幽门螺杆菌外膜蛋白基因omp22克隆、表达和鉴定

目的:克隆幽门螺杆菌外膜蛋白基因omp22,构建幽门螺杆菌omp22基因与麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体,并进行诱导表达,鉴定融合蛋白免疫原性,为幽门螺杆菌疫苗研究提供依据.方法:利用 PCR 技术从Helicobacter pylori郑州分离株MEL-Hp27染色体DNA上扩增omp22基因,并将其克隆到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌(E.coli TB1),用IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,Western blot鉴定其免疫原性.结果:PCR方法扩增的omp22基因长度约为540 bp.经酶切鉴定,插入到表达载体的基因片段与预期目的DNA片段相一致;SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为22 ku,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的26%.结论:成功克隆并构建了omp22基因高效原核表达系统,为幽门螺杆菌基因工程组分疫苗的研究奠定基础.     

幽门螺杆菌外膜蛋白omp22和黏附素hpaA融合基因原核表达系统的构建与鉴定

目的:构建表达幽门螺杆菌(Hp)的外膜蛋白omp22和黏附素hpaA融合基因的重组蛋白质候选菌株,为Hp疫苗研究提供依据. 方法:用PCR方法扩增出带3个甘氨酸残基柔韧接头的融合基因omp22-hpaA, 将其克隆到表达载体pMAL-c2X中转化大肠杆菌(E.coli TB1),用IPTG诱导目的基因表达,SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,Western Blot鉴定其免疫原性. 结果:测序结果显示, omp22-hpaA融合基因片段由1326 bp组成,为编码440个氨基酸残基的多肽,接头序列GGTGGAGGC已成功地插入omp22-hpaA融合基因中;SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量约为53 ku,融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的20%. 结论:成功克隆并构建了omp22-hpaA融合基因原核表达系统.     

幽门螺杆菌flaA基因在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的：观察幽门螺杆菌(H．pylori)flaA基因在大肠杆菌中的表达。方法：用PCR方法扩增flaA基因,然后插入原核表达载体pMAL-c2x进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果：特异PCR和酶切鉴定证实flaA基因克隆入表达载体,并以融合蛋门形式MBP-FLA高效表达,约占细胞总蛋白的28％。该融合蛋白可与H.pylori阳性病人血清和小鼠H.pylori全菌抗体发生特异反应。结论：成功构建了能高效表达H．pylori FlaA蛋白的重组质粒,为H．pylori多价基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

重组幽门螺杆菌AhpC基因的克隆表达及其初步纯化

目的克隆表达幽门螺杆菌（helicobacter pylori）AhpC基因,为筛选预防或治疗幽门螺杆菌的疫苗保护性抗原奠定基础.方法用PCR方法从临床分离株9806的染色体DNA中扩增出AhpC基因片段,将目的基因插入表达载体pET-11c中,重组载体pET-AhpC经DNA测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达.采用阴离子交换层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 PCR扩增的AhpC基因长度为597bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因片段与GenBank公布的序列相似性达98%,SDS-PAGE显示,经IPTG诱导目的蛋白占总蛋白的28.7%,经纯化后,蛋白纯度达70%以上.Western blot检测该蛋白与兔抗Hp的多克隆抗血清发生结合反应.结论成功构建了AhpC表达载体pET-AhpC,并在大肠杆菌中高效表达.     

幽门螺杆菌疫苗候选抗原lpp20基因的克隆表达及其纯化研究

目的克隆表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)lpp20基因,为筛选预防或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗保护性抗原奠定基础.方法用PCR方法从临床分离株9806的染色体DNA中扩增出lpp20基因片段,将目的基因插入表达载体pET22b中,重组载体pET22b-Lpp20经DNA测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌E. coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达.采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果PCR扩增的lpp20基因长度为528bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因片段与GenBank公布的序列相似性达99%,SDS-PAGE显示,经IPTG诱导目的蛋白占总蛋白的19.7%,纯化后,蛋白纯度达80%以上.Western blot检测该蛋白与兔抗Hp的多克隆抗血清发生结合反应.结论成功构建了lpp20表达载体pET22b-Lpp20,并在大肠杆菌中表达.     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI基因真核表达载体的构建及表达

