shRNA 沉默YAP基因对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨慢病毒干扰载体沉默Yes-相关蛋白（Yes-associated protein,YAP）对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响。方法：用细胞免疫荧光法检测肾癌786-O细胞中YAP蛋白表达情况;构建针对YAP基因的shRNA慢病毒干扰载体转染786-O细胞。RT-PCR和Western blot分别检测干扰786-O细胞前后 YAP mRNA及蛋白的表达情况;CCK-8（cell counting kit-8）法检测沉默YAP后细胞增殖的改变;流式细胞仪（flow cytometry,FCM）检测细胞凋亡和周期的变化。结果：786-O细胞中YAP蛋白表达于细胞浆和细胞核;shRNA-YAP慢病毒干扰载体转染4 d后,可明显下调786-O细胞YAP mRNA及蛋白表达水平（P=0.000）,并且明显抑制细胞增殖和促进细胞凋亡（P=0.000）;细胞周期紊乱,G1 期细胞明显增加,S期细胞明显降低（P=0.000）。结论：YAP-shRNA慢病毒干扰载体能有效抑制YAP基因在786-O细胞中表达,进而抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。     

沉默Yes相关蛋白1对人非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭的影响

目的 研究Yes相关蛋白1(YAP1)在非小细胞肺癌细胞增殖、细胞周期、迁移、侵袭中的作用.方法 通过慢病毒介导的小干扰RNA靶向抑制人非小细胞肺癌细胞株A549中YAP1基因的表达,采用CCK-8法、流式细胞术分别检测沉默YAP1对A549细胞增殖及凋亡周期的影响,Transwell实验观察沉默YAP1对A549细胞迁移、侵袭能力的影响.结果 沉默YAP1后,A549细胞YAP1 mRNA和蛋白表达均下调(P＜0.01),CCK-8实验结果显示沉默YAP1抑制A549的增殖、增加G0/G期的细胞比例(P＜0.01),Transwell实验结果示沉默YAP1抑制A549细胞的迁移、侵袭(P＜0.01).结论 沉默YAP1基因对非小细胞肺癌细胞的恶性生物学特征具有抑制作用,YAP1可能成为肺癌治疗的潜在靶标.     

慢病毒介导HIF-1α沉默对缺氧肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响

目的:构建缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体,观察慢病毒介导的HIF-1α基因沉默对体外模拟缺氧条件下的肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及其机制。方法:设计合成1条针对HIF-1α基因的shRNA干扰序列,构建于慢病毒载体质粒GV248中,转染293T细胞包装产生慢病毒,转染人肝癌细胞株HepG2细胞,嘌呤霉素筛选出稳定转染的细胞株。将HepG2细胞分为正常对照组、干扰对照组(转染NC-shRNA)、干扰组(转染HIF-1α-shRNA),应用化学缺氧法(150μmol/L CoCl2)模拟肿瘤细胞缺氧微环境,应用Western Blot检测HepG2细胞中HIF-1α蛋白表达证实基因沉默效果,CCK-8检测沉默HIF-1α基因对HepG2细胞增殖的影响,Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒和流式细胞仪检测沉默HIF-1α基因对细胞凋亡的影响。Western Blot检测HepG2细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和细胞质细胞色素C(Cyt-C)表达的变化。结果:①成功构建HIF1α-shRNA慢病毒载体并转染HepG2细胞,缺氧培养细胞24h后,与正常对照组及干扰对照组相比,干扰组细胞内HIF-1α蛋白表达明显降低(P<0.01),证实慢病毒载体能够有效沉默HIF-1α基因。②沉默HIF-1α基因后缺氧培养的HepG2细胞增殖率下降(P<0.05),而细胞凋亡比例升高(P<0.01)。③Western Blot结果显示,与正常对照组及干扰对照组相比,沉默HIF-1α基因后细胞内凋亡相关蛋白Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9和细胞质Cyt-C表达上调(P<0.05或P<0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.01),Bax/Bcl-2蛋白表达比例升高。结论:通过shRNA慢病毒载体途径可有效沉默缺氧HepG2肝癌细胞HIF-1α基因,HIF-1α沉默能显著抑制缺氧HepG2细胞增殖活性,促进细胞凋亡,其凋亡途径可能与激活内源性线粒体凋亡通路有关。     

