大鼠血红素加氧酶-1基因在乳酸乳球菌中的表达

目的:在乳酸乳球菌中表达大鼠血红素加氧酶-1(HO-1)基因。方法:采用RT-PCR技术从大鼠脾总RNA中分离扩增血红素加氧酶HO-1基因,将该基因克隆进pGEM-Teasy质粒中,转化大肠杆菌DH5α提取质粒,鉴定HO-1基因。酶切后与pSEC质粒连接,经电击转化,将重组质粒转入乳酸乳球菌NZ9000中,转化子在含有氯霉素的脑心浸液培养基上培养。用nisin诱导HO-1表达,SDS-PAGE、Westernblot鉴定表达产物,并采用分光光度法测定HO-1活性。结果:表达产物相对分子量约为32kU,表达量约为7.0mg/L,HO-1活性为2.386U/(mg·h)。结论:乳酸乳球菌能够表达具有生物活性的大鼠HO-1。     

构建及鉴定表达胃泌酸调节素的乳酸乳球菌

目的:构建食品级表达胃泌酸调节素(oxyntomodulin,OXM)的乳酸乳球菌,鉴定其在体外?体内的表达水平?方法:构建重组质粒pNZ8149-OXM电转至乳酸乳球菌中,用Western blot检测重组乳酸乳球菌OXM表达水平?给小鼠喂食表达OXM的乳酸乳球菌后,用液质联用质谱检测小鼠血清OXM的含量?结果:重组质粒经测序鉴定正确,制备的重组乳酸乳球菌在nisin诱导5 h后OXM表达量最高,食用后小鼠血清OXM含量是对照组的2.5倍左右?结论:成功构建了表达胃泌酸调节素的乳酸乳球菌,为进一步探讨其减肥降脂效应提供了基础?     

重组hGM-CSF乳酸链球菌的构建及初步验证

目的 运用基因克隆技术将自行合成的人粒-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)转化于乳酸链球菌.并筛选获得高表达重组hGM-CSF的乳酸链球菌稳定株.方法 将经过优化适合在乳链菌表达的hGM-CSF基因克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽、终止密码子的pNBC1000载体,得到重组质粒pNCSF,然后将pNCSF进一步克隆于穿梭载体pTR1001c,获得乳链菌表达载体pTRCSF,通过电穿孔转化于乳链菌,并通过聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳验证hGM-CSF的表达.结果 获得了重组质粒pNCSF并经酶切鉴定和测序证实.酶切鉴定显示构建乳链菌表达载体pTRCSF及重组hGM-CSF乳链菌成功,蛋白电泳初步验证获得了高表达重组hGM-CSF的乳链菌株LL-CSF.结论 运用基因克隆技术成功构建了重组乳酸链球菌LL-CSF,为进一步研究重组hGM-CSF的生物学特性及评价其潜在临床.应用价值打下了基础.     

含有RU486诱导系统的IL-2基因表达质粒的构建及功能鉴定

目的： 构建含有RU486诱导系统的小鼠白细胞介素2 (IL-2) 基因表达质粒,研究RU486系统对IL-2基因表达的调控作用。方法： 用限制性内切酶Cla Ⅰ处理含有RU486诱导系统的质粒pRS17和编码IL-2基因的质粒pUC57-IL-2,将IL-2基因插入到pRS17构建pRS-IL-2;通过PCR及限制性酶切鉴定重组质粒;将重组质粒体外转染SMMC-7721细胞,用不同浓度的RU486进行处理;将重组质粒通过水流动力学注射法注射到小鼠体内,腹腔注射RU486进行诱导;通过ELISA方法检测细胞上清及血清中IL-2基因的表达。结果： 重组质粒pRS-IL-2经过限制性内切酶消化及PCR分析,显示了预期的片段。细胞在1×10-8 mol?L-1的RU486诱导下,IL-2表达水平最高,是无RU486组的1.95倍（P<0.001）。注射质粒后,接受RU486诱导的小鼠血清中IL-2水平较诱导前升高320倍,而未接受RU486的小鼠血清未检测到IL-2的表达。结论：成功构建了含有RU486诱导系统的IL-2基因表达质粒,IL-2基因的表达依赖于诱导剂RU486的存在。     

