GFP-HPVl8 E2删除突变体融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建人乳头瘤病毒18型早期蛋白2(HPV18 E2)删除突变体N端(TAD)、C端(DBD)与增强型绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的真核表达载体,为研究HPV18 E2基因与宫颈癌发生的关系提供实验基础.方法 用PCR扩增HPV18 E2 TAD、DBD基因序列,用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切pEGFP-Cl载体与TAD、DBD基因PCR产物,纯化回收后,用连接酶连接并转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定.结果 阳性克隆质粒经双酶切后,琼脂糖凝胶电泳可见4.7 kb、618 bp和243 bp附近的片段.DNA测序结果经与GenBank登录的序列做BLAST分析,显示重组质粒分别含有618 bp与243 bp的目的基因片段,无碱基错配和移码突变,读码框完全正确.结论 成功地构建了GFP-HPV18 E2删除突变体融合蛋白真核表达载体pEGFP-C1/TAD与pEGFP-C1/DBD.     

人巨细胞病毒IE1真核表达载体的构建与表达

目的构建人巨细胞病毒（HCMV）IEl真核表达载体，观察其在真核细胞内的表达，为HC—MVIEl核酸疫苗的相关研究奠定基础。方法将质粒pNEBl93-IEl用Sal I、BamH I双酶切与载体pEGFP—C1连接构建重组载体pEGFP—C1-IEl；双酶切鉴定后，取重组载体pEGFP—C1-IEl用EcoR I 、Hind Ⅲ／双酶切与载体pcDNA3．1（-）连接构建重组质粒pcDNA3．I（-）-IEl，双酶切和测序鉴定；将重组质粒pcDNA3．1（-）-IEl转染HeLa细胞，RT—PCR检测IElmRNA的表达。结果重组载体pEGFP—C1-IEl和pcDNA3．1（-）-IEl双酶切后均可切出约1476bp目的片段；重组载体pcDNA3．1（-）-IEI测序结果登录C,enBank，作BLAST分析，含有1476bp目的基因片段，无碱基错配和移码突变，与读码框完全-致；转染重组载体pcDNA3．1（-）-IEl的细胞中可扩增出约1476bp的目的条带。结论成功地构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-IEl，且其能在真核细胞内袁达。     

增强型绿色荧光蛋白与Rb94基因共表达载体的构建和表达

目的 构建增强型绿色荧光蛋白与Rb94基因的真核共表达载体并鉴定其在真核细胞中的表达.方法 用PCR技术对cDNA-Rb质粒中的目的基因片段进行扩增,使用BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切,切胶回收DNA片段.将其连接入pEGFP-C1,构建pEGFP-C1/Rb94真核表达载体并再进行酶切鉴定.将重组质粒用脂质体转染法转染至人视网膜母细胞瘤细胞(HXO-Rb44)中,荧光显微镜下观察EGFP在细胞内的表达,Western blot检测Rb蛋白的表达情况,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 重组克隆载体内的目的片段序列与Rb94基因序列完全一致.pEGFP-C1/Rb94酶切鉴定结果与预期结果一致.荧光显微镜下观察可见转染后的细胞有荧光出现.Western blot检测结果表明Rb94基因得到了有效表达.流式细胞仪检测结果显示,含Rb94基因的细胞凋亡率为(21.17±0.45)%,明显高于其他组(P<0.05).结论 成功构建EGFP和Rb94真核共表达载体,并可在真核细胞中有效表达,Rb94对视网膜母细胞瘤细胞有明显抑制生长作用.     

人PCK1基因克隆及其表达载体的构建

目的 构建人PCK1基因的真核表达载体.方法 以人内脏脂肪细胞cDNA为模板, 聚合酶链反应(PCR)扩增PCK1基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,并进行双酶切鉴定.结果 PCR扩增的特异性片段长度为1 972 bp,以此构建的pGEM-T-PCK1克隆载体,经限制性内切酶酶切证实载体中带有PCK1基因的目的片段,与GenBank中的人PCK1基因cDNA序列一致.重组质粒pcDNA3.1-PCK1经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切后显示5.1 kb和 2 000 bp左右的2个条带,证明PCK1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1(+) 中.结论 成功构建了野生型pcDNA3.1-PCK1重组真核表达载体.     