SPAG6基因RNAi慢病毒载体的构建及其对SKM-1细胞凋亡的影响

目的 构建SPAG6-shRNA慢病毒载体靶向沉默SPAG6基因,探讨SPAG6基因沉默对人骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)细胞株SKM-1细胞增殖及凋亡的影响.方法 设计并构建3条针对SPAG6基因的shRNA质粒表达载体,共转染293T细胞后得到可表达SPAG6基因RNAi的慢病毒载体.转染SKM-1细胞,利用流式细胞术检测转染效率,qRT-PCR及Western blot验证SPAG6基因干扰效果,筛选最佳靶点.CCK-8法检测SPAG6基因沉默对SKM-1细胞生长的影响,流式细胞术检测细胞凋亡.结果 成功构建SPAG6-shRNA慢病毒载体,流式细胞术检测转染效率均在60％以上.qRT-PCR及Western blot检测结果显示SPAG6-shRNA3慢病毒载体敲除效率最高,为最佳靶点.SPAG6基因干扰后,干扰组SKM-1细胞的增殖明显受抑,抑制率为(60.18 ±0.37)％,与阴性对照组相比差别有统计学意义(P＜0.05).干扰组SKM-1细胞凋亡率为(16.32±5.80)％,显著高于阴性对照组[(4.28±0.88)％,P =0.024]及空白对照组[(3.08±1.50)％,P=0.019].结论 SPAG6-shRNA慢病毒载体能有效降低SPAG6基因表达水平,抑制SKM-1细胞增殖并促进其凋亡.     

shRNA干扰沉默Mcl-1基因对淋巴瘤细胞系增殖的影响

目的研究慢病毒介导的髓细胞白血病基因(Mcl-1)短发夹状RNA(shRNA)干扰对淋巴瘤细胞系SNK-6增殖和凋亡的影响。方法设计以Mcl-1为靶点的shRNA并构建携带此shRNA的慢病毒载体,转染淋巴瘤细胞系SNK-6,荧光定量PCR(qPCR)及Western blot方法检测病毒感染前后Mcl-1 mRNA及蛋白表达变化,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)和流式细胞仪分析细胞增殖和凋亡变化的情况。结果成功构建Mcl-1-shRNA慢病毒表达载体,并可有效感染淋巴瘤细胞株SNK-6,感染后SNK-6细胞Mcl-1基因的mRNA水平及蛋白水平表达明显下调,MTT法检测显示慢病毒介导的Mcl-1基因shRNA干扰与对照病毒组相比可明显抑制SNK-6细胞增殖[(31.6±3.3)%vs(5.8±2.7)%,P<0.01],流式细胞仪测定感染后细胞凋亡明显高于对照病毒组[(28.9±2.1)%vs(5.3±1.5)%,P<0.01]。结论慢病毒介导的Mcl-1基因shRNA干扰技术可特异性阻断SNK-6细胞Mcl-1基因的表达,抑制细胞的增殖并促进细胞的凋亡。     

Effect of shRNA interference targeting myeloid leukemia-1 gene on proliferation in lymphoma cell line

目的 研究慢病毒介导的髓细胞白血病基因(Mcl-1)短发夹状RNA(shRNA)干扰对淋巴瘤细胞系SNK-6增殖和凋亡的影响.方法 设计以Mcl-1为靶点的shRNA并构建携带此shRNA的慢病毒载体,转染淋巴瘤细胞系SNK-6,荧光定量PCR(qPCR)及Western blot方法检测病毒感染前后Mcl-1 mRNA及蛋白表达变化,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)和流式细胞仪分析细胞增殖和凋亡变化的情况.结果 成功构建Mcl-1-shRNA慢病毒表达载体,并可有效感染淋巴瘤细胞株SNK-6,感染后SNK-6细胞Mel-1基因的mRNA水平及蛋白水平表达明显下调,MTT法检测显示慢病毒介导的Mcl-1基因shRNA干扰与对照病毒组相比可明显抑制SNK-6细胞增殖[(31.6±3.3)％vs(5.8±2.7)％,P＜0.01],流式细胞仪测定感染后细胞凋亡明显高于对照病毒组[(28.9±2.1)％vs(5.3±1.5)％,P＜0.01].结论 慢病毒介导的Mcl-1基因shRNA干扰技术可特异性阻断SNK-6细胞Mel-1基因的表达,抑制细胞的增殖并促进细胞的凋亡.     