人颗粒溶素活性肽和小鼠白细胞介素-12基因真核穿梭共表达质粒的构建与真核表达

目的 构建含分枝杆菌复制子Orim,可分泌表达人颗粒溶素相对分子质量为9 000的活性肽与小鼠白细胞介素-12(mIL-12)的真核穿梭共表达质粒,并检测其蛋白表达.方法 以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板,通过PCR扩增获得相对分子质量为9 000的颗粒溶素活性肽基凶片段后,定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,获得重组表达质粒pBudCE4.1-S9K,经双酶切及插入片段测序对质粒进行鉴定.同时,将mIL-12哑克隆入pBudCE4.1另一多克隆位点,构建真核共表达质粒pBudCE41-S9K/mIL-12.然后,将分支杆菌复制子Orim亚克隆入真核共表达质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12,形成穿梭共表达质粒.采用RT-PCR、免疫细胞化学法,检测颗粒溶素活性肽在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌.ELISA检测mIL-12的表达.结果 酶切、PCR及测序鉴定证实,颗粒溶素活性肽基因插入片段正确;RT-PCR和免疫细胞化学检测表明其可以在细胞中瞬时表达;ELISA检测细胞培养上清有mIL-12表达.结论 成功构建穿梭共表达质粒pBM9,并能体外表达.     

小鼠IL-5真核表达质粒的构建和体外表达

目的 构建小鼠白细胞介素-5（IL-5）基因真核表达质粒,了解该质粒在真核细胞COS细胞中有效表达情况.方法 以含有小鼠IL-5基因的克隆质粒pORF9-mIL-5为模板,通过PCR扩增小鼠IL-5全段基因,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入peDNA3.1（＋）真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-m IL-5,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染COS细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果 成功扩增了小鼠IL-5全长基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-m IL-5,Westem blot方法证实该质粒能在COS真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白.结论 成功构建了小鼠IL-5基因的真核表达质粒载体,为进一步研究IL-5的新功能和免疫基因治疗奠定了基础.     

口服含pMG36E-P30重组质粒的乳酸乳球菌对小鼠免疫应答的影响

目的用含pMG36E-P30重组质粒的乳酸乳球菌口服免疫小鼠,观察其所诱导的小鼠细胞及体液免疫类型。方法BABL/C小鼠随机分成疫苗免疫组、乳球菌对照组、生理盐水组,每次分别饲喂5×10^9个悬浮在缓冲液中的重组乳酸乳球菌、不含重组质粒的乳酸乳球菌及等体积生理盐水。于第27、34及48天从鼠尾静脉取血,分离血清,ELISA法检测免疫球蛋白G（IgG）、γ干扰素（INF-γ）、白细胞介素4（IL-4）水平。结果疫苗免疫组IgG水平与乳球菌对照组、生理盐水组比较差异有显著性（F=134.97,q=20.33、19.90,P〈0.01）。疫苗免疫组INF-γ、IL-4水平与生理盐水组及乳球菌对照组比较差异均有显著意义（F=79.20、17.05,q=6.18-16.79,P〈0.01）。结论该口服疫苗能引起小鼠特异性的体液免疫反应并能促进细胞免疫应答。     

非融合表达β-半乳糖苷酶的重组乳酸乳球菌的构建和性能研究

目的 构建能非融合表达高活性β-半乳糖苷酶的重组乳酸乳球菌,并对其酶活性和分泌性能进行研究.方法 提取能在大肠杆菌中非融合表达德氏乳杆菌保加利亚亚种β-半乳糖苷酶的重组质粒pMG36e-lacZ 1.1480和pMG36e-lacZ wch9901,电转化乳酸乳球菌乳酸亚种MGl363.测定重组菌在不同培养时间和乳糖浓度下的β-半乳糖苷酶活性,及在不同培养条件下的酶分泌率.结果 携带pMG36e-lacZ wch9901的重组乳酸乳球菌(MG1363/pMG36e-lacZ wch9901)具最高酶活性,其β-半乳糖苷酶活性达(16.95±0.09)U/mg pro,为基因初始菌的2.75倍;重组乳酸乳球菌培养24 h产酶达高峰;培养基含乳糖时,重组菌酶活测定结果表现为降低;重组乳酸乳球菌表达的β-半乳糖苷酶可分泌到培养基中,当培养基不含红霉素,而含20 g/L乳糖时,分泌率最高,达(27.09±0.05)%.结论 获得了能非融合表达和分泌高活性β-半乳糖苷酶的重组乳酸乳球菌,可在此基础上进一步研制β-半乳糖苷酶活菌释放体.     

