总T3快速检测微流控芯片的制作及应用研究

目的 建立一种可以用于免疫分析的微流控芯片系统。方法 采用激光直接加工法制备微流控芯片，建立由流体控制系统、免疫反应系统和信号处理系统构成的芯片系统，用免疫竞争法测定总T3。结果 芯片系统可以在20min内完成总T3的分析，所需要的标本量和试剂量为5μl。线性范围为1～10ng／ml，批内CV平均为7．2％。批间CV平均为10．7％，回收率为108．5％。结论 微流控芯片系统用于检测总T3具有快速、灵敏、稳定、可重复使用的特点。     

微流控芯片用于甲胎蛋白化学发光免疫分析的研究

目的：建立一种可用于免疫分析的微流控芯片系统。方法：采用激光直接加工法制备微流控芯片，建立基于超顺磁珠的化学发光微流控免疫分析系统，用于甲胎蛋白（AFP）的测定。结果：芯片系统可在20min内完成AFP的分析，所需要的标本量和试剂量为5μl，线性范围为1～800ng／ml，批内变异系数（CV）平均为6，3％，批间CV平均为7．8％，回收率为94．3％。结论：微流控芯片系统是一种快速、耗费小、可重复使用的AFP测定方法。     

微流控芯片用于AFP快速检测的研究

目的建立一种可以用于免疫分析的微流控芯片系统。方法采用激光直接加工法制备微流控芯片，建立由流体拉制系统、免疫反应系统和信号处理系统构成的芯片系统，用于甲胎蛋白的测定。结果芯片系统可以在20min内完成AFP的分析，所需要的标本量和试荆量为5μl，线性范围为1-800ng／ml，批内CV平均为4．8％，批间CV平均为7．0％，回收率为96．3％。结论微流控芯片系统是一种快速、耗费小、可重复使用的AFP测定方法。     

微流控芯片电泳免疫法检测β_2微球蛋白

目的:建立一种基于微流控芯片电泳技术的快速微量蛋白检测方法。方法:用过量FITC-β2-MG抗体,与分析体系中β2-MG发生非竞争性免疫反应,FITC-β2-MG抗体和免疫反应形成的荧光免疫复合物通过微流控芯片电泳实现分离,激光诱导荧光检测荧光信号。结果:分别考察了电泳缓冲体系、pH值等对芯片电泳行为的影响,结果表明pH8.33、45mmol/LTBE缓冲液分离效果较好,在此基础上实现了β2-MG标准品的分析,建立了微流控芯片电泳免疫分析方法。结论:微流控芯片电泳免疫分析方法可在2min内完成一次样品的电泳分析,且试剂和样品消耗少,灵敏度高,改善了常规免疫分析的不足,显示出较好的应用前景。     

TSH的快速免疫检测在微流控芯片系统中的应用

目的建立一种可将免疫反应原理与化学发光技术相结合的微流控芯片系统。方法采用激光直接加工法制备微流控芯片,用双抗夹心法测定TSH。结果芯片系统可以在25min内完成TSH的检测流程,所需的标本和抗体试剂量为10μl,线性范围为0-50μIU/ml,批内CV平均为4.7%,批间CV平均为4.6%,平均回收率为95.3%。结论用于检测TSH的微流控芯片系统灵敏、快速、操作简便、可重复使用。     

三维立体微流控芯片制作方法研究

目的通过对三维立体通道模具的制作进行研究,以制备能生产高效低价均一载药微液滴的三维立体微流控芯片。方法试验过程中对芯片模具基底材料,曝光时间、刻蚀时间对三维立体微流控芯片模具制作的影响,及聚二甲基硅氧烷（PDMS）的配方和固化温度对微流控芯片成型的影响进行了系统地研究,获得最优化工艺参数,制备出最适合于产生载药微液滴的微流控芯片。结果有机玻璃板综合性能最优,可作为芯片模具基底材料;刻蚀时间、曝光时间随通道厚度的增加而增长。对于层数较少的掩膜（如1、2层）最佳曝光时间为10、15s。一般采用大于临界时间,使所需通道稍微过曝。以PDMS为材料注塑成型制备出理想的三维通道微流控芯片,并采用自动进样泵于各通道注入不同液相来高速制备尺寸可控的均一微液滴。结论该模具制备方法快速、价格低廉,克服了大多数三维微流控芯片模具制作工艺复杂、成本高昂等缺点,PDMS注塑成型技术操作简单,可满足快速生成粒径理想、尺寸均一化、重现性好的载药微液滴的要求。     

