登革病毒HLA-A*0201限制性T细胞表位诱导免疫反应的研究

目的：探讨登革病毒（DENV）HLA-A*0201限制性T细胞表位诱导DENV血清型间交叉反应性T细胞的效应。方法：基于已鉴定DENV-1中HLA-A*0201限制性CD8+ T细胞表位（NS4b40-48TLYAVATTI）序列,合成在其他血清型中相似的候选表位,采用MHC-肽复合物稳定性实验检测候选表位与HLA-A*0201结合力。采用酶联免疫斑点（ELISPOT）实验研究已鉴定表位及候选表位免疫HLA-A*0201转基因小鼠产生的CD8+ T细胞识别相同及相似表位能力;采用ELISPOT实验研究不同DENV血清型感染HLA-A*0201转基因小鼠是否产生能识别已鉴定表位及候选表位的T细胞反应。结果：DENV-3中NS4b39-47TLYAVATTV与HLA-A*0201具高结合力,但DENV-2中NS4b39-47TLYAVATTF与HLA-A*0201结合力弱。DENV-1-NS4b40-48和DENV-3-NS4b39-47免疫的转基因小鼠脾、淋巴结和外周血中存在可识别DENV-1-NS4b40-48、DENV-2-NS4b39-47和DENV-3-NS4b39-47的交叉反应性CD8+ T细胞。在DENV-1,-2,-3感染的转基因小鼠体内也存在类似的T细胞反应。结论：DENV-3中NS4b39-47TLYAVATTV为新的CD8+ T细胞表位,该表位及已报道表位NS4b40-48TLYAVATTI均可诱导DENV血清型间交叉反应性CD8+ T细胞反应,二者有助于我们研究DENV血清型间交叉反应性CD8+ T细胞的功能以及用于评估DENV候选疫苗的T细胞免疫效应。     

1型登革病毒初次感染患者血清中和抗体的动态反应分析

目的研究感染登革病毒（DENV）后,机体DENV中和抗体产生的特点及其动态变化规律。方法采集2006年DENV-1初
次感染患者在发病2周之内的,以及同一组患者在2010年随诊期间的血清标本,用本实验室建立的以群特异性DENV NS1抗原
捕获ELISA为基础的,可同时测定4型DENV中和抗体的微中和试验（ELISA-MNT）,对这两组血清中的DENV中和抗体滴度
进行检测。这两组血清标本均检测了全部抗4型DENV的中和抗体。此外,2010年的血清标本还检测了抗3种不同毒株的
DENV-1（其中包括1株标准株和2株临床分离株）的中和抗体。结果2006年和2010年这两组不同时间段的血清标本对全部4
型DENV均可显示出一定程度的交叉中和抗体反应,其中,2006年的血清标本交叉中和抗体反应更为明显,表现为其最高的中
和抗体针对的甚至是DENV-2,而不是预计中的DENV-1;2010年的血清标本中最高的中和抗体滴度针对的是同型的
DENV-1。Mann-whitney U检验显示：对于同型的抗DENV-1中和抗体滴度,2010年的血清要明显高于2006年的血清（U=
86.500,P=0.000）,但异型中和抗体滴度在两组血清标本中无明显改变。Friedman检验显示,尽管同属DENV-1,但2010年的血
清标本对3种不同毒株的DENV-1的中和抗体滴度之间还是存在显著差异（χ2=12.123,P=0.002）。结论4型交叉中和抗体反应
是DENV感染后,尤其是在感染早期中和抗体的产生特点,但只有同型DENV中和抗体滴度可随时间的推移而发生明显的上
升;然而即使是同属于一种血清型,不同毒株之间的中和抗体也可能存在差异。
     

Ⅲ型登革病毒NS1单克隆抗体的制备及鉴定

目的 研制Ⅲ型登革病毒(DV3)非结构蛋白1(NS1)单克隆抗体,鉴定其血清型特异性.方法 以具有良好抗原性的重组DV3-NS1蛋白与DV3交替免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选阳性的杂交瘤细胞,并结合免疫荧光(IFA)和Weatern Blot对抗体的特异性进行鉴定.结果 经交替免疫法免疫Balb/c小鼠,共获得14株抗DV3-NS1单抗,其亚类测定1株为IgG2a,余为lgG1.其中3株特异性结合DV3及DV3-NS1蛋白,4株能同时结合4型登革病毒NS1蛋白,其余7株与其他3型登革病毒NS1蛋白存在交叉反应.结论 成功获得了针对DV3-NS1的特异性单抗及交叉性单抗,将为进一步研究登革病毒NS1蛋白的结构与功能及临床诊断试剂的研发奠定基础.     

