通过诱导hUC-MSCs分化成为脂肪、骨和软骨细胞确定其多系分化能力;采用慢病毒包装系统获得分别含有11个转录因子Sox2、Pax6、Rax、Six6、Nr2e1、Otx2、Lhx2、Crx、Mitf-A、Klf4和c-Myc的病毒,并通过感染hUC-MSCs来诱导hUC-MSCs向RPE样细胞分化。结果 hUC-MSCs表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,但不表达CD11b、CD34, CD45和HLA-DR等分子标记,在成脂、成骨、成软骨分化培养基中可分化为脂肪、骨和软骨细胞。视网膜及RPE发育相关的关键转录因子能够将hUC-MSCs直接转分化为RPE样的细胞,并表达ZO-1、RPE65、Bestrophin-1(Best-1)、CK8/18、Cralbp、Mertk、Tyrosinase(Tyr)、PEDF等RPE细胞的特征分子。结论 视网膜及RPE发育相关的关键转录因子可直接将hUC-MSCs分化为RPE样细胞。     

人脐带间充质干细胞对大鼠子宫内膜异位症病灶神经纤维的影响

目的   探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)对大鼠子宫内膜异位症(EMs)病灶神经纤维的影响。方法   hUC-MSCs从人新鲜脐带组织中分离和培养,并经过流式细胞仪鉴定。将体质量180~210g成年雌性Wistar大鼠,通过手术成功被诱导为EMs模型。将模型鼠随机分为治疗组和对照组,各12只。2周后治疗组接受含有hUC-MSCs的生理盐水尾静脉注射两周,1次/周,对照组接受相同体积和次数的生理盐水注射。4周后子宫内膜异位病灶被收集。标本被切片和用抗神经丝蛋白(NF)和神经生长相关蛋白-43(GAP-43)抗体进行免疫组化。结果   与对照组相比,治疗组的NF平均光密度值明显低于对照组(P＜0.01); GAP-43的平均光密度值与对照组相比也明显降低(P＜0.01)。 结论   hUC-MSCs能够降低EMs病灶的神经纤维密度值。     

单倍型异基因造血干细胞-脐带间充质干细胞联合移植治疗1例急性白血病

目的研究急性粒细胞白血病异基因造血干细胞-人脐带源间充质干细胞（hUG—MSC）联合移植效果。方法急性髓性白血病-M2,供者为其胞兄,HLA单倍型相合,移植物为经粒细胞集落刺激因子（Granulocyte Clony—Stimulating Factor,G—CSF）动员的骨髓以及外周血造血干细胞,加入分离、扩增的hUC—MSC。移植物抗宿主病（Graft—Versus—Host Disease,GVHD）预防采用环孢菌素A＋ATG^＋霉酚酸酯＋短程甲氨喋呤和CD25单抗。结果输注供者的MSC总数和CD34细胞数分别为7．92×10^8/L和3．78×10^6／L。中性粒细胞大于0．5×10^9／L和血小板大于20×10^9／L的时间分别为14d和15d。24d嵌合体100％,40d左右出现Ⅰ度aGVHD,治疗后好转,未出现其他严重并发症。结论异基因造血干细胞-人脐带源间充质干细胞（hUC—MSC）联合移植安全简便,可加速造血功能恢复。     

人脐带间充质干细胞分离培养方法的优化

目的：优化人脐带间充质干细胞 （ umbilical cord mesenchymal stem cells, UC - MSCs）分离培养的方法。方法：无菌条件下剔除剖腹产胎儿脐带动静脉,用牙剪子剪为约lmm。但彼此相连的组织块,得到贴壁细胞,采用半量换液进行原代及传代培养。用流式细胞仪检测其免疫表型。结果：成功从人脐带中分离纯化得到UC—MSCs,呈条形和成纤维细胞样的两种形态。UC—MSCs高度表达CD105、CD73．CD44、CDg0,极少数表达CIM5、CD34-CD14和HLA—DR。结论：建立出一种快捷经济的UC—MSCs体外分离培养方法。