乳酸菌中幽门螺杆菌ureB基因的食品级表达与优化

目的:以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)为宿主菌构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)尿素酶B(UreB)的食品级表达系统.方法:从重组质粒pMD19-T-ureB上酶切得到ureB基因片段,与含有筛选标记lacF基因的L.lactis表达载体pN...     

小鼠组织因子原核质粒的构建和重组蛋白的表达

目的 体外扩增小鼠组织因子基因cDNA序列,构建小鼠组织因子重组原核表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达.方法 根据基因库提供的基因序列设计克隆扩增小鼠组织因子cDNA基因序列的引物,利用原位反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增获得小鼠组织因子cDNA基因,通过内切酶酶切和T7酶连接,将小鼠组织因子cDNA序列插入原核表达质粒pQE30多克隆位点中.筛选的重组质粒经酶切和DNA序列测定证实正确后,转染感受态大肠杆菌,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹法进行鉴定.结果 琼脂糖凝胶电泳发现扩增的小鼠组织因子cDNA序列相对分子量大小和预期值相一致,重组质粒酶切结果和预期值相符,DNA序列测定显示质粒的目的基因阅读框架准确无误.用IPTG诱导可以有效诱导重组蛋白质在大肠杆菌中表达,表达的重组蛋白质相对分子量与预期值相一致.结论 成功构建了小鼠组织因子的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导了有效表达,为将组织因子应用于治疗和功能研究奠定了基础.     

乳链菌肽抗性基因的筛选、分离及鉴定

目的 筛选、分离、鉴定乳链菌肽抗性（NSR）基因。方法 从20份经巴氏消毒的牛奶及未经任何处理的若干新鲜牛奶的混合样品中．在含有添加剂的选择性培养基上筛选含有NSR基因的乳酸乳球菌，用乳酸乳球菌特异性16S rRNA的PCR方法对菌株进行鉴定，进一步用一段保守序列进行NSR基因筛选，并扩增其全序列，分析其基因特征。结果 两种牛奶样品中均可以分离到乳酸乳球菌，并在从新鲜牛奶中分离到的乳酸乳球菌中筛选出30株乳链菌肽抗性菌株，其中3株扩增出NSR基因．琼脂糖凝胶电泳确定其大小为1000bp左右，进一步酶切鉴定及测序确定其确为NSR基因，定位于质粒上。结论 从来源于鲜牛奶的抗乳酸乳球菌菌株中扩增出完整NSR基因，定位于质粒上。     

Non-Fusion and Fusion Expression of β-Galactosidase from Lactobacillus bulgaricus in Lactococcus lactis

Objective To construct four recombinant Lactococcus lactis strains exhibiting high β-galactosidase activity in fusion or non-fusion ways, and to study the influence factors for their protein expression and secretion. Methods The gene fragments encoding β-galactosidase from two strains of Loctobacillus bulgaricus, wch9901 isolated from yogurt and 1.1480 purchased from the Chinese Academy of Sciences, were amplified and inserted into lactococcal expression vector pMG36e. For fusion expression, the open reading frame of the β-galactosidase gene was amplified, while for non-fusion expression, the open reading frame of the β-galactosidase gene was amplified with its native Shine-Dalgarno sequence upstream. The start codon of the β-galactosidase gene partially overlapped with the stop codon of vector origin open reading frame. Then, the recombinant plasmids were transformed into Escherichia coli DH5α and Lactococcus lactis subsp, lactis MG1363 and confirmed by determining β-galactosidase activities. Results The non-fusion expression plasmids showed a significantly higher β-galactosidase activity in transformed strains than the fusion expression plasmids. The highest enzyme activity was observed in Lactococcus lactis transformed with the non-fusion expression plasmids which were inserted into the β-galactosidase gene from Lactobacillus bulgaricus wch9901. The β-galactosidase activity was 2.75 times as high as that of the native counterpart. In addition, β-galactosidase expressed by recombinant plasmids in Lactococcus lactis could be secreted into the culture medium. The highest secretion rate （27.1%） was observed when the culture medium contained 20 g/L of lactose. Conclusion Different properties of the native bacteria may have some effects on the protein expression of recombinant plasmids. Non-fusion expression shows a higher enzyme activity in host bacteria. There may be a host-related weak secretion signal peptide gene within the structure gene of Lb. bulgaricus β-galactosidase, and its translation pr     