登革病毒高度保守的HLA-A*1101限制性T细胞表位鉴定和体内免疫反应研究

目的：鉴定登革病毒2型（DENV-2）HLA-A*1101限制性T细胞表位并探讨其诱导的T细胞反应的特征。方法：基于DENV-2的氨基酸序列,采用T细胞表位预测软件预测HLA-A*1101限制性候选T细胞表位;基于HLA-A*1101转基因小鼠,采用ELISPOT实验、ELISA实验和CD8+T细胞（CTL）杀伤实验研究候选表位的HLA-A*1101限制性和所诱导的T细胞反应的特征。结果：在合成的14条候选表位中,9条肽（NS1161-170、NS1263-272、NS36-15、NS4b44-53、NS333-42、C58-67、E30-38、NS3576-584和NS4a72-80）免疫HLA-A*1101转基因小鼠可诱导产生肽特异性分泌IFN-γ的T细胞。除了分泌IFN-γ,C58-67和NS3576-584特异性T细胞也可分泌TNF-α,而E30-38特异性T细胞更可同时分泌TNF-α和IL-6。DENV-2感染的HLA-A*1101转基因小鼠体内也可检测到针对NS4b44-53、NS333-42、C58-67、E30-38、NS3576-584和NS4a72-80的分泌IFN-γ的T细胞。采用上述6条肽的混合物免疫HLA-A*1101转基因小鼠所诱导的效应细胞可显著杀伤DENV-2感染的小鼠脾单核细胞。结论：本研究鉴定出了9条全新的DENV-2特异性HLA-A*1101限制性T细胞表位。     

2014-2019年揭阳市登革病毒E基因序列分析

目的探讨揭阳市登革病毒(DENV)的分子特征并进行生物学溯源。方法收集2014-2019年揭阳市登革热流行期间登革热疑似和临床诊断病例的急性期血清,用实时荧光定量RT-PCR方法检测病毒核酸及分型,阳性标本进行病毒分离及鉴定,扩增并测定部分分离株E基因序列,用生物学软件进行序列比对分析并构建系统进化树。结果 896份急性期血清中DENV核酸阳性556份,阳性率为62.05%;血清型以DENV-Ⅰ为主(534例,占96.04%),其次为DENV-Ⅱ(18例,占3.24%)。序列分析显示,DENV-Ⅰ分离株基因型分属Ⅰ型和Ⅴ型,以Ⅰ型为主;DENV-Ⅱ分离株基因型均属于Cosmopolitan型。DENV-Ⅰ、DENV-Ⅱ分离株与周边地市、珠三角城市及东南亚国家流行株同源性较高。DENV-Ⅰ、DENV-Ⅱ分离株均属于弱毒株。结论 2014-2019年揭阳市登革病毒以血清Ⅰ型基因Ⅰ型为主,其次是血清Ⅱ型基因Cosmopolitan型;推测揭阳市登革热流行毒株多来源于周边地市、珠三角城市及东南亚国家。     

登革病毒NS1蛋白的原核表达及其在登革热快速诊断中的应用

【目的】重组表达1型登革病毒(DENV-1)和3型登革病毒(DENV-3)NS1蛋白,制备多克隆抗体,建立特异、敏感的登革病毒NS1抗原ELISA检测法。【方法】RT-PCR扩增DENV-1和DENV-3 NS1全长基因,经T-A克隆后,将目的基因分别与质粒PET30a(+)连接构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。阳性克隆经IPTG诱导表达,并对目的蛋白进行纯化。用纯化的NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗NS1多克隆抗体。应用NS1多克隆抗体建立登革病毒NS1抗原双抗体夹心ELISA检测法。【结果】成功构建了高效表达DENV-1和DENV-3 NS1蛋白的原核表达系统,获得纯化的NS1蛋白;用重组NS1蛋白免疫BALB/c小鼠后获得高效价(>1:30 000)的抗DENV-1和DENV-3 NS1的特异性抗体;用NS1多克隆抗体建立了登革病毒NS1抗原双抗体夹心ELISA检测法,该法可特异性检出登革病毒NS1抗原,敏感性达到1 ng/mL,与黄病毒的其它成员无交叉反应,表明具有良好的特异性。【结论】本研究成功构建了DENV-1和DENV-3 NS1蛋白的原核表达系统,高效表达了具有良好免疫原性及免疫反应性的DENV-1和DENV-3重组NS1蛋白;建立了检测登革病毒NS1抗原的双抗体夹心法,并证明该检测法具有较高的灵敏度和特异性,具有良好的应用前景。     