一种基于微流控免疫磁珠快速检测登革热抗原的方法

目的建立一种灵敏、快速、方便的检测登革热抗原新方法,为登革热的临床诊断提供帮助。方法建立了一种基于微流控免疫磁珠快速检测登革热抗原检测方法。使用Solidwork软件设计微流控芯片,采用机械加工法和化学封接方式制备微流控芯片;利用化学偶联反应制备登革热抗体免疫磁珠;在微流控芯片载体上,以HRPTMB-H_2O_2为显色体系,利用双抗体夹心法原理检测登革热NS1抗原;最后,同时应用该方法与传统ELISA试剂盒对57例临床样品进行检测,分析该方法的正确度,并对两种方法的优缺点进行比较。结果微流控免疫磁珠方法整个检测过程仅需20 min,反应体系只需磁珠量10μg和样品量10μL;验证实验中,该方法可以将阴性和阳性明显区分开,阳性样本有显色,阴性、空白样本均无显色;性能上,该新型ELISA方法与传统ELISA方法结果阴阳性符合率达到100%。结论该新型ELISA检测方法具有简便、快速、节省试剂和所需样本少、灵敏度高、稳定性好、准确性高等优点,可以用于登革热抗原检测。     

毛细管电泳与微流控芯片电泳快速检测粪便中腺病毒的方法建立

目的 建立粪便中腺病毒的PCR-毛细管电泳-激光诱导荧光和PCR-微流控芯片电泳-激光诱导荧光快速检测方法。方法 采用试剂盒法提取粪便中腺病毒DNA,选择腺病毒六邻体基因保守区域进行PCR扩增反应。PCR产物分别用高灵敏度的SYBR Gold和SYBR Orange核酸荧光染料进行标记,在优化的毛细管电泳和微流控芯片电泳条件下分离,采用激光诱导荧光检测特异性PCR扩增产物。结果 腺病毒扩增产物在优化的毛细管电泳和微流控芯片电泳条件下可分别于9 min和6 min内完成检测。将PCR扩增产物测序,并与NCBI基因库中核酸序列比对,结果表明所选用的扩增序列特异性良好。商品化DNA Marker毛细管电泳和微流控芯片电泳对目标DNA片段bp值求得的日内精密度分别为1.14%～1.34%和1.18%～1.48%,日间精密度分别为1.27%～2.76%和2.85%～4.06%。毛细管电泳-激光诱导荧光法和微流控芯片电泳-激光诱导荧光法检测腺病毒的灵敏度分别为2.33×10² copies/mL和2.33×10³ copies/mL。两种方法用于实际粪便样品测定,准确度高。结论 本研究建立的PCR-毛细管电泳-激光诱导荧光和PCR-微流控芯片电泳-激光诱导荧光检测方法能够快速、灵敏、准确地检测出粪便中的腺病毒。     

RGD多肽功能化的微流控芯片识别/捕获肿瘤细胞的研究

目的 探讨经RGD多肽功能化后的微流控芯片系统识别/捕获肿瘤细胞的效果.方法 采用化学共价连接的方法固定RGD多肽,建立由流体控制系统、免疫反应系统构成的细胞识别芯片系统,用于细胞的筛选/捕获;选用不同密度的细胞进行进样试验,考察不同细胞密度对通道内细胞数量的影响,并讨论不同的孵育时间对细胞捕获的影响.结果 随着进样细胞密度的增加,进入通道内的细胞明显增多;此功能化后的芯片系统在15 min内对A549的捕获率为90%,在20min内可完全将细胞捕获于管壁.结论 经RGD多肽修饰的微流控芯片系统可在短时间内对A549细胞进行有效的筛选,且在细胞数量很低时,也能对其进行捕获.     

微流控免疫芯片快速检测法的建立及其检测TSH和T4的效果

目的 在已制备的微流控芯片系统上建立基于顺磁微球的免疫检测方法，并将此方法用于检测促甲状腺激素（TSH）和甲状腺素（T4）。方法 采用数字激光刻蚀技术制备微流控芯片，以luminol-H2O2为发光体系，用双抗夹心法测定TSH，用免疫竞争法测定T4。结果 该检测系统可以在25min内完成检测，所需的标本和抗体试剂量为10山，TSH检测范围为0～50μIU／ml，批内CV平均为4．9％，批间CV平均为4．9％，平均回收率为93．74％；T4检测范围为9．375～300ng／ml，批内CV平均为4．9％，批间CV平均为4．7％，平均回收率为91．27％。结论 本方法检测TSH和T4具有操作简便、节约时间、节省试剂、稳定性好、准确度高的优点。     