破伤风毒素C片段在乳链菌内的表达

目的：构建破伤风毒素C片段(TETC)乳链菌表达载体,并验证其生物活性。方法: 将采用基因拼接方法获得的TETC基因从测序正确的质粒pBS-TETC上以Sal I、Hind Ⅲ切下,分别定向连接到以Xho I、 Hind Ⅲ酶切的质粒分泌表达的乳链菌表达载体pNBC1000和膜锚定表达的乳链菌表达载体pNBC2000。电穿孔转化乳链菌,分别提取分泌蛋白及膜锚定蛋白,通过蛋白电泳及Western-blot检测蛋白定位表达情况。结果：构建了分泌表达及锚定表达TETC的乳链菌表达载体pNBCL1002与pNBCL2002,电穿孔转化乳链菌获得了分泌表达及膜锚定表达TETC的乳链菌,SDS-PAGE分析显示分泌表达的TETC大小约为57.8kDa,表达量占总体蛋白的8.06%、上清蛋白的9.82%,锚定表达的TETC大小约为73.5 kDa的表达蛋白,表达量占总体蛋白的10.7%,膜蛋白的17.9%; Western-blot检测显示所表达的TETC均可与破伤风抗毒素血清发生免疫印迹。结论：成功构建了TETC乳链菌表达载体,并在乳链菌内表达了TETC,并初步验证了表达的TETC的免疫反应性,这一结果可能为进一步研究生物佐剂及防治破伤风疫苗奠定了基础。     

乳链菌肽nisin Z的pH吸附法分离纯化技术研究

通过 p H吸附法 ,利用乳酸链球菌亚种 N8(L actococcus lactis subsp. lactis N8)和乳酸链球菌亚种ATCC1145 4,研究了 nisin Z分子在不同 p H环境下的吸附作用及其分离纯化效率 ,并经麦黄酮 SDS- PAGE和 RP- HPL C纯度鉴定 ,证实用此技术分离 nisin Z具有高效高纯度、操作简便等良好特征。nisin在 p H6 .5吸附率达 10 0 % ,p H3以下完全释放。该技术可望开辟对 nisin等微生物分泌性蛋白的分离纯化新途径。     

Construction and Secretory Expression of β-Galactosidase Gene from Lactobacillus Bulgaricus in Lactococcus Lactis

Objective This study is to examine the secretion effects of β-galactosidase in Lactococcus lactis.Methods The usp45 and β-galactosidase genes were cloned and inserted into plasmid pMG36e to obtain the recombinant plasmid pMG36e-usp-lacZ.This recombinant plasmid was transformed into both Escherichia coli DH5α and L.lactis MG1363.The enzyme activity,gene sequencing,SDS-PAGE and hereditary stability were assessed and studied.Results The lacZ gene inserted into plasmids pMG36e-usp-lacZ was 99.37％ similar to the GenBank sequence,and SDS-PAGE revealed an evident idio-strap at 116 KDa between L.lactis MG1363/pMG36eusp-lacZ in both supernatant and cell samples.β-Galactosidase activity measured 0.225 U/mL in L.lactis pMG36e-usp-lacZ transformants,and its secretion rate was 10％.The plasmid pMG36e-usp-lacZ appeared more stable in MG1363.Conclusion The authors concluded that these new recombinant bacteria well expressed and secreted β-galactosidase,indicating that the β-galactosidase expression system was successfully constructed,and this might provide a new solution for management of lactose intolerance specifically and promote the use of gene-modified organisms as part of the food-grade plasmid in general.