MRPS23 shRNA对乳腺癌细胞Walker256增殖凋亡的作用及机制

目的:探讨线粒体核糖体蛋白MRPS23 shRNA对大鼠乳腺癌细胞Walker256增殖和凋亡的作用及机制。方法:构建含有MRPS23基因沉默片段(sh MRPS23)和对照shRNA的慢病毒载体(sh Ctrl),感染Walker256细胞48 h,以确定转染效率和基因沉默效率。MTS、TUNEL法检测其对Walker256细胞的增殖凋亡率的影响;RTPCR、western blot法检测细胞增殖和凋亡相关基因与蛋白表达水平。结果:与control组以及对照病毒组相比,sh MRPS23能显著抑制MRPS23基因及蛋白的表达,MRPS23基因沉默后能抑制Walker256细胞增殖,并促进细胞凋亡;p21WAF1、p53表达增高(P<0.05)。结论:慢病毒介导的MRPS23 shRNA可以通过上调p21WAF1抑制Walker256细胞增殖,MRPS23 RNAi可诱导细胞p53依赖性的凋亡。     

SIRT1基因shRNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖的影响

目的：探讨慢病毒介导沉默信息调节因子1（silent information regulator 1,SIRT1）基因的 shRNA对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响。方法：设计、合成2对针对SIRT1基因shRNA的寡核苷酸序列,与pLentilox3.7-GFP载体连接产生重组慢病毒质粒pshSIRT1-1、pshSIRT1-2,同时构建不针对任何基因的shRNA阴性对照pshCont。将表达shRNA的载体plentilox3.7与pLP1、pLP2和pLP/VSVG 3种质粒共转染293FT细胞,包装产生慢病毒并测定病毒滴度。将慢病毒感染人乳腺癌细胞MCF-7,行real time-PCR和Western blot验证SIRT1基因的沉默效果,台盼蓝排斥实验和流式细胞仪分别检测其对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响。结果：成功构建靶向SIRT1基因shRNA慢病毒载体并获得了相应的慢病毒。2个靶向 SIRT1的shRNA均能有效抑制SIRT1基因的表达（P=0.000 2）,并使MCF-7细胞增殖明显减慢,凋亡明显增加（P=0.006 0）。结论：靶向SIRT1基因RNA干扰能显著抑制 MCF-7 细胞的生长并促进其凋亡。     

靶向抑制KIAA1199基因的表达对人结肠癌细胞SW620生长的影响

目的探讨靶向沉默KIAA1199基因的表达对人结肠癌SW620细胞生长能力的影响。方法运用RNA干扰(shRNA)技术构建携带靶向抑制KIAA1199分子的慢病毒载体LV3-KIAA1199-shRNA并感染人结肠癌细胞株SW620为实验组(shKIAA1199),携带无义序列的对照慢病毒载体LV3-NC-shRNA为阴性对照组(shNC),未转染的细胞为空白对照组(MOCK)。72 h后用荧光显微镜观察慢病毒的感染效率,RT-PCR法验证慢病毒感染后KIAA1199 mRNA在MOCK、shNC和shKIAA1199各组细胞中的表达水平,并用嘌呤霉素筛选KIAA1199静默和阴性对照的稳转细胞。用MTT法检测MOCK、shNC和shKIAA1199各组细胞活力,流式细胞仪分别检测三组细胞的凋亡率和细胞周期的变化。结果携带靶向干扰KIAA1199基因的慢病毒感染人结肠癌细胞株SW620后,能有效下调KIAA1199在细胞内的表达水平并成功筛选KIAA1199静默的SW620稳转细胞;与MOCK和shNC组比较,shKIAA1199组细胞活力减少(P0.05),细胞凋亡率明显升高(P0.05),处于细胞周期中G1期的细胞数量比例明显下降(P0.05),G2/M期细胞比例增加(P0.05)。结论下调KIAA1199基因的表达可抑制SW620细胞的增殖,促进该细胞的凋亡,使该肿瘤细胞的生长周期受到阻滞。     

沉默PHF8重组慢病毒的制备及其对食管鳞癌细胞增生的影响

目的 制备锌指蛋白8（plant homeodomain finger protein 8,PHF8）RNA干扰（RNA interference,RNAi）重组慢病毒（lentivirus）颗粒,建立PHF8表达沉默的人食管鳞癌（esophageal squamous-cell carcinoma,ESCC）稳定细胞系并观察PHF8对细胞增生的影响.方法将目的 基因或阴性对照短发卡RNA（short hairpin RNA,shRNA）载体与包装载体共转染病毒包装细胞293T,收集并浓缩上清液获得重组慢病毒;测定病毒滴度后用于感染食管鳞癌细胞;通过荧光显微镜及流式细胞仪观察感染效率,嘌呤霉素筛选法建立稳定细胞系;定量PCR及Western Blotting检测PHF8的表达沉默;MTS法检测细胞的增生特性.结果成功制备了沉默PHF8的重组慢病毒;应用重组病毒感染食管鳞癌细胞后,PHF8 mRNA 和蛋白的表达水平显著降低,细胞的增生明显下降.结论慢病毒介导的shRNA干扰能有效抑制食管鳞癌细胞的PHF8表达及细胞增生.