APRIL siRNA表达载体构建、微流控芯片筛选及转染优化

目的:构建增殖诱导配体(APRIL)异构体特异性siRNA质粒载体,利用微流控芯片电泳筛选APRIL异构体特异性siRNA表达质粒。方法:以高表达APRIL的人结肠癌细胞株SW480为肿瘤细胞模型,选择APRIL异构体特异性siRNA序列,微流控芯片电泳筛选siRNA表达质粒并经测序后转染SW480细胞,半定量RT-PCR法检测瞬时转染前后SW480细胞中APRILmRNA水平。结果:成功构建hOligo637、hOligo1450、hOligo1534、hOligo1750。微流控芯片电泳成功分辨出被双酶切的插入片段。瞬时转染SW480细胞后均产生特异性的mRNA抑制效应。结论:采用微流控芯片电泳成功筛选出APRIL为靶点的siRNA质粒,并可广泛应用于筛选siRNA质粒。     

微流控芯片三相层流用于人参中人参皂苷的提取研究

目的 建立基于三相层流微流控芯片萃取技术进行人参药材中成分提取的方法.方法 设计了三通道入口萃取芯片,两侧通道经表面疏水处理,用注射泵引入脂溶性溶剂乙醚及萃取剂水饱和正丁醇,中间亲水通道用注射泵引入药物初提液;将水饱和正丁醇所得提取液用高效液相色谱法(HPLC)进行测定,检测人参总皂苷的质量分数.结果 三相层流芯片比双相层流芯片所得人参皂苷质量分数高,3种人参皂苷Rg1、Re、Rb1的质量分数分别提高了3.95倍、3.32倍、5.94倍.结论三相层流芯片可用于3种不同极性溶剂的同时层流处理,效率高、时间短、消耗低,不但可用于同时提取和分离,也可推广至多种极性部位的共同萃取.     

Sensitive detection of microRNAs using polyadenine-mediated fluorescent spherical nucleic acids and a microfluidic electrokinetic signal amplification chip

The identification of tumor-related microRNAs (miRNAs) exhibits excellent promise for the early diagnosis of cancer and other bioanalytical applications. Therefore, we developed a sensitive and efficient biosensor using polyadenine (polyA)-mediated fluorescent spherical nucleic acid (FSNA) for miRNA analysis based on strand displacement reactions on gold nanoparticle (AuNP) surfaces and electrokinetic signal amplification (ESA) on a microfluidic chip. In this FSNA, polyA-DNA biosensor was anchored on AuNP surfaces via intrinsic affinity between adenine and Au. The upright conformational polyA-DNA recognition block hybridized with 6-carboxyfluorescein-labeled reporter-DNA, resulting in fluorescence quenching of FSNA probes induced by AuNP-based resonance energy transfer. Reporter DNA was replaced in the presence of target miRNA, leading to the recovery of reporter-DNA fluorescence. Subsequently, reporter-DNAs were accumulated and detected in the front of with Nafion membrane in the microchannel by ESA. Our method showed high selectivity and sensitivity with a limit of detection of 1.3 pM. This method could also be used to detect miRNA-21 in human serum and urine samples, with recoveries of 104.0%–113.3% and 104.9%–108.0%, respectively. Furthermore, we constructed a chip with three parallel channels for the simultaneous detection of multiple tumor-related miRNAs (miRNA-21, miRNA-141, and miRNA-375), which increased the detection efficiency. Our universal method can be applied to other DNA/RNA analyses by altering recognition sequences.     

血清促甲状腺素免疫检测技术

血清促甲状腺素(TSH)是反映甲状腺功能最敏感的指标.血清TSH测定方法 有多种,从最初的放射免疫分析法和免疫放射分析法到临床逐渐普及的免疫化学发光分析法、电化学发光免疫法和时间分辨荧光免疫法等,乃至近年出现的微流控芯片技术,血清TSH检测的灵敏度显著提高.文章就临床较为常用的血清TSH检测技术及存在的问题作一综述.     

血清促甲状腺素免疫检测技术

血清促甲状腺素（TSH）是反映甲状腺功能最敏感的指标。血清TSH测定方法有多种,从最初的放射免疫分析法和免疫放射分析法到临床逐渐普及的免疫化学发光分析法、电化学发光免疫法和时间分辨荧光免疫法等,乃至近年出现的微流控芯片技术,血清TSH检测的灵敏度显著提高。文章就临床较为常用的血清TSH检测技术及存在的问题作一综述。     