人角化上皮生长因子基因(hKGF)达载体对大鼠肺泡Ⅱ型细胞增殖的影响

目的:构建人角化上皮生长因子基因真核表达载体pEGFP-C2-hKGF,为以后的hKGF基因功能和基因治疗研究提供实验材料.方法:提取人胚肺成纤维细胞(HLF)总RNA,逆转录酶-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增hKGF基因全长cDNA序列,经与pMD18-T载体连接、筛选、克隆、抽提质粒和双酶切后,将纯化的hKGF基因cDNA全长序列插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C2中,筛选、克隆、抽提质粒,从而构建hKGF基因真核表达载体pEGFP-C2-hKGF.载体转染后大鼠肺泡Ⅱ型细胞进行免疫细胞化学及荧光显微镜鉴定,并进行细胞记数,绘制生长曲线.结果:经RT-PCR获得609bp含限制性内切酶位点的DNA片段,T载体克隆后经双酶切、测序,确定该片段为hKGF基因cDNA,进而构建hKGF真核表达载体pEGFP-C2-hKGF,经双酶切,测序确证.转染载体后,有hKGF的阳性表达并随时间逐渐增加,大鼠肺泡Ⅱ型细胞也随时间出现明显分裂增殖.结论:成功构建hKGF基因真核表达载体pEGFP-C2-hKGF,为进一步应用于基因治疗研究提供工具.     

人PCK1基因克隆及其表达载体的构建

目的构建人PCK1基因的真核表达载体。方法以人内脏脂肪细胞cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增PCK1基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1( )中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为1 972 bp,以此构建的pGEM-T-PCK1克隆载体,经限制性内切酶酶切证实载体中带有PCK1基因的目的片段,与GenBank中的人PCK1基因cDNA序列一致。重组质粒pcDNA3.1-PCK1经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切后显示5.1 kb和2 000 bp左右的2个条带,证明PCK1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1( )中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-PCK1重组真核表达载体。     

真核荧光蛋白表达载体 pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1的构建与表达

目的:构建表达B7.2和MAGE-1的绿色荧光共表达载体pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1,并在真核细胞中表达.方法:根据GenBank中的序列,对B7.2、MAGE-1各设计一对两端带有特定限制性酶切位点的引物,分别从乳腺组织、乳癌组织提取总RNA,进行RT-PCR后,将两扩增产物分别克隆在pGEM-T载体,经测序证实碱基序列无误后,双酶切pGEM-T载体,回收目的片段,将两目的片段亚克隆至真核绿色荧光蛋白共表达载体(pEGFP-C3)上,并转染真核细胞,观察其在真核细胞中表达.结果及结论:pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1真核表达载体经酶切及基因序列分析验证,PCR扩增片段与选择的目的片段序列相符,pEGFP-C3-B7.2-MAGE-1真核表达载体构建成功.该表达载体转染EC9706细胞后,用免疫荧光显微镜观察和RT-PCR分析,该重组载体能够在真核细胞中广泛表达.     

人巨细胞病毒部分抗原基因的克隆及表达

目的克隆表达人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）特异性强的抗原决定簇基因，制备特异性抗原。方法从感染HCMV的细胞上清液中提取病毒基因组DNA，用PCR扩增HCMVpp150（ppUL32）、gp52（UL44）、pp65（ppUL83）、ppUL80a蛋白IgM抗原决定簇编码区DNA序列，将其克隆至pMD-18T载体并测序，然后克隆至表达载体pGEX-4T-1诱导表达，采用免疫印迹法（Western blotting）检测表达产物的抗原性。结果经序列测定各基因片段序列正确，并在pGEX-4T-1表达载体中得到了高效表达，表达的融合蛋白经Western blotting和ELISA分析，具有良好的抗原性，能够与HCMV IgM阳性血清发生特异性反应。结论通过基因工程技术可以有效地获取纯度较高、特异性强的HCMV抗原。为HCMV感染者的早期诊断提供检测用抗原。     