Ⅰ型登革病毒NS1蛋白特异性血清型单克隆抗体的制备及鉴定

目的研制Ⅰ型登革病毒(DEN1)非结构蛋白1(NS1)蛋白特异性单克隆抗体,鉴定其特异性。方法以具有良好免疫原性的DEN1重组NS1蛋白、DEN1全病毒及两者混合免疫共3种免疫方案,分别免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞经间接ELISA法双筛I、FA和Western Blot进行mAbs的类型及亚类、特异性等鉴定。结果采用3种免疫方案免疫Balb/c小鼠,获得9株抗NS1蛋白的mAb,其亚类测定一株为IgG2a,另外8株为IgG1。这些mAbs与DEN1重组NS1蛋白和DEN1全病毒均结合,而且特异性好,仅1株杂交瘤分泌的单抗和其余3型DEN有交叉反应。结论成功获得了特异性针对DEN病毒NS1蛋白的特异性血清型mAb,将为进一步研究NS1蛋白的结构和功能及临床诊断试剂研发奠定基础。     

登革病毒非结构蛋白NS1群特异性单克隆抗体的制备及初步应用

目的 制备登革病毒NS1群特异性单克隆抗体,建立可检测登革病毒1～4型NS1抗原的ELISA检测法,为登革热的早期快速诊断奠定基础.方法 应用毕赤酵母表达系统分泌表达登革病毒2型重组非结构蛋白NS1,以此为抗原免疫BABL/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,经HAT选择培养、间接ELISA筛选和亚克隆,获得能稳定分泌登革病毒NS1群特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株;用所获得的单克隆抗体建立可检测1～4型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA法.结果 从登革病毒2型NS1重组毕赤酵母(Pichia Pastoris-NS1)中获得了大量纯化的登革病毒重组NS1蛋白;经免疫小鼠、细胞融合、间接ELISA筛选及3次亚克隆后,最终获得2株能高效分泌抗登革病毒NS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D7B6B4和2D10E2F6,间接ELISA显示抗体效价高达1∶8 000～1∶16 000;ELISA及免疫荧光检测证实,其所分泌的抗体与1～4型登革病毒及其重组NS1蛋白均有特异性免疫反应,为登革病毒NS1群特异性单克隆抗体;两株单克隆抗体均为IgG2a亚类;初步建立了检测4个血清型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA法.结论 成功研制出两株能高效分泌抗登革病毒NS1群特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株.初步建立了可检测1～4型登革病毒NS1抗原的双抗体夹心ELISA检测法.     

Ⅰ~Ⅳ登革病毒基因同源性分析及Ⅱ型C蛋白二级结构预测

目的 对登革病毒（dengue virus,DENV）Ⅰ~Ⅳ基因同源性进行分析,同时对DENV Ⅱ C蛋白的二级结构进行预测,为更深入了解DENV 4个血清型间差异及衣壳蛋白C构想。方法 通过DNAMAN分子生物学分析软件和蛋白结构在线预测网站分别对登革病毒基因同源性及C蛋白的二级结构进行预测。结果 在登革病毒基因组同源性中,DENVⅠ与Ⅲ同源性最高为72%,发现DENVⅠ与Ⅳ同源性最低为67%;在登革病毒基因中,前膜基因prM的的同源性最高为82.5%,非结构基因NS2a的同源性最低为55.28%。在编码capsid的氨基酸中,占组成比例最多的为是精氨酸,可能存在的蛋白结合位点较多。结论 通过基因组同源分析图谱看出Ⅰ~Ⅳ DENV在结构基因（C、prM、E）之间和非结构基因NS1,NS2b和NS3中的同源性较高,同时蛋白二级结构预测发现DENV ⅡC蛋白可能具有分子识别和蛋白骨架等功能。     