核酸扩增及微流芯片法检测HCV-Ab临界值附近标本的结果探讨

目的 对于用ELISA法检测HCV-Ab结果在临界值周围的可疑标本,用核酸扩增及微流芯片法进一步检测,以探讨不同方法丙型肝炎病毒(HCV)的检出率及其感染的危险性。 方法 收集住院患者中经2种不同的HCV-Ab ELISA法试剂①或试剂②检测结果S/CO≥0.4至＜1.0的血清标本24份,其金标试纸条法检测均为阴性,分别用核酸扩增及微流芯片法和化学发光免疫分析(CLIA)测HCV-Ab法进行检测。 结果 24份用ELISA法检测S/CO值处于临界值的标本,经核酸扩增及微流芯片法检测阳性16份(阳性率66.67%),CLIA测HCV-Ab法检测阳性16份(阳性率66.67%),HCV-Ab ELISA法试剂①阳性6份(阳性率25.00%),试剂②阳性10份(阳性率41.67%)。核酸扩增及微流芯片分析法与ELISA法试剂①检测结果进行比较,阳性率差异有统计学意义(P＜0.01),与ELISA法试剂②检测结果进行比较,阳性率差异有统计学意义(P＜0.05)。 结论 核酸扩增及微流芯片分析法对HCV的检出率高于ELISA法和金标试纸条法,因此,对ELISA法检测HCV-Ab结果在临界值周围的可疑标本,可能存在感染性,应对这些可疑标本做进一步的检测,可选择性的应用核酸扩增及微流芯片分析法和化学发光免疫分析(CLIA)法等方法联合进行检测,以提高检测结果的准确性,以防误检和漏检。      

利用微流控芯片技术进行人类精子优选的效果分析

目的:通过使用微流控芯片技术对男性不育症患者的精子进行选择,观察该方法优选精子的效果。方法:选择80例男性不育症患者,选择其中精子活力a级+b级<35%的患者30例,分别采用自行设计和制造的微流控芯片进行优选以及采用改良后的上游法进行优选,对于剩余50例患者采用微流控芯片法进行优选,观察优选后精子活力、畸形率等参数。结果:50例患者经过微流控芯片优选后,精子活力显著提高,精子畸形率显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。对于30例中度弱精子症患者两种方法优选后精子活力显著提高、畸形率显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),且微流控芯片法优于改良后上游法。结论:微流控芯片法优选精子效率高、操作简便、对精子几乎无损害,适合在临床辅助生殖中普及和推广。     

微流控芯片技术分析细胞外酸性环境对肿瘤细胞P-糖蛋白表达、活性及其介导的道诺霉素细胞毒性的影响

目的 采用微流控芯片技术分析细胞外酸性环境对肿瘤细胞P-糖蛋白(P-gp)表达、活性及其介导的道诺霉素细胞毒性的影响。方法 在微流控芯片上将A549细胞分为实验组和对照组,实验组用pH为6.6酸性细胞培养液处理,对照组用pH为7.4中性培养液常规培养,芯片上进行细胞免疫荧光技术分析P-gp表达,罗丹明123外排实验评价P-gp活性,细胞存活/凋亡荧光染色法分析道诺霉素的细胞毒性。结果 微流控芯片可为A549细胞生长提供适宜的微环境,细胞在72 h后融合度能达到90%以上。酸性细胞培养液处理对P-gp表达未产生显著影响,但可显著增强P-gp活性,处理时间
6 h时A549细胞P-gp活性达到峰值。酸性细胞培养液处理6 h后道诺霉素细胞毒性效率显著降低,在P-gp抑制剂维拉帕米协同作用下道诺霉素细胞毒性得到逆转。结论 微流控芯片技术可缩短分析时间,降低试剂耗量,为进一步认识肿瘤多药耐药机制和高效肿瘤耐药逆转剂筛选提供新的技术平台。     

抗-HCV ELISA法检测结果在临界值附近的风险探讨

目的应用化学发光免疫分析（CLIA）法,检测抗-HCVELISA法结果在临界值附近（O．4≤S／CO〈1）的血清标本,探讨HCV感染的风险性。方法笔者对19份抗-HCVELISA法检测结果在临界值附近,胶体金法均阴性的血液标本,分别经抗．HCVELISA法试剂①、试剂②、胶体金法和CLIA法试剂进行了检测。结果HCV-CLIA法阳性16份、ELISA法试剂①和试剂②分别阳性5份9份,胶体会法阳性0份。cuA法与ELISA法和胶体金法比较检出率灵敏度显著高于ELISA法（P〈0．05或P〈0．01）和胶体金法（P〈0．01）。结论抗-HCVELtSA法检测结果在临界值附近的血液标本存在HCV感染的可能．尤其是献血者标本存在感染受血者的风险。对可疑标本应更进一步的应用丙型病毒性肝炎核心抗原检测法、CLIA法、核酸扩增和微流芯片法或RNART—PCR荧光定量法进行检测,以保证结果的准确性。