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori)尿素通道蛋白编码基因(ureI)的真核表达重组载体,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的研制奠定基础。方法以H.pyloriSS1株基因组为模板,PCR扩增ureI目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;通过酶切、PCR及测序鉴定,筛选阳性重组载体;脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,Western blot检测其在HeLa细胞中的表达。结果以H.pyloriSS1株基因组DNA为模板扩增出特异的ureI基因片段,大小约585 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论成功构建了真核重组载体pcDNA3.1(+)/ureI,并能在HeLa细胞中表达。     

肝细胞癌候选相关基因IDD01原核表达载体的构建与表达

目的克隆及表达肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)候选相关基因IDD01 (Institute of Digestive Disease.01),研究其功能.方法用RT-PCR方法从HCC标本中扩增出IDD01的开放读码框(open reading frame, ORF),将目的基因插入表达载体pMAL-c2X中,用重组质粒转化大肠杆菌(E. coli TBl),并在E. coli TBl中进行表达.用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析.结果扩增的ORF长度约为770 bp;经酶切和测序分析,插入片段序列和阅读框架正确;SDS-PAGE结果显示,目的基因表达产物的相对分子质量为28×103,融合蛋白的量占全菌总蛋白的30.4%.结论成功构建IDD01的原核表达载体,重组质粒在E. coli TBl中能够高效表达目的基因,该重组子的构建为IDD01基因的功能研究奠定了重要基础.     

幽门螺杆菌重组1188蛋白的表达

目的 表达幽门螺杆菌(H.pylori)重组1188蛋白,为研究幽门螺杆菌的黏附机制奠定基础.方法 用聚合酶链反应(PCR)技术从H.pylori标准株NCTC 11637的基因组DNA中扩增hp1188基因片段,插入原核表达载体pQE-30,构建重组载体pQE30-hp1188,经DNA测序分析确认后,转化大肠杆菌DH5α,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.Ni2+-NTA树脂纯化表达蛋白,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达形式和表达量.结果 重组表达质粒pQE30-hp1188构建成功,所得序列完整,插入的基因片段全长810 bp,与基因文库中的hp1188基因同源性达98%.SDS-PAGE显示表达产物相对分子质量约为30.6 kD,与预期一致,蛋白表达量占全菌总蛋白的47%,上清液和沉淀中均有表达,重组蛋白纯化后纯度达90%以上. 结论 成功克隆hp1188基因,并在大肠杆菌DH5α中获得高效表达.     

幽门螺杆菌hp1188基因的原核表达

目的:重组表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)hp1188基因,为研究该基因所编码蛋白在H.pylori的黏附过程中的作用奠定基础.方法:以H.pylori标准株NCTC 11637基因组DNA为模板,PCR扩增hp1188基因片段,克隆至质粒pQE-30中获得重组质粒pQE30-hp1188,经DNA测序确认后将重组质粒转化大肠杆菌DH5 α,IPTG诱导表达.Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化表达蛋白,SDS-PAGE检测表达,Western blot鉴定相应抗原表位.结果:扩增的hp1188基因片段全长810 bp,与基因文库中的hp1188基因同源性达98%.SDS-PAGE显示表达产物相对分子量约为30 600 Dalton,与预期相符;大肠杆菌裂解液中表达产物接近可溶性蛋白总量的一半,但沉淀中仍能检测到表达蛋白.目标蛋白纯化后均一性接近90%,Western blot证实与多克隆抗体有良好结合能力.结论:成功克隆了hp1188基因,并在大肠杆菌DH5α中获得高效表达.     

幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白基因napA克隆及序列分析

目的：从幽门螺杆菌(H．pylori)中克隆中性白细胞激活蛋白基因napA并构建重组载体。方法：提取H．pylori郑州分离株MEL-HP27基因组DNA作模板;根据H．pylori J99全基因组序列设计napA PCR引物,高保真酶扩增napA片断;限制性内切酶切PCR产物和pNEB193空质粒,T4 DNA酶连接酶切产物,重组质粒转化E．coli TBIT程菌,蓝白斑试验筛选阳性克隆;提取质粒经酶切鉴定后测序并利用生物学软件进行序列分析。结果：DNA限制性内切酶可从重组质粒pNEB-napA的EcoR I和Sal I位点之间切出一个435bp的DNA片断,测序结果与J99 napA同源性为96．5％,与H．pylori其他菌株的同源性为92％～97％。结论：成功构建H．pylori中性白细胞激活蛋白基因的重组质粒pNEB-napA;序列分析表明HP-napA是一类高度保守的原核型基因,可作为H．pylori疫苗候选基因。     

