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相似文献
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1.
小鼠内皮抑素基因真核表达载体的构建和表达   总被引:4,自引:3,他引:1  
目的 构建小鼠内皮抑素(endostatin)cDNA的真核表达载体并将其在体外培养的脑胶质瘤细胞内表达。方法 将带有分泌信号的小鼠endostatincDNA克隆入真核表达载体pcDNA3,构建CMV启动子控制的载体pcDNA-sEndo,并将上述载体转染体外培养的脑胶质瘤细胞(SHG44),采用WesternBlot鉴定其表达,应艇牛微血管内皮细胞抑制实验检测其活性,结果 成功地构建了真核表达  相似文献   

2.
目的:构建pcDNA3/GDNF真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达.方法:将GDNF逆转录聚合酶链式反应产物克隆至pcDNA3真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以脂质体介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性.结果:酶切鉴定及测序分析表明重组pcDNA3/GDNF表达质粒克隆成功,转染实验表明重组质粒能在真核动物细胞中表达出具有活性的GDNF蛋白.结论:以脂质体介导  相似文献   

3.
构建携带人白细胞介素cDNA的人肝癌特异性闻生转录病毒载体。将HuIL-3cDNA克隆到逆转录病毒载体pMNSM的PL位点,构建SV40早期启动子驱动的载体pMNS-IL-3;从质粒pGEM,7Zf-AFPe中游离人甲胎蛋白增强子核心序列,先克隆 到pMNSM的PL位点上,  相似文献   

4.
重组γ干扰素的表达与纯化   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的 探讨γ干扰素在大肠杆菌中的表达及纯化方法,为下一步批量生产提供实验依据。方法 应用DNA重组技术把中国人淋巴细胞mRNA反转录产物IFN-γcDNA克隆到析核表达质料pBV220上,构建出pBVIFN高效表达载体,转化大肠杆菌plyss。通过温度诱导,高效表达IFN-γ cDNA。然后,经过包涵体溶解、复性、浓缩及DEAE离子交换层析,使γ干扰素纯化。结果 IFN-γ cDNA表达水平占菌体  相似文献   

5.
重组丙型肝炎病毒基因载体的构建与表达   总被引:1,自引:1,他引:0  
应用基因重组技术。从载体CDZ2酶切获得1.73kbDNA片段(含16d93bp的HCV结构区cDNA,其特异性已为southernblot证实)。将HCVcUNA片段插入载体pcDNA3,构建HCV重组体。经在大肠杆菌中表达,筛选、酶切分析,获得重组HCV(PcDNA3-HCV)。以重组质粒转染H9细胞(CD淋巴细胞系),用G418筛选出抗性细胞。经RT-PCR、dot-ELISA验证表明,pcDNA3-HCV能在H9细胞中进行复制、转录和表达。这为丙型肝炎发病机理的研究提供了一个有用模型。  相似文献   

6.
脂质转染剂增强基因疫苗诱导的免疫应答效力   总被引:4,自引:0,他引:4  
目的 研究脂质转染剂(LipofectAMINE)提高丙型肝炎病毒(HCV)核心(C)基因疫苗的抗病毒免疫应答效力。方法 人工构建包含HCV C基因片段的的真核表达载体pcD-NAHCV-C,在证实期可以在真核细胞中表达之后,将期用脂质转剂包裹,形成LipofectAMINE-pcDNAHCV-C脂质混合物,将该混合物或单纯pcDNAHCV-C直接注射BALB/c小鼠股四头肌,以空载体pcDNA  相似文献   

7.
乙肝核心抗原DNA疫苗的构建及其免疫原性分析   总被引:1,自引:0,他引:1  
构建HBV核心抗原DNA疫苗,并探讨基实验动物内的表达及其免疫原性。方法:采用PCR法从HBV全基因DNA中获得核心抗原DNA片段,并将其重组到pcDNA3载体。以此为候选疫苗分别免疫小鼠和树Ju,并检测其抗HBcIgG。结果:构建了乙肝核心抗原候选核酸疫苗pcDNA3-HBc。免疫接种该疫苗后第2周抗HBcIgG水平开始升高,小鼠至第9周,树Ju至第7周升至峰值。结论:构建pcDNA3-HBCd  相似文献   

8.
T载体克隆乙肝病毒preS2+S基因的实验研究   总被引:2,自引:0,他引:2  
将商品化真核表达载体pcDNA3改造成T载体pcDNA3-T,燕运用pcDNA3-T直接克隆也由PCR扩增的adw2亚型乙肝病毒preS2与S基因;结果:pcDN3-T与PCR产物的重组率高达70%。提示:该方法具有简便,省时等特点。  相似文献   