基于数字全息显微术的登革病毒感染C6/36细胞的3D形态学

目的 应用一种基于数字全息显微术的活细胞成像技术,监测登革病毒(DENV)感染C6/36细胞过程中3D形态学变化,分析病毒吸附和释放触发的系列细胞形态改变方向及强度,通过不同血清型间变化差异为深入研究相关感染机制提供线索.方法 6孔板中接种不同密度的C6/36细胞,以确定全息细胞成像仪下最佳成像密度;随后由28℃常规培养调节为37 ℃病毒培养条件,以分析培养环境改变对细胞状态的影响;4个血清型DENV感染C6/36细胞,在孵育2h和培养24 h期间分别设计5个观察点;借助HoloMonitor M4全息细胞成像及分析系统记录相应三维全息图及相关形态学参数并应用软件进行统计学分析.结果 4× 105接种量下,C6/36细胞全息图显示单个细胞三维形态表现统一,细胞面积、厚度和体积离散程度均最小(P＜0.05),确定其为最佳成像密度;转移至37℃、5％ CO2培养24 h后细胞厚度、面积和体积改变无显著性差异(P＞0.05);孵育和培养期间4个血清型DENV组细胞面积和体积增大表现一致,但孵育期间DENV l-4均表现细胞厚度减小不同,培养期间DENV1、2细胞厚度减小而DENV3、4出现截然相反的厚度增大现象.同时,不同血清型间变化趋势及程度具有各自特异性.结论 成功运用此技术实时监测登革病毒感染形态学变化过程;不同时期4个血清型间特异性细胞病变现象存在差异,对登革病毒感染机制研究具有一定的指导意义.     

Discovery of fifth serotype of dengue virus (DENV-5): A new public health dilemma in dengue?control

Dengue fever is a re-emerging public health problem with two-fifths of the world population being at risk of infection. Till now, dengue fever was believed to be caused by four different serotypes. The fifth variant DENV-5 has been isolated in October 2013. This serotype follows the sylvatic cycle unlike the other four serotypes which follow the human cycle. The likely cause of emergence of the new serotype could be genetic recombination, natural selection and genetic bottlenecks. There is no indication of the presence of DENV-5 in India. Recent clinical trials with the promising Chimerivax tetravalent vaccine suffered a setback. Discovery of DENV-5 and more such sylvatic strains in future may further impede the Dengue Vaccine Initiative. Integrated Vector Management holds the key to sustainable dengue control. Further epidemiological and ecological studies are needed to detect additional sylvatic dengue strains.     

西双版纳州2016年登革1型和2型病毒疫情的流行病学调查

目的 了解云南省西双版纳州2016年登革热流行特征和登革病毒血清型、基因型及其传播来源.方法 收集登革热病例资料,采集患者急性期血清标本,用RT-PCR法检测登革病毒核酸,并进行登革病毒C/PrM区核苷酸序列测定和进化分析.结果 2016年西双版纳州共确诊登革热病例53例,其中本地感染病例24例(勐腊县21例和景洪市3例),输入性病例29例(来自缅甸24例和老挝5例).流行月份为7-11月.病例年龄以20～49岁组为主,男女性别比为1.9∶1.蚊媒监测景洪5-10月布雷图指数(Breteau index,BI)为8.4～21,勐腊6-10月BI为7.6～18.2,勐海县9-10月BI为8.4～8.8,其它月份BI均小于5.从患者血清中获得13株登革病毒的C/PrM区基因核苷酸序列,进化分析表明,10株为登革病毒血清型1型(DENV-1)中的基因Ⅰ型(Genotype-Ⅰ,G-Ⅰ),3株为登革病毒血清型2型(DENV-2)的亚洲基因Ⅰ型(Asian genotypeⅠ,AG-Ⅰ),均为东南亚地区的优势基因型.无论DENV-1或DENV-2均与近几年云南省瑞丽市、临沧市和东南亚地区的同型流行株具有较近的亲缘关系.结论 西双版纳州2016年发生了包括本地和输入性病例并存的DENV-1 G-Ⅰ和DENV-2 AG-Ⅰ流行,并证实相邻的缅甸和老挝边境地区存在这两种血清型登革病毒流行,来自缅甸和老挝的输入性病例是引起西双版纳本地流行的主要原因.此为西双版纳首次发生DENV-1和DENV-2 AG-Ⅰ的本地流行.     