辐射敏感性新基因UHRF1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建UHRF1的真核表达载体,并验证其在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达。方法采用RT-PCR方法,从乳腺癌细胞MCF-7的总cDNA中扩增出2.3kb的UHRF1基因的cDNA片段,经限制性内切酶KpnⅠ与XhoⅠ双酶切,定向克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建重组质粒pcDNA3（＋）-UHRF1,利用限制性内切酶双酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;构建成功的重组质粒,经脂质体Lipofactamin2000介导转染MDA-MB-231细胞,G418筛选阳性克隆,以RT-PCR和Western blot检测UHRF1的mRNA和蛋白的表达。结果获得全长约为2.3kb的UHRF1基因片段;重组质粒经限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ酶切、电泳后显示2.3kb的UHRF1目的片段和5.4kb的pcDNA3载体片段,即UHRF1基因的cDNA已正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中;UHRF1转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后的RT-PCR和Western blot的结果显示：UHRF1的mRNA和蛋白水平均呈现高表达。结论成功构建UHRF1基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

pEGFP—AFP—TK真核表达载体的构建及其抗肝癌细胞效应

目的 构建AFP启动子介导的HSV／TK重组真核表达载体,并研究其荷瘤效应。方法PCR扩增AFP基因启动子、HSV—TK基因,将上述片断插入EGFP—N1载体的多克隆位点,从而构建甲胎蛋白启动子调控下HSV—TK基因重组表达载体pEGFP—AFP—TK。将其注射移植性H22肝癌模型C57BL／6J小鼠,并设转染空质粒pcDNA3．1组,观察两组的抗肿瘤效应。结果肝癌特异性真核表达载体pEGFP—AFP—TK构建成功,该真核表达载体免疫荷瘤小鼠后,pEGFP—AFP—TK组肿瘤细胞生长受到抑制,且该组生存期长于pcDNA3．1组（P〈0．05）。结论在受试动物体内可有效的诱导特异性抗肿瘤免疫应答。     

人端粒酶催化亚单位启动子驱动的EGFP真核表达载体的构建及在肺癌细胞的表达

目的：构建人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子驱动的增强绿色荧光蛋白（EGFP）真核表达载体，研究其调控EGFP在肿瘤细胞中的靶向表达。方法：从含hTERT启动子序列的重组质粒pGL3-hTERTp上，酶切获取约1100bv的启动子片段，克隆至无启动子的EGFP质粒载体pEGFP-1的多克隆位点中，构建pEGFP-hTERTp真核表达载体。用含有巨细胞病毒（CMV）启动子的质粒pEGFP—N1作为阳性对照，pEGFP-1作为阴性对照，脂质体转染法分别转染人肺癌细胞95D，NCI—H446，A2，A549，LTEP—a-2，YTMLC和人正常细胞MRC-5，荧光显微镜下观察各细胞中EGFP转录表达情况。结果；双酶切和单酶切均显示载体pEGFP—hTERTp构建成功。细胞转染结果显示：在转染了pEGFP-hTERTp质粒的肺癌细胞中EGFP都有不同程度的表达，而在MRC-5中无EGFP表达；转染pEGFP-N1的肺癌细胞和正常细胞中均可清晰地观察到EGFP强荧光表达。结论：hTERT启动子能调控EGFP在肺癌细胞中靶向性转录表达。CMV启动子调控的EGFP在肺癌细胞和正常细胞中的表达不具有特异性。hTERT启动子有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的调控元件。     

SET-EGFP重组表达质粒的构建及表达

目的构建癌蛋白SET与增强型绿色荧光表达载体（EGFP）的融合表达质粒pEGFP—N2-SET并获得表达。方法根据人SET基因序列。设计了一对含有Kozak序列、终止密码子、HindⅢ和KpnI酶切位点的引物。从人L-02肝细胞提取总RNA，以逆转录后cDNA为模板，PCR扩增获得SET基因片段，经双酶切后回收得到有以上两个酶切位点的SET基因片段，将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pEGFP—N2载体中，获得重组质粒pEGFP—N2-SET。以Lipofectamine^TM2000为载体，将构建好的真核表达质粒转染到L-02肝细胞中进行瞬时表达。结果。经DNA测序鉴定证实，pEGFP—N2-SET重组质粒构建成功，经荧光倒置显微镜观察，证实能在细胞内进行蛋白表达。结论SET表达质粒的成功构建及表达为其进一步结构和功能研究奠定了基础。     