9.
目的:构建多肿瘤抑制基因1(MTS1)的真核表达载体,将其转入人源性卵巢癌细胞株HO-8910中,并得到稳定表达,为进一步研究其对卵巢癌细胞的影响奠定实验基础.方法:利用BamHⅠ与EcoRⅠ从pUC19-p16质粒上切下MTS1cDNA片段并克隆到真核表达载体pcDNA3上,构建成MTS1真核表达载体pcDNA3-p16;利用脂质体(Fu-GENETM6)介导的基因导入法将pcDNA3-p16导入人源性卵巢癌细胞株HO-8910中;采用ABC法对转染后的不同代数细胞进行免疫细胞化学检测,观察p16蛋白的表达.结果:成功构建了MTS1真核表达载体pcDNA3-p16,并进行酶切鉴定;转染后经G418筛选2wk出现阳性克隆8910-p16,并检测到其中有p16蛋白的稳定表达.结论:成功构建MTS1真核表达载体pcDNA3-p16,并可在人源性卵巢癌细胞株HO-8910中得到稳定表达.  相似文献   

10.
将克隆的HCV5‘NCR序列反向插入pSP72的Eco RV切点,构建一种能转录HCV-RNA的质粒pSnc-2。以RT-PCR从抗HEV IgM阳性病人血浆中扩增一段238bp的HCV-cDNA反向插入pSnc-2中克隆的5’NCR序列的NcoI切点,构建插入突变型HCV-cDNA重组体pSnc-e。  相似文献   

11.
目的:构建人白细胞介素18(IL-18)与新城疫病毒(NDV)HN基因嵌合表达质粒。 方法:选用适当的限制性核酸内切酶将NDV的HN基因连接至真核表达质粒pVAX1 IL-18中IL-18基因的尾部,同时替换掉IL-18基因的终止子,构建表达IL-18 HN 嵌合基因的pVAX1 IL-18 HN质粒,经酶切鉴定正确后,通过脂质体介导转染HeLa细胞,应用Western blotting及血凝试验检测其表达情况。 结果:酶切鉴定证实正确地构建了pVAX1 IL-18 HN嵌合表达质粒,Western blotting和血凝试验检测结果表明,嵌合后的IL-18和HN基因均能够表达,且表达的HN蛋白具有较高的血凝活性。 结论:IL-18和HN基因嵌合后不影响二者的表达,而且表达的HN蛋白具有血凝活性。  相似文献   

12.
目的:构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体,并检测其在前列腺癌细胞株(PC-3)中的表达。方法:将目的基因m4-1BBL全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),获得m4-1BBL定向插入重组子pcDNA3.1(+)m4-1BBL,采用限制性内切酶和测序鉴定是否成功构建。用脂质体法将重组质粒转入PC-3细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测m4-1BBL在PC-3中的表达。结果:酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有小鼠4-1BBL全长cDNA编码序列,转染实验表明m4-1BBL基因能在PC-3细胞中表达。结论:小鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在PC-3细胞中的表达均获成功,为进一步研究莫定了基础。  相似文献   

13.
[目的]构建恶性疟原虫海南(FCC1/HN)株p41-3基因真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3;测定p41-3基因序列,并了解FCC1/HN株与其它分离株p41-3序列的差异.[方法]根据p41-3基因已知序列设计合成2对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增p41-3基因;将p41-3基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;用酶切,PCR扩增鉴定筛选到的重组质粒阳性克隆.以正确的重组质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定p41-3基因序列,应用软件辅助分析p41-3序列及进行同源性比较.[结果]PCR扩增得到特异的FCC1/HN株p41-3基因;正确的pcD-NA3-p41-3重组质粒被筛选和鉴定.测序表明,FCC1/HN株p41-3基因大小为2 137 bp,编码375个氨基酸.恶性疟原虫FCC1/HN株与FCBR株p41-3基因核苷酸序列同性为98.98%,编码氨基酸序列同源性为99.73%.[结论]从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中获取p41-3基因,成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3,并测定了FCC1/HN株p41-3基因的序列;FCC1/HN株与其它分离株p41-3基因有高度的同源性.  相似文献   

14.
目的:构建、制备单纯疱疹病毒1型截短糖蛋白B DNA疫苗,检测其诱导机体产生的细胞免疫应答效果。方法:利用PCR技术从HSV-1 SM44毒株基因组中扩增出编码HSV-1 gB14~507氨基酸序列的一段基因。定向插入真核表达质粒pcDNA3载体中,构建出重组真核表达质粒pcDNA3-gBt,并对其进行酶切分析、PCR鉴定及测序鉴定。于BALB/c鼠注射免疫3次,抗体分析CD4+、CD8+T细胞亚群的变化,羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)/碘化丙碇(PI)双标记的流式细胞计数法检测CTL活性。结果:PCR及测序鉴定结果显示,插入的克隆基因与GenBank中HSV-1F株gB基因序列一致,证实了HSV-1 gBt核酸疫苗的构建;pcDNA3-gBt免疫组BALB/c鼠的CD4+T细胞数较空质粒(pcDNA3)对照组和生理盐水对照组增加,CTL活性也较对照组明显增强,但是pcDNA3-gBt免疫组BALB/c鼠的CD8+T细胞、CD4+/ CD8+T细胞比值与对照组比较差异均无显著性(P>0.05)。结论:HSV-1 gBt核酸疫苗诱导较强的细胞免疫应答。  相似文献   