Molecular epidemiology of dengue in Jamaica dengue virus genotypes in Jamaica, 2007

The genotypes of dengue viruses (DENV) isolated from patients with dengue in Jamaica during 2007 were determined using DNA sequencing and phylogenetic analysis of the C-prM gene junction. The 17 DENV analysed included strains of DENVserotypes 1 (DENV-1, n = 3), DENV-2 (n = 7) and DENV-4 (n = 7). All strains ofDENV-1 were classified as genotype III, while 1 of 7 strains of DENV-2 belonged to the Asian American/Asian genotype, genotype I/III (Jamaica genotype), 2 were genotype V, the American genotype and 4 strains clustered with reference strains belonging to genotype IV. The 6 DENV-4 strains from Jamaica and the control strain clustered together in a separate clade from Caribbean/American reference strains, which belong to genotype II and Asian strains, classified as genotypes I and III. There has been little evolution in the DENV-1 strains circulating in Jamaica over the years and this might reduce the risk of outbreaks due to this serotype. In contrast, the high genetic diversity in strains of DENV-2 viruses in circulation, the presence of more recently introduced genotypes and a new clade of DENV-4 might contribute to the epidemic potential of these DENV serotypes. These preliminary data clearly indicate the need to maintain laboratory surveillance, and other control measures against hyperendemicity of dengue in Jamaica.     

登革2型病毒及其NGC株、M株E基因的原核蛋白对HUVEC通透性的影响

目的：研究登革2型病毒（DENV-2）、登革2型病毒国际参考株（NGC）E基因1-476序列原核蛋白、登革2型病毒贵州蚊虫分离株（M）E基因1476序列原核蛋白对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）通透性的影响.方法：将DENV-2 M株和NGC株E基因1-476序列原核表达产物及DENV-2接种于HUVEC单层细胞,用tran-swell法检测HUVEC的通透性,透射电镜观察细胞超微结构的改变.结果：DENV-2、NGC株E基因的原核蛋白、M株E基因的原核蛋白分别在30 min、3h、12 h时对HUVEC通透性的影响最为明显,透射电镜结果显示有细胞超微结构的改变.结论：DENV-2、DENV-2 NGC株E基因原核蛋白、M株E基因原核蛋白对HUVEC通透性、细胞超微结构有明显影响.     

登革1型病毒GZ2002株全基因组测序与分析

目的对2002年分离自广州登革热患者的1型登革病毒GZ2002株进行全基因组序列测定及分析,为探讨其来源和基因组特征提供依据。方法利用C6/36细胞增殖GZ2002株,出现典型细胞病变后收集感染细胞及病毒液提取R NA。根据5株登革病毒1型标准株AY145123、FJ176780、FJ176779、DVU88536、EF025110全序列设计6对相互覆盖的引物。采用R T-PCR法扩增覆盖GZ2002株基因组全长的6个cDNA片段,并将其分别克隆到pMD-18T载体上,通过序列测定和重叠序列拼接获得全基因组序列。结果 GZ2002株基因组全长10 735 nt,单一阅读框长10 176 nt,推测编码3 392个氨基酸,5’及3’-UTR分别为94 nt和462 nt,无显著的密码子偏嗜性。GenBank登录号:JN205310。系统进化分析显示GZ2002株属于DENV-1型基因IV型。比较不同致病性的DENV-1型毒株发现,随DENV毒株致病力的增强,编码区氨基酸突变位点明显增多。GZ2002株、泰国16007株、柬埔寨株及印度尼西亚98901530株的5’-UTR二级结构高度保守,3’-UTR分析显示强毒力泰国16007株与柬埔寨株均存在高突变区。结论 GZ2002株属于DENV-1型基因IV型,可能与1998年印度尼西亚DENV-1流行株相关,编码区株特有氨基酸变异位点及3’-UTR高突变区的生物学意义值得进一步探讨。     

应用单管巢式多重PCR技术检测登革病毒及分型

目的建立一种单管巢式多重RT-PCR方法,以用于临床对于不同型别登革病毒混合感染的检测并分型。方法将1~4型登革病毒RNA混合,首先用1~4型病毒通用外引物进行一步法RT-PCR,然后以混合病毒RT-PCR产物为模板,在同一反应管内同时加入4对(5条)型特异性引物进行巢式多重PCR,结果用EB染色的3%琼脂糖凝胶电泳观察;并将其检测敏感性和特异性与该方法的单一病毒模板RNA扩增进行比较。结果经反应条件的优化,混合病毒模板单管巢式多重PCR可以在同一反应管内同时扩增出4条病毒特异性目的条带,分别为482、119、290、389 bp。其敏感性和特异性与单一病毒RNA的扩增相当,对模板RNA检测的敏感性可以达到66.068 copies/μl。结论该方法简便、快速、敏感、特异,可以根据扩增目的片段的大小进行诊断和分型,对于临床登革病毒混合感染病例的诊断和快速分型有应用价值。