pEGFP-N1-α-synuclein真核表达载体的构建

【目的】构建pEGFP-N1-α-synuclein真核表达载体,为研究帕金森病奠定基础。【方法】设计特异引物,PCR扩增α-synuclein cDNA并引入FLAG标签,克隆入pEGFP-N1质粒,对重组质粒进行酶切及测序,鉴定正确后转化Ecoh．DH5（大肠杆菌）,大量扩增重组质粒。试剂盒纯化重组质粒。用Lipofectamine^TM 2000将重组质粒转染2937细胞,Western blotting检测融合蛋白在细胞内的表达。【结果】pEGFP-N1-α-synuclein重组质粒构建成功,Westernblotting检测融合蛋白分子量为47kd,符合预期值。【结论】成功构建了人野生型α-synuclein与绿色荧光蛋白基因融合并加入FLAG标签的真核表达载体pEGFP-N1-α-svnuclein。     

人源性肝细胞生长因子高效真核表达载体的构建

目的：通过基因克隆构建人源性肝细胞生长因子(hHDSSF)真核高效表达重组体。方法：通过T-A克隆构建hHDSSF中间重组体pGEM-hHDSSF；酶切鉴定后构建真核表达重组体pcDNA3．1hisB-hHDSSF；末端终止法测定插入片断基因序列。结果：酶切证实hHDSSF完整插入pGEM中；酶切筛选得到正向插入的真核表达重组体pcDNA3．1hisB-hHDSSF，并经序列分析证明。结论：成功构建了真核表达重组体pcDNA3．1hisB-hHDSSF，为进一步转染真核细胞建立稳定的转染表达细胞株和高效表达hHDSSF奠定了坚实的基础。     

GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位

目的 研究GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位.方法 PCR扩增HPV16E5基因片段,将其连接到真核表达截体pEGFP-C1,双酶切及测序鉴定,构建表达截体pEGFP-C1/HPV16 E5;将质粒pEGFP-C1/HPV16 E5和pEGFP-C1分别转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下现察GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位.结果 GFP 荧光均匀分布在细胞浆和细胞核;GFP-HPV16 E5融合蛋白组荧光分布在细胞浆.结论 GFP-HPV16 E5融合蛋白能在HeLa细胞内表达且定位于细胞浆.     

5-LO真核表达载体的构建及其在RAW264.7细胞中的表达的初步研究

目的构建5-LO真核表达载体并初步研究其在RAW264．7细胞中的表达,为建立5-LO高表达转基因小鼠模型提供表达载体。方法从人全血标本中提取细胞总RNA,以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法扩增5-LO基因,分别构建5-LO目的基因的克隆载体与表达载体,提取质粒,进行酶切、PCR和DNA测序鉴定,将重组融合表达载体pEGFP-5-LO稳定转染RAW264．7细胞,RT-PCR、western blot方法检测pEGFP-5-LO的表达情况。结果构建了重组克隆载体pUCm-5-LO和真核表达载体pEGFP-5-LO,经酶切、PCR及测序鉴定正确;转染细胞后,在荧光显微镜下观察到pEGFP-5-LO融合蛋白的表达,RT—PCR和Westemblot结果表明转染pEGFP．5-LO的RAW264．7细胞中有5-LO的表达。结论成功克隆了5-LO基因,构建的表达载体pEGFP-5-LO在RAW264．7细胞中表达5-LO蛋白,为进一步5-LO高表达转基因鼠模型的建立和临床应用奠定了基础。     

MAGE-E1a荧光真核表达载体的构建

目的：构建MAGE-Ela与绿色荧光蛋白融合的真核表达载体，为研究肿瘤疫苗中树突状细胞的作用奠定基础．方法：应用基因重组技术，将反转录PCR得到的MAGE-Ela基因克隆入荧光真核表达载体pEGFP-N3中，用含卡那霉素LB培养基平板筛选转化菌，阳性重组子经SalⅠ和KpnⅠ双酶切分析、PCR鉴定．结果：MAGE-Ela基因成功地亚克隆至真核表达载体pEGFP-N3中，获得MAGE-E1a／pEGEP-N3重组质粒．结论：MAGE-E1a基因克隆入pEGFP-N3质粒，成功构建MAGE-E1a／pEGFP-N3荧光真核表达载体，解决了MAGE-E1a基因转染的定位问题，为研究肿瘤疫苗奠定了基础。