15.
目的克隆人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G(apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalyticpolypeptide 3G,APOBEC3G)基因cDNA,构建APOBEC3G基因的真核表达载体,并在体外进行表达和鉴定。方法采用RT-PCR技术从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因,将该基因插入pcDNA3.1真核表达载体,构建pcDNA3.1-A3G真核表达质粒,并利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-A3G转染HepG2和HL7702细胞,经免疫细胞化学、Western blot等方法检测APOBEC3G真核表达情况。结果双酶切鉴定和测序结果表明,APOBEC3G真核表达载体构建成功。免疫细胞化学和Western blot结果均显示,转染pcDNA3.1-A3G的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白均高表达,转染空质粒pcDNA3.1和未转染的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白低表达或不表达。结论成功构建了人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G,为进一步研究APOBEC3G抗HBV作用奠定实验基础。  相似文献   

16.
贾萌 《中原医刊》2011,(18):50-53
目的 构建AFP启动子介导的HSV/TK重组真核表达载体,并研究其荷瘤效应。方法PCR扩增AFP基因启动子、HSV—TK基因,将上述片断插入EGFP—N1载体的多克隆位点,从而构建甲胎蛋白启动子调控下HSV—TK基因重组表达载体pEGFP—AFP—TK。将其注射移植性H22肝癌模型C57BL/6J小鼠,并设转染空质粒pcDNA3.1组,观察两组的抗肿瘤效应。结果肝癌特异性真核表达载体pEGFP—AFP—TK构建成功,该真核表达载体免疫荷瘤小鼠后,pEGFP—AFP—TK组肿瘤细胞生长受到抑制,且该组生存期长于pcDNA3.1组(P〈0.05)。结论在受试动物体内可有效的诱导特异性抗肿瘤免疫应答。  相似文献   

17.
18.
吴静  樊代明  时永全  苗继延 《医学争鸣》2001,22(10):908-912
目的:构建鼠源性血管抑素agniostatin cDNA真核表达载体,转梁人胃癌细胞株SCG7901,检测蛋白表达,方法:采用定向克隆构建鼠源性血管抑素angiostatin cDNA真核表达载体pcDNA3.1( )-angiostatin,酶切鉴定和测序,彩用脂质体基因转染人胃癌细胞株SCG7901,G418抗性筛选,Western blot检测血管抑素的表达,结果:酶切鉴定和测序证明成功构建了基因序列正确的血管抑素直核表达载体,经G418筛选和Western blot检测得到表达血管抑素的细胞株,结论:真核表达载体pcDNA3.1( )-angilstatin转导的人胃癌细胞肥够表达血管抑素蛋白,在胃癌的血管抑制基因治疗中有潜在临床应用价值。  相似文献   

19.
目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)napA基因真核表达系统,了解其在小鼠肌细胞中的表达情况。方法根据GenBank中HpnapA基因序列(AF227075)和真核表达质粒多克隆位点序列设计引物,以Hp-RNA逆转录产物为模板,扩增HpnapA编码基因,用基因重组技术将目的基因定向克隆到pcDNA3多克隆位点上,转化大肠杆菌,经质粒扩增和DNA测序后,进行小鼠肌肉免疫、目的基因表达水平和抗体水平检测。结果经双酶切、PCR和测序验证,真核表达质粒HpnapA/pcDNA3构建成功。动物实验结果表明:真核重组质粒在小鼠肌细胞内获良好表达,表达产物能刺激机体产生一定效价的抗体。结论成功构建了HpnapA/pcDNA3真核重组表达质粒;用以免疫小鼠,在小鼠肌细胞内获较好表达并具有免疫原性,有用于疫苗研究的潜在价值。  相似文献   

20.
Fibronectin ( FN) is a high- molecular glycopro-tein with multiple- domain.FN fragments containingCell domain are chemotactic to macrophages[1] .CH5 0 polypeptide,a recombinant polypeptide weproduced by the recombination of Cell and Hep domains of human fibronectin and expression in E.coli,can activate macrophages and inhibitthe metas-tasis of tumors[2 -4 ] .To investigate the function ofCH5 0 expressed in vivo by gene transfection,explorethe feasibility of applying the polypeptide to gene…  相似文献   

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