人幽门螺杆菌UreB与Omp11双价疫苗载体的构建与鉴定

目的:构建含人幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)郑州分离株MEL HP27 ureB-omp11融合基因的重组表达载体.方法:利用分子克隆技术,扩增Hp UreB、Omp11编码基因及融合基因ureB-omp11,将融合基因ureB-omp11与载体pET30a( )进行酶切、连接,然后转化并筛选含有目的基因的重组载体.结果:酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Hp ureB-omp11融合基因,由2 280 bp组成.与GenBank报道的相比,核苷酸序列同源性为99.39%,氨基酸序列同源性为99.47%.结论:成功构建了MEL Hp27融合蛋白UreB-Omp11的双价疫苗重组载体,为Hp蛋白质疫苗和核酸疫苗的研制奠定了良好的基础.     

幽门螺杆菌尿素酶基因ureB植物双元表达载体的构建

目的:构建含有人幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)ureB基因的植物表达载体.方法:采用高保真PCR技术从质粒pMED-ureB中扩增出ureB基因,构建质粒pUC18-ureB,再将pUC18-ureB酶切,将ureB基因与质粒pBI121连接.结果:构建的PBI121-ureB经PCR、酶切鉴定和测序分析证明,插...     

幽门螺杆菌1pp20基因在大肠杆菌TB1中诱导表达方法的研究

目的 :研究影响幽门螺杆菌lpp2 0基因在大肠杆菌TB1中表达的因素 ,探索高效表达的条件 ,为幽门螺杆菌疫苗抗原的纯化和生产奠定基础。方法 :用PCR方法从幽门螺杆菌的染色体DNA上扩增出lpp2 0基因片段 ,将目的基因插入的表达载体pMAL c2X中 ,用重组质粒转化大肠杆菌 (E .coliTB1)。采用不同的诱导时间、IPTG浓度和诱导温度进行诱导表达 ,应用SDS PAGE方法对表达产物进行分析。结果 :在诱导 1～ 4h之间 ,融合蛋白的表达量变化较为显著 ,而 4～ 8h之间则无显著变化 ;IPTG终浓度低于 0 .2mmol/L或高于3 .2mmol/L均能显著减少融合蛋白的表达量 (P <0 .0 5 ) ,而IPTG终浓度在 0 .4～ 2 .4mmol/L之间时 ,对融合蛋白的表达量并无显著影响 ;诱导温度在 3 0℃～ 40℃之间变化对融合蛋白的表达量无显著影响 ,超出此范围可使表达量显著减少 (P <0 .0 5 ) ;在优化诱导条件后 ,融合蛋白的表达量可达全菌总蛋白的 3 4%。结论 :通过调整诱导时间、IPTG浓度和诱导温度 ,lpp2 0基因与载体pMAL c2X的重组质粒在E .coliTB1中能够高效表达。     

结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85B编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVaxl中，转化大肠杆菌DH5a，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌PCR扩增为阳性，经限制性内切酶消化后可见目的条带，所测定序列与报道的Ag85B序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株。     

人乙酰肝素酶基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建人乙酰肝素酶基因（HPA）的真核表达载体pEGFP-N1/HPA,初步探讨其在人胚肾细胞293T中的表达情况.方法 以pOTB7/HPA质粒为模板,PCR扩增HPA基冈,经限制性内切酶酶切后,连接到pEGFP-N1载体上,并对重组表达载体pEGFP-N1/HPA进行酶切与测序鉴定.用脂质体lipefectmi...     

HLA-G5-IgGFc融合蛋白真核表达载体的克隆及鉴定

目的构建人HLA-G5-IgGFc融合蛋白真核表达载体。方法经重组PCR将HLA-G5和IgGFc基因拼接并插入T载体。鉴定后，双酶切得到融合基因并插入真核表达载体pcDNA3.1。结果PCR、限制性内切酶酶切和序列分析表明已构建pcDNA3.1-HLA-G5表达载体。结论成功构建了HLA-G5-IgGFc段融合蛋白真核表达载体。